激素抵抗性腎病相關(guān)基因變異在早年發(fā)病的難治性腎小球微小病變中的表達(dá)

楊旭，劉鳳東，欒軍軍，周華

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004；2.東北大學(xué)醫(yī)院護(hù)理部，沈陽(yáng) 110004）

腎小球微小病變（minimal change disease，MCD）是兒童中最常見(jiàn)的腎病綜合征的病理類型，在成人腎病綜合征中占10%～15%［1］。盡管絕大多數(shù)的MCD對(duì)激素反應(yīng)敏感，但難治性腎病的病例也不少見(jiàn)。由于需要長(zhǎng)期應(yīng)用激素和（或）免疫抑制劑控制病情，患者可能出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如感染、股骨頭壞死等，并且少數(shù)患者治療無(wú)效，腎功能進(jìn)行性惡化，最終可能需要進(jìn)行腎臟替代治療，甚至死亡［2］。因此，明確難治性MCD的病因和發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)、進(jìn)行針對(duì)性治療、提高腎病綜合征的治愈率、減少?gòu)?fù)發(fā)率是有待解決的難題。

近年來(lái)，隨著越來(lái)越多的激素抵抗性腎?。╯teroid-resistance nephrotic syndrome，SRNS）相關(guān)基因變異的發(fā)現(xiàn)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注遺傳因素在難治性腎病中的作用［3］。兒童和青少年中，SRNS相關(guān)基因變異最常見(jiàn)于局灶性節(jié)段性腎小球硬化（focal segmental glomerulonephrosis，F(xiàn)SGS），而SRNS相關(guān)基因變異在難治性MCD患者中的研究很少。MCD多發(fā)于兒童，兒童時(shí)期是遺傳性疾病的好發(fā)年齡；同時(shí)，MCD與FSGS有一定聯(lián)系，有學(xué)者認(rèn)為MCD與FSGS可能是同一種疾病的不同階段［4］?；谝陨蟽牲c(diǎn)推測(cè)，遺傳因素可能參與早年發(fā)病的難治性MCD的發(fā)病。因此，本研究選取30歲之前發(fā)病、病理類型表現(xiàn)為MCD的難治性腎病患者，采用高通量二代測(cè)序方法檢測(cè)患者是否存在SRNS相關(guān)基因變異，初步探索遺傳因素在難治性MCD發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月至2018年6月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腎內(nèi)科收治發(fā)病年齡＜30歲、病理類型為MCD的難治性腎病患者7例。選取同期病理類型為FSGS的腎病患者2例（陽(yáng)性對(duì)照）和年齡匹配的健康人3例。12例研究對(duì)象中，男11例，女1例。

入選患者均符合原發(fā)性腎病綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)，MCD患者均為激素依賴或反復(fù)復(fù)發(fā)型腎病，符合難治性腎病的定義。排除繼發(fā)性腎病綜合征患者，包括狼瘡性腎炎、乙型肝炎相關(guān)性腎病、紫癜性腎炎等；排除合并病毒性肝炎、原發(fā)性高血壓、糖尿病、遺傳性疾病、癲癇、血液系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤患者。本研究獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2017PS012K），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本收集與處理

留取研究對(duì)象外周EDTA抗凝靜脈血5 mL，同樣方法留取患者父母外周靜脈血5 mL。采用NaI法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因檢測(cè)

采用北京邁基諾公司提供的與遺傳性腎小球病相關(guān)的74種基因組成目標(biāo)基因penal，其中包括62個(gè)SRNS相關(guān)基因。利用高通量二代測(cè)序方法檢測(cè)研究對(duì)象是否存在目標(biāo)基因的變異，然后利用第一代Sanger基因測(cè)序技術(shù)對(duì)父母的基因進(jìn)行驗(yàn)證，從而確定患者基因變異的來(lái)源。

74種基因包括ACTN4、MYO1E、COQ9、SLC35A2、ARHGDIA、PAX2、GLA、ZMPSTE24、ALG1、NEIL1、CRB2、SMARCAL1、B2M、PDSS1、INF2、LAMC2、ANLN、NEK8、CUBN、THSD7A、CD151、PDSS2、ITGA3、LMX1B、APOA1、NPHP3、DGKE、TRPC6、CD2AP、PEX1、ITGB4、COL4A4、APOE、NPHS1、EMP2、TSC2、CFH、PLA2R1、KANK1、APOL1、NPHS2、FAT1、UMOD、COL4A3、PLCE1、KANK2、ARHGAP24、NUP107、FGA、WDR73、COL4A4、PMM2、KANK4、COQ6、NUP205、FLG、WT1、COL4A5、PTPRO、LAMA3、COQ8A、NUP93、FN1、XPO5、COQ2、SCARB2、LAMB2、COQ8B、SLC17A5、LAMB3、LYZ、MEFV、MYH9、MME。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基本特征

本研究共納入7例難治性MCD患者，2例初治的FSGS患者，3例健康人。同時(shí)收集到4例MCD患者父母的樣本。7例MCD患者中，幼年發(fā)病（發(fā)病年齡＜14周歲）3例，中位年齡25歲，均為男性；成人發(fā)病（發(fā)病年齡14～30周歲）4例，中位年齡26.5歲，均為男性。2例FSGS患者，中位年齡20歲，男1例，女1例。3例健康人，中位年齡26歲，均為男性。

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果

7例難治性MCD患者中發(fā)現(xiàn)1例SRNS相關(guān)基因變異，為成人發(fā)病的MCD患者（6號(hào)）。分析該患者樣本，發(fā)現(xiàn)胞環(huán)蛋白肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ANLN）基因有1個(gè)雜合突變，遺傳方式是常染色體顯性遺傳，經(jīng)家系驗(yàn)證分析，變異來(lái)自患者母親。該患者同時(shí)發(fā)生了地中海熱（MEFV）基因純合突變，經(jīng)家系驗(yàn)證分析，其父母在該位點(diǎn)均為雜合突變，但這個(gè)基因不屬于已知的SRNS相關(guān)基因。FSGS患者（8號(hào)）中也發(fā)現(xiàn)1例SRNS相關(guān)基因變異，是瞬時(shí)受體電位通道6（TRPC6）基因的1個(gè)雜合突變，遺傳方式為常染色體顯性遺傳。健康人中未發(fā)現(xiàn)有意義的SRNS相關(guān)基因變異。見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象的一般資料和基因檢測(cè)結(jié)果

在幼年發(fā)病的MCD患者中發(fā)現(xiàn)LAMB2（100%，3/3）和PLCE1（67.7%，2/3）雜合突變的發(fā)病率明顯升高，而在成人發(fā)病的MCD患者和FSGS患者中未發(fā)現(xiàn)這2種基因突變。健康人中僅有1例LAMB2突變。這些基因突變的位點(diǎn)各不相同。

3 討論

本研究利用高通量二代測(cè)序方法，對(duì)30歲之前發(fā)病的難治性MCD患者SRNS相關(guān)基因位點(diǎn)的變異情況進(jìn)行了初步研究，在1例成人發(fā)病的MCD患者中發(fā)現(xiàn)了ANLN雜合突變，該患者同時(shí)發(fā)現(xiàn)MEFV純合突變。在3例幼年發(fā)病的MCD患者中，發(fā)現(xiàn)了極高比例的LAMB2和PLCE1雜合突變，提示遺傳因素可能參與難治性MCD的發(fā)病。但由于本研究納入的病例數(shù)較少，需要納入更多病例的研究證明這一結(jié)論。

ANLN編碼的anillin是F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在腎臟的腎小管普遍表達(dá)，在腎小球表達(dá)很少，2014年首次在一個(gè)常染色體顯性遺傳的FSGS引起的腎病綜合征家系中，確定了ANLN變異是引起家族性FSGS腎病綜合征的病因。家族性FSGS腎病綜合征中足細(xì)胞中anillin的表達(dá)增加。功能研究［5］結(jié)果表明，anillin對(duì)于保持足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的完整性發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步的研究［6］顯示，ANLNR431C變異可以通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR/p70S6K/Rac1通路引起足細(xì)胞功能的多重紊亂，而鈣調(diào)神經(jīng)酶抑制劑可能部分通過(guò)抑制ANLN和mTOR發(fā)揮減少尿蛋白的作用。本研究在成人發(fā)病的MCD患者中也發(fā)現(xiàn)了該基因變異，患者為激素依賴性腎病，經(jīng)過(guò)超長(zhǎng)程的激素聯(lián)合霉酚酸酯治療，目前患者病情緩解。這例MCD患者中還發(fā)現(xiàn)了MEFV基因純合突變。MEFV基因突變主要與家族性地中海熱有關(guān)［7］，但該患者并無(wú)發(fā)熱、漿膜炎等自身炎癥綜合征的表現(xiàn)。有研究［8］證實(shí)了家族性地中海熱患者也可以合并其他類型的腎臟損害，如血管炎、紫癜性腎炎、急進(jìn)性腎炎和原發(fā)性腎炎。土耳其學(xué)者發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性腎小球腎炎合并MEFV變異的比率高達(dá)35.9%［9］。MEFV的編碼蛋白pyrin是固有免疫的一種重要的調(diào)節(jié)劑，它是組成炎癥小體的重要成分，可以導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，其中研究最多的是細(xì)胞質(zhì)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體［10］。目前的研究［11］發(fā)現(xiàn)，NLRP3的激活與足細(xì)胞損傷密切相關(guān)，參與多種腎臟疾病的發(fā)病，針對(duì)NLRP3及其組成成分的小分子抑制劑是很有前途的治療劑。MEFV基因突變導(dǎo)致pyrin功能損害，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，是引起家族性地中海熱的主要病因［12］。這種過(guò)度的炎癥反應(yīng)很可能促進(jìn)了免疫介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，產(chǎn)生蛋白尿。在另一例成人發(fā)病的MCD患者中發(fā)現(xiàn)了MEFV基因在同一位點(diǎn)的變異，對(duì)于這個(gè)變異位點(diǎn)編碼蛋白的功能研究有助于進(jìn)一步明確MEFV基因變異在難治性MCD發(fā)病中的作用。

先天性腎病綜合征最常見(jiàn)的致病基因包括NPHS1、NPHS2、WT1、LAMB2和PLCE1［13］。本研究在3例幼年發(fā)病的MCD患者中發(fā)現(xiàn)了極高比例的LAMB2和PLCE1雜合突變，與成人發(fā)病的MCD患者的基因變異明顯不同。因此推斷，多種先天性腎病綜合征相關(guān)基因的微基因效應(yīng)可能存在于幼年發(fā)病的難治性MCD患者中，未來(lái)研究需要納入更多的病例證明這一點(diǎn)。

本研究在1例男性FSGS患者中發(fā)現(xiàn)TRPC6雜合突變，這是目前發(fā)現(xiàn)的成人發(fā)病的常染色體顯性遺傳SRNS相關(guān)的基因突變之一。TRPC6是足細(xì)胞裂孔膜的重要成分，其變異被認(rèn)為與nephrin減少有關(guān)［14］。目前共有31例伴有TRPC6變異的兒童或青少年發(fā)病的難治性腎病的病例報(bào)告，其中包括2例MCD患者［15］。本研究在1例成人發(fā)病MCD患者中發(fā)現(xiàn)SRNS相關(guān)基因變異，在其余3例成人發(fā)病MCD患者和1例女性FSGS患者中也發(fā)現(xiàn)了1種及以上常染色體隱性遺傳遺傳的SRNS相關(guān)基因的雜合突變，但理論上必須是純合基因突變才致病；更重要的是，在3例健康人中也發(fā)現(xiàn)多種常染色體隱性遺傳SRNS相關(guān)基因的雜合突變，因此不能推斷這些基因變異是與難治性腎病相關(guān)的致病性突變。

綜上所述，本研究初步探討了遺傳因素是否參與了早年發(fā)病的難治性MCD的發(fā)病，并在7例患者中發(fā)現(xiàn)SRNS相關(guān)基因變異。但本研究存在不足之處：納入的病例數(shù)少，未進(jìn)行功能試驗(yàn)。目前還有新的SRNS相關(guān)基因被不斷發(fā)現(xiàn)，因此通過(guò)進(jìn)一步增加樣本量、擴(kuò)大檢測(cè)范圍及運(yùn)用全基因組檢測(cè)方法，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的基因變異，甚至是全新的基因。這有望揭示難治性MCD的發(fā)病機(jī)制，避免激素和免疫抑制劑的過(guò)度應(yīng)用，同時(shí)可能為難治性MCD的治療提供新的靶標(biāo)。