血糖控制達(dá)標(biāo)的2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血miR-3197、miR-2116-5p的表達(dá)水平及其臨床價(jià)值*

張浩 方新梅 張瑪麗

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病性微血管病變中具有特異性改變的眼底病變，是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]。由于該病是一種階段性疾病，一般確診即為晚期，因此及時(shí)診斷和治療對于挽回患者視力損失至關(guān)重要。miRNA是一類高度保守的非編碼小分子RNA，它幾乎參與機(jī)體內(nèi)所有生理和病理過程，可作為新型診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA可參與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生，多種miRNA的差異表達(dá)與DR的發(fā)生存在密切聯(lián)系[3]，其中miR-3197和miR-2116-5p可作為DR有效的生物學(xué)標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，但是目前該方面的研究內(nèi)容較少且結(jié)論尚未統(tǒng)一。對此，本研究對循環(huán)miR-3197、miR-2116-5p在DR患者中的表達(dá)進(jìn)行分析，探究miR-3197、miR-2116-5p的差異表達(dá)與DR的相關(guān)性，確定二者對于DR的診斷價(jià)值。

資料與方法

1病例資料 選擇2018年7月～2020年3月在我院確診為DR的2型糖尿病（Type 2 diabetes，T2DM）患者72例作為研究對象，并收集同期未有DR的T2DM患者72例作為對照組。其中男性76例，女性68例，年齡在60～80歲之間，DR組平均年齡（65.32±4.56）歲，非DR組平均年齡（65.46±5.17）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國糖尿病協(xié)會(huì)的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；②所納入患者血糖控制在正常水平。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有急性或慢性炎癥性疾病者；②青年期發(fā)病的糖尿病、線粒體糖尿病或1型糖尿病者；③伴有全身系統(tǒng)性疾病者。本研究所有患者均知情并簽署知情同意書，獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號：2017-QT-15）。

2診斷標(biāo)準(zhǔn) T2DM[4]：①空腹血糖＞7.0 mmol/L；②餐后2小時(shí)血糖＞11.1 mmol/L；③HbA1c＞6.5%。DR：糖尿病患者的視網(wǎng)膜出現(xiàn)病變，如視網(wǎng)膜有出血點(diǎn)，有黃白色滲出或出血，或者有視網(wǎng)膜前增殖。DR分級標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國早期治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變評分（early treatment diabetic retinopathy study，ETDRS）[5]：10～30分為1級；31～40分為2級；41～50分為3級；51～60分為4級；60～85分為5級。分級越高DR病情越嚴(yán)重。

3實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 采集外周血標(biāo)本5 mL，離心（3 000 r/min,15 min）分離患者血清，檢測總膽固醇（total cholesterol,TC）、三酰甘油（triacylglycerol,TG）、糖化白蛋白（glycosylated albumin,GA）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）、載脂蛋白A（apolipoprotein A,ApoA）、載脂蛋白B（apolipoprotein B,ApoB）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）、血肌酐、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（white blood cell count,WBC）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、血尿酸（uric acid,UA）、肌酐（creatinine,Cr）以及尿白蛋白/肌酐（UACR）。體重指數(shù)（BMI）計(jì)算為體重（kg）/身高（m）2。

4循環(huán)miRNA的提取純化 通過使用Beckman J-6M感應(yīng)驅(qū)動(dòng)離心機(jī)（Beckman Instruments,California,USA）在4℃下以6 000 g雙重離心15 min提取血清樣品，隨后將樣品分裝并于-80 ℃儲(chǔ)存以備RNA提取。根據(jù)制造商的說明，使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（Qiagen,Hilden,Germany）從血清樣品中分離miRNA。使用Agilent 2100生物分析儀和RNA 6000 Nano/Pico LabChip（Agilent Technologies,Boeblingen,Germany）評估RNA的質(zhì)量。

5microRNA分析研究 每個(gè)微陣列能夠檢測8 273種miRNA，對照探針用于評估質(zhì)量，GenePix 4000B激光掃描儀（Molecular Devices,California,USA）和Array-Pro圖像分析軟件（Media Cybernetics）分別用于收集和數(shù)字化熒光圖像。在本研究中，差異表達(dá)的miRNA使用Bioconductor EdgeR進(jìn)行鑒定，該軟件包用于分析由RNA測序技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)字基因表達(dá)數(shù)據(jù)，主要測試差異表達(dá)，如果miRNA具有|log2（倍數(shù)變化）＞1|且P＜0.05，則認(rèn)為存在差異表達(dá)，利用cluster軟件得到差異表達(dá)基因的表達(dá)模式聚類。

6RT-qPCR 在逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA之前，將3.5 μL來自秀麗隱桿線蟲（cel-miR-39）的合成miR-39添加到提取的miRNA作為摻入對照（1.6×108copies/μL工作溶液）。使用miScripts Ⅱ RT Kit（Qiagen,Germany）逆轉(zhuǎn)錄總RNA。每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包含2 μL RNA模板、1 μL miScript Reverse Transcription Mix、4 μL 5×miScript RT緩沖液和13 μL無RNase水，最終體積為20 μL。使用iCycler系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（37℃孵育1 h，95℃孵育5 min）。隨后將cDNA稀釋10倍，然后再添加到每個(gè)qPCR反應(yīng)體系中。每個(gè)反應(yīng)體系包括6.2 μL SYBR Green PCR Master Mix（BioRad,Hercules,CA,USA）、1.2 μL miScript通用引物、1.2 μL特異性引物、2 μL cDNA和1.9 μL無RNase水。根據(jù)制造商說明書設(shè)置反應(yīng)條件：95℃15 min，94℃ 15 s、55℃30 s和70℃30 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)。該反應(yīng)在Mx3005P qPCR系統(tǒng)（Stratagene，美國）上進(jìn)行。每個(gè)樣品重復(fù)3次。熔解曲線和擴(kuò)增圖用于檢查反應(yīng)的特異性。循環(huán)miR-3197（Hs_miR-3197 miScript Primer Assay,MS00041874,Qiagen,Germany）和miR-2116-5p（Hs_miR-2116-5p miScript Primer Assay,MS00031598,Qiagen,Germany）的水平在標(biāo)準(zhǔn)化后通過2-ΔΔCt（循環(huán)閾值）方法進(jìn)行定量分析。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料使用百分?jǐn)?shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)變量是否呈正態(tài)分布。Spearman檢驗(yàn)循環(huán)miR-3197和miR-2116-5p與DR的相關(guān)性，Pearson檢驗(yàn)miR-3197和miR-2116-5p與GA、FPG、UACR以及HbA1c的相關(guān)性。計(jì)算ROC曲線下面積（area under curve，AUC）以評估候選 miRNA 的預(yù)測值。

結(jié)果

1兩組患者基線資料對比 DR組患者的GA、FPG、UACR以及HbA1c指標(biāo)高于非DR組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組患者在年齡、BMI、糖尿病病程、TC、Cr、HDL、LDL、TG 以及BUN方面沒有顯著的組間差異（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者基線資料對比

續(xù)表1

2兩組患者基因表達(dá)差異對比 通過μParaflo?MicroRNA微陣列檢測到共有73種miRNA在DR病例中差異表達(dá)，其中，miR-3197和miR-2116-5p在DR患者中的含量顯著高于非DR患者（miR-3197，|Log2（Fold Change）|=8.96，P＜0.001；miR-2116-5p，|Log2（Fold Change）|=8.38，P＜0.001），見表2?；趦山M差異表達(dá)基因聚類分析結(jié)果，上調(diào)基因和下調(diào)基因分別聚為兩大類，紅色表示表達(dá)上調(diào)，綠色表示表達(dá)下調(diào)，差異倍數(shù)以log2Ratio表示，見圖1。

圖1 兩組DR相關(guān)差異表達(dá)基因聚類分析圖（A：非DR組；B：DR組）

表2 μParaflo? MicroRNA微陣列分析檢測到的循環(huán)miRNA的差異表達(dá)

續(xù)表2

3兩組患者基因表達(dá)差異驗(yàn)證 通過RT-qPCR分析驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與非DR組對比，DR病例中miR-3197和miR-2116-5p表達(dá)均顯著上調(diào)（miR-3197：倍數(shù)變化=1.67，P=2×10-7；miR-2116-5p：倍數(shù)變化=1.33，P=6×10-5），見圖 2。

圖2 兩組患者基因表達(dá)差異驗(yàn)證

4循環(huán)miR-3197和miR-2116-5p水平與DR及血液指標(biāo)的相關(guān)性分析 采用Spearman法對循環(huán)miR-3197和miR-2116-5p水平與DR進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示miR-3197和miR-2116-5p與DR均呈顯著正相關(guān)（P均＜0.001），見圖3。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，DR組患者血清miR-3197和miR-2116-5p水平與GA、FPG、UACR以及HbA1c均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與其他指標(biāo)之間無明顯相關(guān)性，見表3。

表3 循環(huán)miR-3197和miR-2116-5p水平與血液指標(biāo)的相關(guān)性分析

圖3 循環(huán)miR-3197和miR-2116-5p水平與DR的相關(guān)性

5循環(huán)miR-3197和miR-2116-5p對DR的診斷價(jià)值 miR-3197和miR-2116-5p的ROC曲線下面積（area under curve，AUC）分別為 0.903和0.875，表明這兩種循環(huán)miRNA可以識別患有DR的風(fēng)險(xiǎn)，兩種miRNA聯(lián)合檢測的AUC為0.976（95%CI：0.905～0.997），準(zhǔn)確率為91%，優(yōu)于單獨(dú)檢測，見表4，圖4。

圖4 聯(lián)合預(yù)測因子及各原始協(xié)變量預(yù)測DR的ROC曲線性

表4 聯(lián)合預(yù)測因子及各原始協(xié)變量對DR診斷的AUC及其他參數(shù)估計(jì)

討論

DR是由于糖尿病患者血液成分改變而引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常導(dǎo)致的血視網(wǎng)膜屏障受損，是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，也是老年人視力喪失的主要原因[6-7]。在當(dāng)今社會(huì)，DR已成為最突出的公共衛(wèi)生威脅之一[8]。相關(guān)研究顯示[9-10]，在全世界近2.85億糖尿病患者中，超過三分之一的患者有并發(fā)DR的跡象，在我國9 240萬成人糖尿病患者中，約43%的糖尿病患者已經(jīng)患有視網(wǎng)膜病變，嚴(yán)重威脅患者的生命健康和生活質(zhì)量[11]。此外，由于DR是一種多階段的發(fā)育性疾病，其診斷往往發(fā)生在晚期，因此，迫切需要高敏感性和特異性的新型非侵入性或微創(chuàng)生物標(biāo)志物用于DR的早期診斷。

作為高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，miRNA通過抑制mRNA翻譯或通過與靶基因的3'-UTR結(jié)合抑制蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，miRNA廣泛參與細(xì)胞發(fā)育、組織分化、細(xì)胞增殖和凋亡等生理和病理過程[12]，并在DR的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[13]，鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的miRNA發(fā)生異常表達(dá)，可通過影響糖尿病大鼠的關(guān)鍵調(diào)節(jié)功能參與DR發(fā)生的早期階段。一項(xiàng)miRNA分析研究表明，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中，存在多種miRNA上調(diào)的情況[14]。2019年，JI等人[15]的研究成果表明DR病例中多種miRNA存在差異表達(dá)，其中miR-2116-5p和miR-3197顯著上調(diào)。在本研究中，我們通過μParaflo?MicroRNA微陣列檢測到73種miRNA在DR病例中差異表達(dá)，其中，miR-3197和miR-2116-5p在DR患者中的含量顯著高于非DR患者，并通過RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證，這些結(jié)果與既往研究相符。另有研究發(fā)現(xiàn)[16]，在DR患者的視網(wǎng)膜中有80種miRNA發(fā)生上調(diào)，6種miRNA發(fā)生下調(diào)，且部分miRNA表達(dá)的改變與DR之間存在顯著相關(guān)性。對此，本研究通過Spearman法對循環(huán)miR-3197和miR-2116-5p與DR進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示循環(huán)miR-3197和miR-2116-5p水平與DR均呈顯著正相關(guān)，這進(jìn)一步說明了miR-3197和miR-2116-5p可參與DR的發(fā)生。

DR的發(fā)生受多方面因素影響，本研究通過對比DR患者與非DR患者的一般資料，確定GA、FPG、UACR以及HbA1c指標(biāo)是DR的影響因素。黃國強(qiáng)[17]等的研究表明，DR患者的FPG和HbA1c水平明顯高于非DR患者，是糖尿病患者發(fā)生DR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。張危[18]等的研究顯示，UACR與T2DM患者DR的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可作為重要的預(yù)測指標(biāo)。孫東海[19]的研究表明，GA水平與血糖水平、糖尿病病程、TC等多種因素密切相關(guān)，與T2DM患者DR的發(fā)生具有一定關(guān)系。本研究通過對比DR患者與非DR患者的一般資料，確定GA、FPG、UACR以及HbA1c指標(biāo)是DR的影響因素，這與既往研究相符。此外，為了進(jìn)一步確定miR-3197和miR-2116-5p與DR的關(guān)系，我們采用Pearson法對miR-3197和miR-2116-5p與GA、FPG、UACR以及HbA1c的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示miR-2116-5p及miR-3197分別與 GA、FPG、UACR以及HbA1c之間呈正相關(guān)，提示這兩種miRNA可能與DR發(fā)生發(fā)展及其微血管病變密切相關(guān)。因此，miR-2116-5p及miR-3197水平顯著上調(diào)可能是DR發(fā)生的早期風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警，應(yīng)盡早采取相應(yīng)措施對病情進(jìn)行有效控制。通過ROC曲線評估循環(huán)miR-3197和miR-2116-5p對DR的診斷敏感性和特異性，結(jié)果顯示miR-3197和miR-2116-5p的AUC分別為0.903和0.875，與JI等[15]的研究中miR-3197和miR-2116-5p診斷DR的AUC相符，表明這兩種循環(huán) miRNA可以識別DR的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究中miR-3197和miR-2116-5p聯(lián)合檢測的AUC為0.976，顯著大于單項(xiàng)檢測，提示兩種miRNA的組合檢測對DR具有更高的診斷能力。

本研究通過微陣列分析DR組和非DR組多種差異表達(dá)的miRNA，但并未一一驗(yàn)證，這是本研究的局限性，其他顯著上調(diào)的miRNA將在未來的研究中進(jìn)行探討。

綜上所述，循環(huán) miR-3197 和 miR-2116-5p在DR患者中顯著上調(diào)，與DR病情嚴(yán)重程度及多種DR相關(guān)指標(biāo)密切相關(guān)，可能參與病情發(fā)生發(fā)展過程，二者聯(lián)合檢測對于DR具有更高的診斷價(jià)值，在臨床診療中具有一定的應(yīng)用前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突