B等位基因新突變導(dǎo)致B抗原弱表達(dá)1例*

李小薇 李慧敏 寧義平 白曉瑩 李翠瑩

在人類血型系統(tǒng)中ABO血型系統(tǒng)的抗原性最強(qiáng)，是最復(fù)雜、最具多態(tài)性的血型系統(tǒng)之一，ABO 血型鑒定的準(zhǔn)確性直接關(guān)系到患者輸血治療的安全[1]。除正常ABO血型外還存在著ABO亞型和受病理、生理等因素影響的ABO正反定型不符的血型表現(xiàn)，部分病例依靠血清學(xué)無法準(zhǔn)確區(qū)分?；驒z測方法能夠克服以上血型血清學(xué)檢測局限，結(jié)果判斷更加客觀，逐漸成為準(zhǔn)確判斷疑難血型必不可少的重要輔助手段[2]。本文分析了1例弱B抗原樣本的血清學(xué)結(jié)果和基因檢測結(jié)果，報告如下。

對象與方法

1對象 2021年12月就診于本中心婦產(chǎn)與生殖醫(yī)學(xué)科門診患者1例。女性，41歲，乙肝患者，診斷陰道出血、貧血等，既往無輸血史，送輸血科進(jìn)行血型和不規(guī)則抗體篩查。

2儀器與試劑 抗-A、抗-B單克隆抗體（批號：20200912，上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司），抗-H抗體（批號：8000258203，荷蘭Sanquin公司）；ABO反定型細(xì)胞（批號：202108002，江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司）；血型鑒定凝膠卡（批號：202108006，江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司）；核酸提取試劑（批號：21072810T148，西安天隆科技有限公司）、人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒（SSP熒光PCR染料法）（批號：K202106003）、人類紅細(xì)胞ABO血型-B亞型基因分型試劑盒（SSP熒光PCR染料法）（批號：K210311001）（天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；dNTP-Buffer工作液（天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；Taq酶（美國Promage公司）。核酸提取儀NP968-C（西安天隆科技有限公司），基因擴(kuò)增儀LifeECO（杭州博日科技有限公司），通用型電泳儀JY300C（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），測序儀ABI 3130xl（美國ABI公司）。

3方法

3.1ABO血型血清學(xué)鑒定：使用微柱凝集法及鹽水試管法進(jìn)行血清學(xué)方法的血型鑒定。

3.2DNA提?。喊凑赵噭┖姓f明書提取血液標(biāo)本DNA。調(diào)整DNA濃度至（30～50）ng/μL、A260/A280值為1.6～2.0。

3.3熒光定量PCR法檢測ABO基因：進(jìn)行ABO基因初篩和B亞型檢測。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。擴(kuò)增條件如下，運行段：96℃ 2 min；96℃ 20 s，68℃60 s，5組循環(huán)；96℃ 20 s，65℃ 50 s，72℃ 45 s，10 組循環(huán)；96℃ 20 s，62℃ 50 s、72℃ 45 s，15組循環(huán)；72℃延伸 1 min。熔解段：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，臺階溫度1℃，臺階恒溫時間20 s。

3.4ABO基因測序：對該例樣本，分別進(jìn)行ABO基因第1～7外顯子測序和B基因單鏈測序，以確定突變位點以及突變點所在基因位置。委托天津秀鵬生物公司根據(jù)GENE BANK提供的ABO基因序列信息（NG_006669.1）設(shè)計ABO基因第1至第7外顯子的擴(kuò)增引物（表1）以及B等位基因第7外顯子的擴(kuò)增引物（表2），測序引物與擴(kuò)增引物一致。采用Sanger測序法，將目的片段進(jìn)行擴(kuò)增后，測序儀進(jìn)行測序并讀取結(jié)果。

表1 ABO基因第1至第7外顯子的擴(kuò)增引物

表2 B等位基因第7外顯子的擴(kuò)增引物

按照以下反應(yīng)體系對ABO基因的第1至第7外顯子，以及B等位基因第7外顯子進(jìn)行單獨擴(kuò)增：dNTPBuffer工作液 43.5 μL，Taq酶（5 units/μL）0.5 μL，特異性引物對（300nM）1.0 μL，DNA 5 μL，總體積50 μL。

反應(yīng)程序如下：96℃ 2 min；96℃ 20 s，68℃60 s，5組循環(huán)；96℃ 20 s，64℃ 50 s，72℃ 90 s，10 組循環(huán)；96℃ 20 s，61℃ 50 s、72℃ 90 s，25 組循環(huán)；72℃延伸 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。將擴(kuò)增完成的產(chǎn)物使用2.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，確定產(chǎn)物條帶均一且亮度足夠后，進(jìn)行測序。

使用chromespro軟件以及DNAMAN8.0軟件將測序的.ab1序列與ABO基因參考序列（NG_006669.1）進(jìn)行人工對比，參比dbRBC數(shù)據(jù)庫（更新日期2017年12月）以及ISBT數(shù)據(jù)庫（Names for ABO（ISBT 001）blood group alleles v1.1 171023）確定基因型。

結(jié)果

1ABO血型血清學(xué)檢測結(jié)果 患者紅細(xì)胞B抗原弱表達(dá)，抗-H 4+，同時血清中存在抗-A抗體，無抗-B抗體。4℃加強(qiáng)半小時后檢測B抗原3+，仍為弱表達(dá)（表3）。

表3 患者ABO血型血清學(xué)檢測結(jié)果

2熒光定量PCR法檢測B亞型基因 按照ABO基因初篩試劑盒讀板紙判讀結(jié)果為B/O型，進(jìn)一步使用B亞型試劑盒檢測，按照讀板紙判讀結(jié)果為B/O型。

3ABO基因測序 根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的The Blood Group Antigen Gene Mutation Database綜合結(jié)果判定（以ABO*A1.01為參考序列）：該樣本ABO基因在ABO*B.01/ABO*O.01.01的基礎(chǔ)上，存在外顯子7的c.448 T＞C的雜合突變（圖1A）。結(jié)合血清學(xué)結(jié)果分析，推測該突變可能位于B基因上，導(dǎo)致B抗原減弱。

為了進(jìn)一步確定雜合突變所在基因，進(jìn)行B基因單鏈測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該樣本第7外顯子突變點在ABO*B.01的基礎(chǔ)上，多了c.448 T＞C的突變，證明突變點位于B基因上，屬新的未被數(shù)據(jù)庫收錄的B等位基因新突變（圖1B）。

圖1 新發(fā)現(xiàn)ABO血型等位基因的核苷酸突變

討論

ABO血型系統(tǒng)中少數(shù)人群為ABO亞型，表現(xiàn)為抗原或抗體減弱，導(dǎo)致血清學(xué)ABO正反定型不一致，引起血型定型困難，影響臨床輸血的安全性和有效性。ABO基因編碼區(qū)共有7個外顯子，其中外顯子6和外顯子7分別編碼45、230個氨基酸，是產(chǎn)生ABO亞型的主要基因突變區(qū)域，具有明確的血型血清學(xué)特點[3]。

本研究中患者血型血清學(xué)結(jié)果為ABO正定型檢出弱B抗原，抗-H結(jié)果強(qiáng)凝集4+，反定型檢出抗-A，無抗-B（表3），推測為B亞型，隨后進(jìn)行基因分型。B亞型基因分型結(jié)果顯示患者為B/O型，但考慮到血型血清學(xué)檢測結(jié)果為B抗原減弱，故懷疑存在試劑盒檢測范圍以外的罕見B亞型或者存在新的基因突變位點，導(dǎo)致B基因編碼的氨基酸發(fā)生變化，從而使抗原表達(dá)減弱[4-6]。因此進(jìn)行ABO基因外顯子1-7測序，結(jié)果為ABO*O.01.01/ B-novel（c.448 T＞C）（圖1A）；為進(jìn)一步判斷突變位點所在ABO基因，對B基因外顯子7進(jìn)行單鏈測序（圖1B）。與ABO*B.01基因相比，患者B基因序列中第448位堿基發(fā)生了點突變T＞C，提示第150號氨基酸由酪氨酸（Tyr）突變成組氨酸（His）。該突變并未被NCBI和dbRBC數(shù)據(jù)庫收錄，本文為首次報道；血清學(xué)結(jié)果導(dǎo)致了B抗原表達(dá)減弱，具體機(jī)理尚不明確。為了解患者該B變異等位基因的來源，進(jìn)一步可對其父母及其父母系3代做家系調(diào)查。序列已提交NCBI 國際基因數(shù)據(jù)庫（GeneBank），獲得登錄號“BankIt2613623 BSeq#1 OP254132”，等待確認(rèn)序列號。

聯(lián)用血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)對ABO亞型的準(zhǔn)確鑒定具有重要作用[7-9]。本研究提示輸血工作人員在進(jìn)行患者輸血前，對于ABO血型正反定型不符的患者有必要聯(lián)合應(yīng)用兩種方法學(xué)進(jìn)行ABO血型鑒定，最大程度地保障患者臨床輸血安全，并發(fā)現(xiàn)等位基因的新變異[10-12]。利用分子生物學(xué)技術(shù)可以明確區(qū)分ABO血型正反定型不符是ABO亞型，還是受病理、生理等因素影響，明確疑難血型產(chǎn)生的原因。如果患者ABO血型正反定型不符是受病理、生理等因素影響，排除干擾因素后，考慮輸注ABO同型血液成分[13-15]。本研究中患者B抗原減弱是由于B等位基因的新突變造成，因同型紅細(xì)胞獲取困難，如需輸血，首選自體輸血，其次考慮輸注交叉配血相合B型或O型紅細(xì)胞。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突