天麻酵素的發(fā)酵工藝優(yōu)化與品質(zhì)評(píng)價(jià)

趙 敏，王 瑜，楊 娟，解春芝，李立郎，張朝舉，楊小生

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014；4.徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018）

天麻（Gastrodia elate）又名赤箭、離母等[1]，其味甘、性平[2]，具有鎮(zhèn)靜催眠、平肝息風(fēng)、增強(qiáng)記憶、改善阿爾茲海默癥等[3-5]功能，其藥效成分主要是天麻素（p-hydroxymethylphenyl-β-D-glucopyranoside，GA）、對(duì)羥基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol，HA）[6]，且為2020版《中華人民共和國(guó)藥典》天麻的指標(biāo)成分[7]。其中對(duì)羥基苯甲醇是天麻素的苷元，天麻素經(jīng)微生物作用后會(huì)分解為對(duì)羥基苯甲醇[8]，現(xiàn)代藥理顯示其在失眠、阿爾茲海默癥、抑郁、認(rèn)知障礙等方面有顯著療效[9]。顏漢文等[10]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯甲醇對(duì)MCAO/R模型大鼠血腦屏障的保護(hù)作用研究，蔣石等[11]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯甲醇對(duì)急性腦缺血損傷大鼠具有一定的改善作用，所以對(duì)羥基苯甲醇是天麻中的功能性成分。天麻是我國(guó)著名的藥食同源藥材[12]，以其為原料生產(chǎn)加工的功能性產(chǎn)品逐漸受到關(guān)注。目前，我國(guó)的天麻以鮮食和天麻粉等初級(jí)加工產(chǎn)品為主，尚缺乏天麻的精深加工產(chǎn)品。食用植物酵素（edible plant source Jiaosu）以植物為原料，是經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分（多糖類、寡糖類、蛋白質(zhì)及多肽、氨基酸類、維生素類等）的可食用的酵素產(chǎn)品[13]。有研究表明，酵素具有美容養(yǎng)顏、降脂、解酒、促進(jìn)消化等[14-15]功效，而藥食兩用植物酵素兼具食藥兩用特點(diǎn)，含有功效酶、多酚、有機(jī)酸、多糖等多種活性成分，能降低活性氧引起的機(jī)體傷害，增強(qiáng)人體免疫力[16]。朱德艷[17]采用藥食兩用資源葛根制備葛根酵素，經(jīng)發(fā)酵后的葛根酵素黃酮含量增加、更易于人體吸收。目前，國(guó)內(nèi)外研究主要關(guān)注于天麻的藥理作用，對(duì)天麻酵素的研究少有報(bào)道。

因此，該實(shí)驗(yàn)以干天麻粉為原料，研究發(fā)酵劑用量、糖添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量的影響，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并探究酵素化處理對(duì)天麻中功能性物質(zhì)、抗氧化活性的影響，為天麻酵素這種新型功能性產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用提供技術(shù)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天麻粉：德江縣綠通天麻發(fā)展有限公司；白砂糖：市售；發(fā)酵菌種（酵母菌∶乳酸菌∶醋酸菌=1∶1∶1）：貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；甲醇（色譜純）：安徽人地高純?nèi)軇┯邢薰?；乙醇（分析純）：天津富宇精?xì)化工有限公司；苯酚、濃硫酸、磺基水楊酸、磷酸（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；蘆丁、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）、福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH）自由基清除率、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司；VICTOR Nivo酶標(biāo)儀：珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司；YH-A20002型電子天平：瑞安市英衡電器有限公司；SPX-100生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；TG-18W高速離心機(jī)：濟(jì)南愛來寶醫(yī)療科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 天麻酵素發(fā)酵工藝流程與操作要點(diǎn)

天麻粉→溶解→熟化→酶解→接種→發(fā)酵→過濾→酵素成品

溶解：稱取一定量的天麻粉，按照料液比1∶20（g∶mL）加水溶解。

熟化：將溶解后的天麻液加熱煮沸15 min，再添加一定質(zhì)量的白砂糖，攪拌使白砂糖完全溶化。

酶解：待溫度降至50～60 ℃時(shí)，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03%的纖維素酶。

接種：待溫度降至30～40 ℃時(shí)，最后添加一定量的發(fā)酵劑，期間每10 min振蕩一次，至產(chǎn)生大量氣泡即可。

發(fā)酵：混合均勻后置于恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，以保鮮膜密封，用橡皮圈扎緊。

過濾：將天麻酵素用過200目濾網(wǎng)將濾渣和酵素液分離開來，即得到天麻酵素樣品。

1.3.2 天麻酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

選取發(fā)酵劑的用量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%），糖添加量（5%、7%、9%、11%、13%），發(fā)酵時(shí)間（7 d、14 d、21 d、28 d、35 d），發(fā)酵溫度（26 ℃、29 ℃、32 ℃、35 ℃、38 ℃）4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察以上因素單獨(dú)變化時(shí)對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量的影響。

1.3.3 天麻酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以發(fā)酵劑用量（A）、糖添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）為自變量，以對(duì)羥基苯甲醇的含量（Y）作為響應(yīng)值，通過建立回歸方程確定天麻酵素發(fā)酵的最佳工藝條件，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 天麻酵素發(fā)酵條件工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test for Gastrodia elata Jiaosu fermentation process optimization

1.3.4 對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛含量的測(cè)定[18]

采用高效液相色譜法測(cè)定對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛含量。

高效液相色譜條件：Syncronis C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；流動(dòng)相A為0.05%磷酸水溶液（體積分?jǐn)?shù)，下同），B為甲醇。梯度洗脫程序：0～10 min，B為10%；10～15 min，B 由10%升 至15%；15～20 min，B 由15%升 至20%；20～30 min，B由20%升至40%；30～40 min，B由40%升至50%。

樣品的處理：取2 mL樣品10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm水系濾膜上機(jī)待測(cè)。最后將各種物質(zhì)的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線（對(duì)羥基苯甲醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=2 905.7X+34.232，R2=0.999 8；對(duì)羥基苯甲醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=7 145X+77.17，R2=0.999 7），得到對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛的含量。

1.3.5 理化指標(biāo)檢測(cè)

pH采用pH計(jì)進(jìn)行檢測(cè)；酒精度參照國(guó)標(biāo)GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》的酒精計(jì)法測(cè)定；多糖采用苯酚-硫酸法[19]進(jìn)行測(cè)定；抗氧化指標(biāo)DPPH自由基清除率、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）的測(cè)定參照試劑盒的測(cè)定方法[20]。

游離氨基酸和γ-氨基丁酸的測(cè)定：采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確稱取1.022 g磺基水楊酸至100 mL容量瓶中并定容，配制成1%的磺基水楊酸溶液；取不同樣品1 mL分別加入9 mL磺基水楊酸溶液，振蕩均勻，10 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019和Design Expert V8.0.6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Origin 9.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵劑用量對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量的影響

由圖1可知，發(fā)酵劑用量過少時(shí)，菌種繁殖速度緩慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，此時(shí)對(duì)羥基苯甲醇的含量較低，酵素渾濁，隨著發(fā)酵劑用量的增加，含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵劑用量為0.3%時(shí)，對(duì)羥基苯甲醇的含量達(dá)到最高為0.51 g/L，此時(shí)酵素呈現(xiàn)橙紅色，體系澄清透明。而當(dāng)發(fā)酵劑的用量過大時(shí)，體系的酸度增加，反而會(huì)抑制菌種的增殖，用于轉(zhuǎn)換對(duì)羥基苯甲醇的菌種會(huì)相應(yīng)減少[21]，且發(fā)酵劑的用量過多會(huì)導(dǎo)致天麻酵素中酵母味過重，影響酵素的品質(zhì)[22]。因此，選取0.3%的發(fā)酵劑用量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 發(fā)酵劑用量對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量的影響Fig.1 Effect of starter culture addition on p-hydroxybenzyl alcohol contents in Gastrodia elata Jiaosu

2.1.2 糖添加量對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量的影響

由圖2可知，當(dāng)白砂糖添加量為5%～7%時(shí)，由于糖度不足，無法為微生物的生長(zhǎng)提供足夠的碳源，微生物的生長(zhǎng)代謝速率降低，菌種的增殖受到抑制，天麻素分解成對(duì)羥基苯甲醇的速率降低[23]，當(dāng)糖度過低時(shí)，酵素口感酸澀、滋味較差。當(dāng)白砂糖添加量為11%，對(duì)羥基苯甲醇的含量達(dá)到最高為0.51 g/L，此時(shí)酵素的酸甜適宜、苦澀味淡薄，當(dāng)白砂糖添加量為13%時(shí)，糖分過高，易形成高滲透壓環(huán)境，微生物長(zhǎng)期處于高滲環(huán)境容易衰老[24]，影響對(duì)羥基苯甲醇的含量，且過甜會(huì)影響酵素的口感。說明此時(shí)的白砂糖添加量最佳，可選糖添加量為11%進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2 糖添加量對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量的影響Fig.2 Effect of sugar addition on p-hydroxybenzyl alcohol contents in Gastrodia elata Jiaosu

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量的影響

發(fā)酵溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)具有重要作用。由圖3可知，發(fā)酵溫度在26～32 ℃時(shí)，微生物生長(zhǎng)緩慢，可能造成不完全發(fā)酵[25]，對(duì)羥基苯甲醇的含量較低，此時(shí)酵素渾濁、澀味明顯、酸甜不協(xié)調(diào)，當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)，對(duì)羥基苯甲醇的含量達(dá)到最高為0.54 g/L，而當(dāng)發(fā)酵溫度為38 ℃時(shí)，微生物由于長(zhǎng)期處于過高的溫度環(huán)境導(dǎo)致菌種死亡。說明35 ℃是菌種發(fā)酵的最佳溫度，此時(shí)酵素香氣濃郁、口感協(xié)調(diào)。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on p-hydroxybenzyl alcohol contents in Gastrodia elata Jiaosu

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)羥基苯甲醇的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵14 d時(shí)對(duì)羥基苯甲醇的含量達(dá)到最高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間低于14 d時(shí)，天麻酵素渾濁不澄清、苦澀味明顯、滋味不協(xié)調(diào)、香氣淡??；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在14～28 d時(shí)，酵母生長(zhǎng)旺盛，代謝能力增強(qiáng)，轉(zhuǎn)換對(duì)羥基苯甲醇的速率增長(zhǎng)較快；發(fā)酵時(shí)間超過35 d時(shí)，由于菌體開始出現(xiàn)衰亡自溶，口感會(huì)呈現(xiàn)出苦味，滋味不協(xié)調(diào)。而采用發(fā)酵法制備酵素，在一定程度上，酵素口感較為適宜的條件下，其發(fā)酵時(shí)間越短越好[26]，所以選用發(fā)酵14 d為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on p-hydroxybenzyl alcohol contents in Gastrodia elata Jiaosu

2.2 天麻酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，回歸方程方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到各個(gè)因素對(duì)對(duì)羥基苯甲醇的二次回歸方程：Y=0.7-0.013A-6.000E-003B+0.21C-0.023D-0.052AB+3.000E-003AC-0.013AD-7.000E-003BC-0.020BD-0.026CD-0.1A2-0.065B2-0.073C2-0.084D2。

由表3可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），模型的決定系數(shù)R2=95.84%，表明試驗(yàn)結(jié)果與模型擬合度良好，可用該模型推測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。從F值可看出，影響對(duì)羥基苯甲醇含量的各因素主次為發(fā)酵時(shí)間（D）＞發(fā)酵溫度（C）＞發(fā)酵劑用量（A）＞糖添加量（B）。再觀察各響應(yīng)值P值變化，從P值可知，一次項(xiàng)A、C、D及交互項(xiàng)CD對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)天麻酵素中的對(duì)羥基苯甲醇的含量有極顯著的影響（P＜0.01），交互項(xiàng)AB、CD對(duì)其有顯著影響（P＜0.05）。

2.2.2 響應(yīng)面中各因素交互作用對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量的影響

由圖5可知，糖添加量與發(fā)酵劑的曲線最陡峭，等高線呈橢圓形，說明這二者的交互作用對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇的含量影響最顯著（P＜0.05），其次是發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度對(duì)對(duì)羥基苯甲醇的影響顯著（P＜0.05），而糖添加量與發(fā)酵溫度、發(fā)酵溫度與發(fā)酵劑用量、發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵劑用量、糖添加量與發(fā)酵時(shí)間的響應(yīng)面圖較為平緩，且呈圓形，說明這四者的交互作用對(duì)對(duì)羥基苯甲醇的含量影響不顯著（P＞0.05），這與表3的結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對(duì)天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the p-hydroxybenzyl alcohol content in Gastrodia elata Jiaosu

2.2.3 回歸模型驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)得到的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵劑用量0.29%、糖添加量10.98%、發(fā)酵溫度35.52 ℃、發(fā)酵時(shí)間12.89 d。根據(jù)試驗(yàn)實(shí)際操作條件，得到發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵劑用量0.3%、糖添加量11%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間14 d，在此最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇的平均含量可達(dá)0.69 g/L，與回歸方程的預(yù)測(cè)值0.71 g/L相近，說明該模型能很好的預(yù)測(cè)天麻酵素發(fā)酵工藝與對(duì)羥基苯甲醇含量的關(guān)系。

2.3 天麻酵素產(chǎn)品指標(biāo)

天麻酵素產(chǎn)品的各品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表4。由表4可知，最佳發(fā)酵工藝獲得的天麻酵素各指標(biāo)均符合QB/T 5332—2018《植物酵素》中關(guān)于食用植物酵素的標(biāo)準(zhǔn)。其中天麻酵素中粗多糖、游離氨基酸相比于未發(fā)酵的天麻汁分別下降71.57%、74.60%，這可能是由于發(fā)酵前期酵母菌利用糖類和氨基酸進(jìn)行無氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化為酒精以及氨基酸自身的氧化降解，導(dǎo)致氨基酸與多糖含量降低[27]。γ-氨基丁酸、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛是未發(fā)酵的天麻汁的3.25倍、1.8倍、23倍，抗氧化指標(biāo)DPPH自由基清除率、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）分別上升了26.68%、14.69%、77.19%，說明天麻經(jīng)酵素化處理后，功能性物質(zhì)在微生物的作用下大量溶出，天麻酵素中DPPH自由基清除率、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）提升可能與功能性物質(zhì)含量的升高有關(guān)[28]。

表4 天麻酵素各品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of some indexes of Gastrodia elata Jiaosu

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)并結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化天麻酵素發(fā)酵條件，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵劑用量0.3%、糖添加量11%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間14 d。在此最佳發(fā)酵條件下得到天麻酵素中對(duì)羥基苯甲醇的平均含量可達(dá)0.69 g/L，此時(shí)的天麻酵素呈橙紅色、體系澄清、香氣濃郁、酸甜味協(xié)調(diào)。相比于未發(fā)酵天麻汁，天麻酵素的功能性物質(zhì)γ-氨基丁酸、對(duì)羥基苯甲醇、對(duì)羥基苯甲醛分別增加了3.25倍、1.8倍、23倍，抗氧化指標(biāo)DPPH自由基清除率、超氧化物歧化酶（SOD）活力、總抗氧化能力（T-AOC）分別上升了26.68%、14.69%、77.19%。后期將進(jìn)一步采用動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)研究天麻酵素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄊ甙Y、阿爾茲海默癥）的作用，系統(tǒng)性闡述其對(duì)神經(jīng)藥理活性的作用機(jī)制，為研發(fā)神經(jīng)類疾病藥物、功能性食品奠定基礎(chǔ)。