腫瘤新抗原肽誘導(dǎo)獻(xiàn)血者PBMC特異反應(yīng)性T細(xì)胞*

楊穎 路麗明 李勤 郭忠慧 楊啟修 張嘉敏 趙俸涌 王晨 朱自嚴(yán)

T細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞免疫治療[1]目前已被證實(shí)可用于治療實(shí)體腫瘤[2]和血液腫瘤[3]，如CAR-T（chimeric antigen receptor-T）治療[4-7]、抗PD-1[8-9]等，而利用腫瘤新抗原制備特異T細(xì)胞，并加以回輸也可緩解腫瘤黑色素瘤生長(zhǎng)以及胸腺瘤等[10-12]等。而以上治療大多數(shù)基于自體T細(xì)胞的改造和加工，受限于腫瘤患者疾病狀態(tài)，如腫瘤患者無(wú)法耐受大量采血，或自身免疫細(xì)胞已被腫瘤負(fù)載所耗竭[13]，可能無(wú)法進(jìn)行這種治療。針對(duì)以上問(wèn)題，本研究使用來(lái)自于健康獻(xiàn)血者的PBMC作為制備原料，用腫瘤患者來(lái)源的腫瘤組織，先制備獲得腫瘤細(xì)胞，再測(cè)序獲得新抗原序列，然后人工合成這些抗原肽，在體外利用健康獻(xiàn)血者的PBMC在誘導(dǎo)DC后裝載抗原肽，進(jìn)而刺激PBMC中的PBL，使其增殖分化為針對(duì)腫瘤新抗原特異反應(yīng)性T細(xì)胞[14]，期望以上T細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞毒作用而起到殺瘤效果。

材料與方法

1實(shí)驗(yàn)材料與儀器 24孔COSTAR細(xì)胞培養(yǎng)板（批號(hào)16218055，美國(guó)Corning公司）96孔COSTAR細(xì)胞培養(yǎng)板（批號(hào)16221601，美國(guó)Corning公司），75cm2培養(yǎng)瓶（批號(hào)30420601，美國(guó)Corning公司），完全培養(yǎng)劑含RPMI1640（批號(hào)05118006，美國(guó)Corning公司）90%、10% FBS（批號(hào)35081002，美國(guó)Corning公司）、青霉素10 IU/mL、10 μg/mL鏈霉素，細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；GMCSF（批號(hào)111930、011830，工作濃度為0.1 μg/μL，10 μL，美國(guó)Peprotech公司）；IL-4（批號(hào)051914、041814，工作濃度0.1 μg/μL，10 μL，美國(guó)Peprotech公司）；IL-2（批號(hào)091912，工作濃度40 IU/μL，美國(guó)Peprotech公司）。RayBio human IFN -gamma ELISA kit（批號(hào)：0506220131，0212210131，美國(guó)RayBiotech公司）；BFA/Monensin Mixture（250×，布雷非德菌素A/莫能霉素混合物，聯(lián)科生物，70-CS1002），BFA（批號(hào)M2294-03，AbMole中國(guó)），Ionomycin（批號(hào)5608212，美國(guó)Biogems公司），PHA（植物血凝素，批號(hào)SLBZ9469，美國(guó)Sigma公司），LPS（脂多糖，批號(hào)L4130，美國(guó)Sigma公司），破膜固定劑（批號(hào)GAS003/2，聯(lián)科生物）；Fc block（MTG-001，批號(hào)10，MBL公司）；DNA抽提試劑（血液基因組DNA提取試劑盒，上海天根公司）；流式抗體見(jiàn)表1。5% CO2培養(yǎng)箱（三洋MCO-18AC，日本松下公司）；流式細(xì)胞儀（FACSVerse，美國(guó)BD公司；CytoFLEX，美國(guó)貝克曼庫(kù)尓特公司）；化學(xué)發(fā)光儀（SpectraMax i3X，美國(guó)Molecuar Devices）。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用流式標(biāo)記抗體

腫瘤抗原肽（LM1-LM11，LM13-LM14）委托上海生工合成并分裝為1 mg/支，腫瘤抗原肽NSLC、NSLC-Cl、NSLC-st[12]委托南京金斯瑞公司合成并分裝為1 mg/支。

2單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）制備及定向誘導(dǎo)DC細(xì)胞 當(dāng)日采集的隨機(jī)健康獻(xiàn)血者富含白細(xì)胞的白膜血，用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心分離，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定后，用1640重懸后加入75 cm2培養(yǎng)瓶，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱靜置數(shù)小時(shí)，然后用1640吹打2遍后，收集不貼壁細(xì)胞，于37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，次日凍存于-80℃冰箱作為PBL；75 cm2培養(yǎng)瓶中剩余貼壁細(xì)胞則加入完全細(xì)胞培養(yǎng)劑，并加入GM-CSF、IL-4各10 μL（0.1 μg/μL），于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，用于誘導(dǎo)DC，每三天進(jìn)行半量換液，并加入GM-CSF、IL-4同前，Day 5加LPS；Day 6復(fù)蘇PBL備用；Day 7收集DC細(xì)胞，計(jì)數(shù)并用1640調(diào)整DC細(xì)胞為0.5×105～1×105/mL，接種于24孔板，每孔0.5～1 mL，共20孔，4孔留待備用PBL孔，剩余的DC用流式進(jìn)行DC特征分析。如果用96孔細(xì)胞板代替24孔板，則所有試劑和細(xì)胞均用原來(lái)的1/5體系，所有孔均設(shè)置復(fù)孔，操作均與24孔板相同，不再另外贅述。

3DC細(xì)胞裝載腫瘤抗原肽并誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化為腫瘤抗原肽特異T細(xì)胞 在上述已分裝好DC的24孔板中每孔加入一種腫瘤抗原肽10 μL（2 μg/μL）作為實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)置無(wú)肽孔、單獨(dú)PBL孔各4孔，分別用于基準(zhǔn)對(duì)照組、以及備用加PHA作為陽(yáng)性刺激對(duì)照組，視細(xì)胞數(shù)量，對(duì)照組復(fù)孔數(shù)可調(diào)整，一般不得少于2孔，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育5 h，取出復(fù)蘇12 h以上的PBL，調(diào)整為DC的 4～10倍細(xì)胞密度，每孔加入等體積PBL，繼續(xù)于37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48～72 h后加入IL-2，終濃度為20～40 IU/mL，每三天進(jìn)行半量換液，并補(bǔ)充IL-2。Day14加入腫瘤抗原肽，劑量同前；Day 21則用達(dá)科為無(wú)血清培養(yǎng)基0.5 mL重懸細(xì)胞，再加入腫瘤抗原肽，劑量同前，單獨(dú)PBL孔加PHA 作為陽(yáng)性對(duì)照孔，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，16 h后加入BFA/Monensin 各2 μL，或BFA（0.5 mg/mL）/Ionomycin（50 μg/mL）各2 μL，繼續(xù)37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后取出，留取上清液100～200 μL/孔。

4腫瘤抗原肽特異T細(xì)胞反應(yīng)性 上述24孔細(xì)胞板每孔分別加入Fc block 2 μL，并各取4孔（使用單獨(dú)PBL孔、無(wú)肽孔）分別用于不染、FITC、APC、PE單染，室溫20 min后加入FITC-CD3APC-CD8抗體，室溫30 min，然后根據(jù)聯(lián)科破膜試劑盒所示，分別進(jìn)行染色固定破膜，并加入胞內(nèi)染色熒光抗體PE抗IFN-γ，室溫30 min后，洗滌后用于流式分析。

5流式細(xì)胞儀分析DC特征或T細(xì)胞反應(yīng)性 所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置無(wú)熒光標(biāo)記的空白管，多色熒光標(biāo)記時(shí)每一熒光分別設(shè)置單色標(biāo)記對(duì)照，必要時(shí)加上同型對(duì)照。根據(jù)不染管、單標(biāo)管，調(diào)整細(xì)胞選取門(mén)和閾值，流式細(xì)胞儀（FACSVerse，美國(guó)BD公司）、至少讀取10 000個(gè)細(xì)胞（Events）后記錄結(jié)果；CytoFLEX至少讀取5 000個(gè)細(xì)胞（Events）后記錄結(jié)果。

5.1DC特征分析：分幾組進(jìn)行流式抗體標(biāo)記設(shè)置以下幾種染色組合①APC-CD80、FITC-CD86、PECD83；②APC-HLA-I、PE-CD14、FITC-CD1a；③APC-CD123、PE-CD49f、FITC-CD86；④APCCD56、PE-CD64、FITC-DR；組合①為必選，②～④根據(jù)DC數(shù)量，選擇性選取，加入抗體孵育30 min，PBS洗滌2～3次后進(jìn)行流式分析，并另取一孔進(jìn)行7-ADD 單獨(dú)染死活細(xì)胞。

5.2T細(xì)胞反應(yīng)性分析：主要觀察CD3+IFN-γ+/CD8+IFN-γ+T細(xì)胞群占比，這些細(xì)胞代表分泌IFN-γ的反應(yīng)性T細(xì)胞。

6ELISA法分析細(xì)胞培養(yǎng)板中IFN-γ含量 按照廠商說(shuō)明操作，用1.3中所留取的上清液進(jìn)行IFN-γ含量測(cè)定，并同步用標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用SpectraMax i3X儀器自帶軟件計(jì)算得到擬合方程和擬合度，并計(jì)算出各待測(cè)樣品的IFN-γ濃度。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)論都經(jīng)至少三次的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

結(jié)果

1DC細(xì)胞分析 可觀察到本實(shí)驗(yàn)用PBMC誘導(dǎo)成熟DC，其HLA-I、HLA-DR、CD86、CD83、CD80均為高表達(dá)（圖1），符合成熟DC細(xì)胞特征，DC占比不同健康個(gè)體樣品具有差異，誘導(dǎo)率為5%～30%。除了以上標(biāo)記以外，這些樣品還進(jìn)行了CD1a、CD3、CD14、CD16、CD49f、CD56、CD64、CD123等標(biāo)記的檢測(cè)，其中CD1a、CD14在不同樣品中呈現(xiàn)出不同的陽(yáng)性比例，CD49f為部分陽(yáng)性，CD3、CD16、CD56、CD64、CD123基本以陰性為主。

圖1 獻(xiàn)血者來(lái)源PBMC誘導(dǎo)培養(yǎng)為成熟的DC細(xì)胞

2不同腫瘤抗原肽誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)性 用不同腫瘤抗原肽裝載DC后和PBL共培養(yǎng)后，我們可以觀察到裝載多肽LM5等多組，IFN-γ+CD3+的T細(xì)胞明顯增多（圖2 DMSO-LM5），甚至比PHA刺激陽(yáng)性對(duì)照組（圖2 PHA10）更明顯，而顯示裝載多肽NSLC-ST后的分泌IFN-γ+的CD3+T細(xì)胞占比差別無(wú)明顯區(qū)別。由于所有實(shí)驗(yàn)孔采用的起始細(xì)胞量、涉及的試劑、操作、環(huán)境均為一致的，只有裝載多肽有區(qū)別，說(shuō)明IFN-γ+T細(xì)胞占比不同是因加入的抗原肽不同而異。

圖2 裝載腫瘤抗原肽的DC刺激PBL誘導(dǎo)為分泌IFN-γ的T細(xì)胞

3上清液IFN-γ的ELISA結(jié)果和CD3+IFN-γ+/CD8+IFN-γ+T細(xì)胞比較 利用上清液進(jìn)行IFN-γ的ELISA分析，測(cè)定濃度列于表2，和流式細(xì)胞分析結(jié)果進(jìn)行比較并作了相關(guān)分析，圖3a、3b是流式結(jié)果的截圖，具體細(xì)胞占比也一并列于表2。

圖3a FITC-CD3PE-IFN-γ染色后T細(xì)胞群

圖3b APC-CD8PE-IFN-γ染色后的T細(xì)胞群

表2 A8樣品的IFN-γ ELISA測(cè)定濃度與IFN-γ+T細(xì)胞比值的比較和相關(guān)系數(shù)

從表2中可以看到，除陽(yáng)性對(duì)照外，三組中LM2、LM4、LM10、LM13也呈現(xiàn)出比較一致的高IFN-γ，而LM3、LM6組具有部分結(jié)果升高，但并沒(méi)有3組線性同比例增高，可能流式分析的是封閉在細(xì)胞內(nèi)的IFN-γ，而上清液中IFN-γ濃度則是在多肽刺激后前16 h內(nèi)已經(jīng)分泌釋放到細(xì)胞外的，上清液和細(xì)胞胞內(nèi)標(biāo)志具有時(shí)間上的不同步性，反應(yīng)性高的細(xì)胞分泌快，事實(shí)上實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的LM3復(fù)孔也是同樣的情況。IFN-γ濃度和IFN-γ+CD3+T細(xì)胞比值相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.66，和IFN-γ+CD8T細(xì)胞比值相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.58，為中等相關(guān)，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義，類(lèi)似相關(guān)結(jié)果在其他具有細(xì)胞反應(yīng)增高的多份標(biāo)本中也得到證實(shí)，說(shuō)明上清液中直接測(cè)定IFN-γ濃度也可作為檢測(cè)細(xì)胞反應(yīng)性的一種實(shí)驗(yàn)工具。

4獻(xiàn)血者PBMC對(duì)于新抗原肽的總體反應(yīng)性 本研究發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)3份或3份以上PBMC產(chǎn)生反應(yīng)性T細(xì)胞的新抗原肽包括LM2、LM3、LM4、LM5、LM6、LM7、LM9、LM10、LM11、LM13，占10/13；但不同PBMC對(duì)應(yīng)具有反應(yīng)性的多肽數(shù)量差異性較大，根據(jù)文獻(xiàn)[15]，我們也采用相同的標(biāo)準(zhǔn)：具有反應(yīng)性的定義是CD8+IFN-γ+T細(xì)胞或CD3+IFN-γ+T細(xì)胞數(shù)增加超過(guò)基準(zhǔn)對(duì)照組2倍。而部分個(gè)體具有較廣泛的高反應(yīng)性，超過(guò)基準(zhǔn)組10倍，其臨床或醫(yī)學(xué)意義需要留待進(jìn)一步探討。

圖4 不同多肽在不同PBMC中誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞的能力比較

討論

最近的細(xì)胞免疫治療包括腫瘤疫苗研制等為征服腫瘤提供了曙光，尤其是CAR-T等細(xì)胞治療產(chǎn)品，正式獲得臨床試驗(yàn)許可，彰顯了其應(yīng)用價(jià)值，但目前僅限于血液系統(tǒng)的腫瘤[3-6]，而實(shí)體腫瘤治療的免疫治療手段依然需要進(jìn)一步的研究[2，10，15]。腫瘤臨床治療領(lǐng)域另一個(gè)新的熱點(diǎn)-基于免疫檢查點(diǎn)阻斷的治療性抗體也具有明顯療效，但僅在20%的患者人群中有效[8]，且有效性也可能因突變而不同[16]，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)可通過(guò)腫瘤新抗原作為疫苗可誘導(dǎo)獲得抗腫瘤治療效果[10-15，17]，而免疫檢查點(diǎn)阻斷的治療和腫瘤新抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞抗瘤等幾種聯(lián)合治療目前認(rèn)為可能具有良好效果[18]，但采集自腫瘤患者的自身細(xì)胞，可能具有免疫反應(yīng)能力低下、采集量有限等缺點(diǎn)，其有效反應(yīng)株可在病程發(fā)展中被不斷耗竭[1，13，19-20]，而從健康獻(xiàn)血者處分離獲取免疫細(xì)胞具有數(shù)量眾多、可重復(fù)采集、細(xì)胞兼有多樣性，可打擊腫瘤的不同抗原、可預(yù)先制備儲(chǔ)存，以利緊急使用等優(yōu)點(diǎn)，雖然目前沒(méi)有得到共識(shí)，但考慮到本研究的實(shí)驗(yàn)流程所制備獲取的腫瘤新抗原特異性T細(xì)胞是經(jīng)過(guò)抗原肽數(shù)次定向誘導(dǎo)活化的，不再是免疫幼稚期，因而我們認(rèn)為其中具有再次被誘導(dǎo)分化針對(duì)未來(lái)的同種宿主的克隆株已被大幅清除了[14，23]，所以其誘導(dǎo)移植物抗宿主病的能力應(yīng)該相對(duì)低下；另一方面，健康獻(xiàn)血者來(lái)源PBMC，大部分T細(xì)胞只有經(jīng)過(guò)合適的DC誘導(dǎo)“教育”，才可能具備針對(duì)DC誘導(dǎo)提呈抗原肽的T細(xì)胞克隆[14，23-27]。

有鑒于此，我們?cè)O(shè)計(jì)了本研究，利用腫瘤患者的腫瘤組織獲取單細(xì)胞，根據(jù)單細(xì)胞測(cè)序得到的序列合成新抗原肽，再用MHC多樣化的眾多健康獻(xiàn)血者來(lái)源PBMC作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)成熟DC裝載新抗原肽，“教育”Na?ve T細(xì)胞獲得識(shí)別抗原肽的能力并活化增殖成熟，從而獲得抗腫瘤抗原肽的能力。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了獻(xiàn)血者的PBMC可被誘導(dǎo)而產(chǎn)生明顯的活化狀態(tài)，17位獻(xiàn)血者中的13位，他們的PBMC能使用本團(tuán)隊(duì)獲得的新抗原肽而誘導(dǎo)出明顯的反應(yīng)性T，而13種新抗原多肽中有10種至少在3份血樣中可誘導(dǎo)得到反應(yīng)性T細(xì)胞，如LM3、LM4、LM5、LM7、LM13等，可能因?yàn)榻】但I(xiàn)血員的血樣具有更高殺瘤潛力。

同時(shí)我們的實(shí)驗(yàn)也表明ELISA法測(cè)量IFN-γ濃度也是可行的，在多肽刺激后16 h進(jìn)行的封閉，并不影響大部分實(shí)驗(yàn)樣本已分泌出部分IFN-γ，濃度已處于可測(cè)范圍內(nèi)，且結(jié)果和流式細(xì)胞學(xué)分析具有一定的相關(guān)性。考慮ELISA實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)便性和實(shí)驗(yàn)檢材的易保存特征，IFN-γ濃度測(cè)定有望可增加作為細(xì)胞毒性或反應(yīng)性T細(xì)胞檢測(cè)輔助篩選手段之一。

我們也關(guān)注到實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有些個(gè)體差異非常明顯，如PHA刺激T細(xì)胞反應(yīng)性，有的樣品能分泌出高達(dá)2 000 pg/mL的IFN-γ，而同樣條件下有的樣品只分泌出100 pg/mL，健康獻(xiàn)血員中這種受刺激后高表達(dá)細(xì)胞因子的傾向，有何實(shí)際意義尚不得知，是否和感染后容易產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴有關(guān)或者具有更高的抵抗腫瘤發(fā)生能力，都需要進(jìn)一步研究。

本研究希望能利用血液中心的特點(diǎn)——廣泛而不間斷的獻(xiàn)血者來(lái)源，具備多樣化HLA特征而且可以預(yù)先凍存等優(yōu)勢(shì)，為腫瘤的治療提供新的資源和方法，使得健康獻(xiàn)血員來(lái)源PBMC得到更有效的利用，先利用腫瘤組織獲取腫瘤新抗原，進(jìn)行腫瘤疫苗的“量身訂做”，再?gòu)谋姸鄡龃骖A(yù)制的庫(kù)存中篩選出符合不同病人的細(xì)胞資源，根據(jù)MHC匹配或部分匹配原則，制造出合適的抗瘤細(xì)胞，過(guò)繼輸注或局部注射給病人進(jìn)行后續(xù)治療，從而造福人類(lèi)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

（致謝：資金資助方：中國(guó)輸血協(xié)會(huì)威高重點(diǎn)CSBT-MWG-2020-01；上海市衛(wèi)健委面上項(xiàng)目202040503 ；東南大學(xué)免疫系沈傳來(lái)教授給予的實(shí)驗(yàn)幫助）