加味二仙丸對支氣管哮喘大鼠鈣離子通道的影響*

楊美瑩，沈 梟，符 艷，王 偉，李 妲，肖雪飛，趙四林

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）是以反復(fù)發(fā)作性喘息、胸悶或咳嗽等為主要臨床表現(xiàn)的一種呼吸道慢性炎癥性疾病[1]。平滑肌收縮、上皮細(xì)胞脫落、黏液分泌過多、氣道炎癥、支氣管高反應(yīng)性和黏膜水腫都是哮喘的潛在病理生理學(xué)因素[2]。被鈣庫操控的鈣離子通道（store-operated calcium channel，SOCC）是胞外鈣離子進入細(xì)胞內(nèi)的重要通道之一，因肌/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲存的鈣離子耗竭從而被激活，其通過鈣離子傳感器基質(zhì)相互作用分子1（stromal Interaction Molecule 1，STIM1）與質(zhì)膜SOCC通信[3-4]。位于細(xì)胞膜上鈣釋放激活鈣通道蛋白1（calcium release-activated calcium channel modulator 1，ORAI1）被認(rèn)為是質(zhì)膜中SOCC的主要成孔亞基，單獨的ORAI蛋白可以形成高度鈣離子選擇性的SOCC通道。鈣釋放激活的SOCC由STIM1和ORAI1蛋白介導(dǎo)，在多種細(xì)胞中形成主要的鈣池操縱的胞外鈣離子內(nèi)流（store-operated calcium entry，SOCE）通路[5-6]。有研究表明SOCE對細(xì)胞的興奮性與收縮性有影響，在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[7-8]。但有關(guān)SOCE在BA病情發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其相關(guān)機制在國內(nèi)外研究不多。加味二仙丸是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院范伏元教授經(jīng)驗方，全方由仙茅、淫羊藿、巴戟天、五味子、蛤蚧組成，具有補肺益腎、納氣定喘之功。臨床上加味二仙丸治療支氣管哮喘每獲良效。因此，本研究建立大鼠哮喘模型，試圖從SOCC探討加味二仙丸治療BA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡健康SPF級雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量（110±10）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物合格證號：430727 211101137434。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級動物房，溫度為24～26 ℃，相對濕度為50%～70%，照明以12 h/12 h明暗交替循環(huán)，自由進食飲水，分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)4～5 d后進行實驗。動物飼養(yǎng)符合湖南省動物實驗管理條例，實驗對動物的各種處理均遵守動物使用及倫理學(xué)規(guī)定。麻醉處死全部實驗大鼠，本實驗已通過本院實驗動物倫理審查（ZYFY20 220513-17）。

1.2 藥物與試劑 加味二仙丸，方藥組成：仙茅30 g，淫羊藿30 g，巴戟天15 g，五味子15 g，蛤蚧粉15 g。總生藥量為105 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供。所有藥材均經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定，按《中華人民共和國藥典》要求制備煎煮液，按含生藥0.945 g/mL配制成加味二仙丸湯劑冷藏備用；固腎定喘丸（批號：Z44020906）購自廣州敬修堂（藥業(yè)）股份有限公司；雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（批號：516V064）購自Solarbio公司；磷酸鹽平衡液（PBS）（批號：023K2321）、氫氧化鋁粉（批號：023A5431）均購自美國Sigma公司；STIM1一抗抗體（批號：10013327）購自美國proteintech公司；ORAI1一抗抗體（批號：35y4419）購自affinity公司；GAPDH鼠單抗（批號：B7401）購自Immunoway公司；蘇木素（批號：ZP7635BP35）、伊紅（批號：ZP6459BP59）、中性樹膠（批號：ZP5247BP47）均購自BOSTER公司；病理組織切片石蠟（批號：062521211105）購自德國萊卡有限公司；雙抗（青鏈霉素）（批號：ST635）、胰酶消化液（批號：P0012B）、Fluo-3AM熒光指示劑（批號：011020211201）均購自碧云天公司；胎牛血清（FBS）（批號：42A0378K）購自美國Gibco公司；山羊血清工作液（批號：20211204）購自百奧萊博公司。

1.3 主要儀器 L3660D型臺式低速離心機（上海知信實驗室儀器技術(shù)有限公司）；RM2016型病理切片機（德國徠卡公司）；DSY2000X型倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器公司）；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；DXFLEX型流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）；WH210型加熱磁力攪拌器（德國WIGGENS公司）；DH-160I型直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海三藤儀器公司）。

1.4 造模與分組 將54只SD大鼠進行編號標(biāo)記，采用隨機數(shù)字表法分成空白組9只，造模組45只。參照文獻[9]的方法，造模組大鼠分別在第1天、第8天、第15天無菌腹腔注射10%卵清蛋白（OVA）溶液1 mL（含100 mg OVA和100 mg氫氧化鋁）致敏，而空白組大鼠用生理鹽水進行腹腔注射；造模組大鼠于第16天起霧化吸入含有1% OVA的生理鹽水1 mL，每次30 min，1次/d，共7 d，以激發(fā)哮喘，而空白組大鼠用生理鹽水進行霧化吸入，吸入時間保持一致。霧化結(jié)束后，空白組隨機選取3只大鼠、造模組隨機選取15只大鼠，取肺組織做病理切片行HE染色。若大鼠出現(xiàn)煩躁、搔鼻、呼吸加快、口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、點頭呼吸及四肢癱軟等表現(xiàn)，且肺組織病理切片HE染色表現(xiàn)為氣道大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜上皮腫脹、成片脫落，部分肺泡間隔增厚，支氣管痙攣等，即證明造模成功[10]。造模成功后將造模組大鼠按隨機數(shù)字表法分成模型組、固腎定喘丸組、加味二仙丸低劑量組、加味二仙丸中劑量組、加味二仙丸高劑量組，每組6只。

1.5 實驗給藥 動物給藥劑量利用大鼠與人臨床用藥劑量、體型系數(shù)公式dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3換算[11]得出，加味二仙丸低、中、高劑量組大鼠灌胃給予加味二仙丸溶液，劑量分別為4.725、9.450、18.900 g/（kg·d)；固腎定喘丸組大鼠灌胃給予固腎定喘丸溶液，劑量為0.540 g/（kg·d)；模型組和空白組大鼠予以等體積的生理鹽水灌胃；每只大鼠灌胃體積為10 mL/kg，2次/d，連續(xù)給藥28 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 HE染色檢測肺組織病理變化 將浸入4%多聚甲醛溶液固定的新鮮肺組織，按先后依次經(jīng)過從低至高濃度的酒精脫水、浸蠟包埋、切片與貼片。將組織切片置于載玻片上，使用試劑盒進行HE染色，封片后置于顯微鏡下觀察肺組織病理變化情況。

1.6.2 免疫組織化學(xué)法檢測STIM1、ORAI1的蛋白表達水平 將肺組織切片放在90 ℃恒溫箱中烘烤、常規(guī)脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)、PBS沖洗，加正常山羊血清工作液（稀釋）封閉。4 ℃孵育一抗（1∶20）12 h，37 ℃孵育二抗0.5 h，沖洗后加DAB顯色液，蘇木精染細(xì)胞核，最后脫水、中性樹膠封片，采用彩色病理圖文分析系統(tǒng)測定STIM1蛋白和ORAI1蛋白陽性細(xì)胞的平均光密度值。

1.6.3 Western blotting法測定STIM1和ORAI1的蛋白相對表達量 常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白；蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜；分別加入GAPDH鼠單抗（1∶5 000）、ORAI1兔多抗（1∶1 000）、STIM1兔多抗（1∶2 000）3種一抗，4 ℃下水平搖床過夜。TBST溶液洗膜，加二抗，室溫孵育2 h；TBST溶液洗膜后經(jīng)ECL底物化學(xué)發(fā)光，暗室膠片顯影。采用Scion Image軟件（Scion Corporation，F(xiàn)rederick）讀取和分析膠片，計算各條帶的平均光密度值。

1.6.4 流式細(xì)胞儀測定鈣離子濃度變化 取肺組織置于15 mL離心管，用眼科剪將組織剪碎至糊狀，加入0.25%胰酶5 mL于37 ℃消化30 min（每隔10 min上下顛倒混勻）。加入5 mL完全培養(yǎng)基終止消化，過100 μm濾網(wǎng)，取細(xì)胞懸液以800 r/min離心10 min得到細(xì)胞沉淀。去掉上清液，加入3 mL紅細(xì)胞裂解液裂解，PBS清洗細(xì)胞2遍后完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞備用。用無血清培養(yǎng)液稀釋（1∶1 000）離子熒光探針（Fluo-3AM）；以上處理的細(xì)胞去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的鈣離子染液，加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜；37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除殘留的染液；用胰酶消化收集；流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料符合正態(tài)分布者以（）表示，不符合正態(tài)分布者用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示。各組間計量資料比較服從正態(tài)分布時，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗；數(shù)據(jù)不服從正態(tài)性分布時，采用Kruskal-WallisH檢驗，進一步兩兩比較采用Nemenyi法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘模型評估及各組大鼠肺組織病理學(xué)改變情況 哮喘模型評估：空白組大鼠無明顯呼吸異常；造模組大鼠在第17～23天均有不同程度的打噴嚏、喘息、呼吸急促、煩躁、搔鼻、口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、點頭呼吸現(xiàn)象。造模組大鼠肺組織HE染色均可見支氣管分支及其周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，或可見較多增生的平滑肌組織，管腔內(nèi)分泌物增多，部分肺泡壁增厚。對照模型評價指標(biāo)，提示造模成功。

行HE染色后，鏡下觀察大鼠肺部組織形態(tài)?？瞻捉M大鼠肺組織及支氣管分支形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠支氣管分支及其周圍有大量以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，尚可見較多增生的平滑肌組織，細(xì)支氣管管腔內(nèi)分泌物增多，部分肺泡壁增厚；加味二仙丸低、中、高劑量組和固腎定喘丸組大鼠可見支氣管分支及其周圍有少量的炎癥細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)分泌物增多，部分肺泡壁增厚；各給藥組大鼠損傷程度介于空白組和模型組之間，且各給藥組損傷程度無明顯差異。（見圖1）

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)（HE，×200）

2.2 各組大鼠肺組織STIM1、ORAI1平均光密度值比較 與空白組比較，模型組大鼠STIM1、ORAI1平均光密度值均明顯升高（P＜0.05），加味二仙丸低劑量組STIM1平均光密度值明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，加味二仙丸高劑量組STIM1、ORAI1平均光密度值均明顯降低（P＜0.05）。（見表1、圖2～3）

表1 各組大鼠肺組織STIM1、ORAI1 平均光密度值比較[M（P25，P75）]

圖2 各組大鼠肺組織STIM1 蛋白表達情況（免疫組化，×20）

圖3 各組大鼠肺組織ORAI1 蛋白表達情況（免疫組化,×20）

2.3 各組大鼠肺組織STIM1和ORAI1蛋白表達水平比較 與空白組比較，模型組、加味二仙丸低劑量組大鼠肺組織STIM1蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，加味二仙丸高劑量組、固腎定喘丸組大鼠肺組織STIM1蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）。與空白組比較，模型組、加味二仙丸低劑量組、加味二仙丸中劑量組、固腎定喘丸組大鼠肺組織ORAI1蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，加味二仙丸低、中、高劑量組和固腎定喘丸組大鼠肺組織ORAI1蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），且加味二仙丸呈劑量依賴性；加味二仙丸高劑量組大鼠肺組織ORAI1蛋白相對表達量明顯低于固腎定喘丸組（P＜0.05）。（見表2～3、圖4）

表2 各組大鼠肺組織STIM1 蛋白相對表達量比較[M（P25，P75）]

表3 各組大鼠肺組織ORAI1 蛋白相對表達量比較（）

表3 各組大鼠肺組織ORAI1 蛋白相對表達量比較（）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與加味二仙丸高劑量組比較，cP＜0.05；與固腎定喘丸組比較，dP＜0.05；與加味二仙丸中劑量組比較，eP＜0.05；與加味二仙丸低劑量組比較，fP＜0.05

圖4 各組大鼠肺組織STIM1、ORAI1蛋白表達Western blotting 圖

2.4 各組大鼠肺組織勻漿中鈣離子濃度變化比較 與空白組比較，模型組、加味二仙丸低劑量組大鼠的鈣離子平均熒光強度值均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，加味二仙丸高劑量組大鼠的鈣離子平均熒光強度值明顯降低（P＜0.05），隨著加味二仙丸不同劑量組的干預(yù)，鈣離子平均熒光強度值均有不同程度的減弱，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠肺組織勻漿中鈣離子平均熒光強度值[M（P25，P75）]

3 討論

哮喘是最常見、最持久的炎癥性氣道疾病，影響全世界10%以上的人口。由于支氣管狹窄、氣道高反應(yīng)性、血管擴張、氣道水腫和感覺神經(jīng)末梢的刺激，呼吸困難、喘息、胸悶和咳嗽反復(fù)發(fā)作[12]。哮喘發(fā)作時，大量炎癥細(xì)胞（如肥大細(xì)胞和樹突細(xì)胞）被激活，同時激活的嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在炎癥部位積聚，氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等結(jié)構(gòu)細(xì)胞釋放促進支氣管炎癥的炎癥介質(zhì)[13]。而在調(diào)節(jié)支氣管相關(guān)肌群收縮功能過程中，鈣離子發(fā)揮著重要作用。因此，在支氣管哮喘中，SOCE可能作為肺組織中鈣離子調(diào)節(jié)的重要機制之一，而STIM1與ORAI1結(jié)合能產(chǎn)生免疫沉淀，此種結(jié)合在鈣庫耗竭時增加，STIM1與ORAI1結(jié)合相互作用是SOCE激活的必需信號[14]。加味二仙丸為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院范伏元教授治療支氣管哮喘緩解期的經(jīng)驗方，全方由仙茅、淫羊藿、巴戟天、五味子、蛤蚧粉組成，具有補腎益肺、納氣定喘之功。前期我們運用加味二仙丸治療支氣管哮喘緩解期患者，發(fā)現(xiàn)加味二仙丸能夠減少哮喘患者血清中IL-4、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白（ECP）的含量，提升患者血清中IFN-γ的水平，減少IgE合成，調(diào)節(jié)支氣管哮喘氣道免疫-炎癥，維持免疫應(yīng)答與免疫損傷動態(tài)平衡，改善支氣管哮喘緩解期患者的肺功能，拮抗炎性介質(zhì)，消除氣道炎癥，且加味二仙丸治療支氣管哮喘具有較好的遠(yuǎn)期療效[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)高劑量加味二仙丸能抑制SOCC重要組成分子STIM1、ORAI1蛋白表達，也能抑制胞外鈣離子內(nèi)流；低、中劑量加味二仙丸能抑制ORAI1的蛋白表達。

SOCC主要是由STIM1和ORAI1組成。STIM1是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）蛋白，在鈣離子動員中起關(guān)鍵作用。由于其作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的鈣離子傳感器，它可以操控鈣離子進入，即SOCE。這是一種鈣離子流入途徑，涉及真核細(xì)胞中的多種信號通路[17]。ORAI1是細(xì)胞膜上SOCC組成的亞單位。STIM1蛋白跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，能夠感知腔內(nèi)鈣離子濃度，進而負(fù)責(zé)傳遞鈣離子信號儲存及消耗情況，將之反饋到質(zhì)膜中的成孔ORAI1蛋白中，STIM1和ORAI1的相互作用調(diào)控鈣離子從細(xì)胞外空間重新進入[18]。有研究已證實STIM1和ORAI1介導(dǎo)SOCE參與許多生理病理反應(yīng)[19]。本實驗運用免疫組織化學(xué)法和Western blotting法檢測肺組織及其周圍組織細(xì)胞中SOCC重要組成分子STIM1和ORAI1的蛋白陽性細(xì)胞數(shù)和表達水平，結(jié)果表明加味二仙丸高劑量組大鼠STIM1、ORAI1平均光密度值和蛋白表達量均明顯低于模型組，加味二仙丸低、中劑量組大鼠ORAI1蛋白表達量均低于模型組，證實加味二仙丸能通過抑制SOCC組成分子的表達，進而抑制SOCE。本實驗利用流式細(xì)胞儀測定各組大鼠肺組織勻漿中的鈣離子平均熒光強度值來反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。加味二仙丸高劑量組大鼠肺組織勻漿中鈣離子濃度明顯低于模型組，表明高劑量加味二仙丸能抑制哮喘大鼠的SOCE，進而影響細(xì)胞的收縮。

據(jù)此，我們認(rèn)為大鼠肺組織勻漿中存在SOCC，高劑量加味二仙丸能抑制STIM1、ORAI1的平均光密度值和蛋白表達，也能抑制胞外鈣離子內(nèi)流；低、中劑量加味二仙丸能抑制ORAI1的蛋白表達。支氣管哮喘以慢性氣道炎癥為特征，因此控制氣道炎癥格外重要。鈣通道在炎癥介質(zhì)細(xì)胞因子的釋放、調(diào)節(jié)氣道支氣管平滑肌的收縮、氣道的重塑等方面作用巨大[20-21]。因此，對氣道鈣通道的研究有助于更深入地了解哮喘氣道炎癥、高反應(yīng)性和重塑的發(fā)生、發(fā)展，為臨床治療哮喘提供一個新的藥物治療靶點和思路。本實驗為加味二仙丸的臨床使用提供了依據(jù)，有助于加味二仙丸的臨床推廣，也為進一步探究此方的其他作用機制奠定了基礎(chǔ)。