抑草圈種植下水稻和稗草根際土壤酶活性和微生物群落變化

馬華燕, 王艷萍, 林舜賢, 何海斌, 李家玉

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

水稻(OryzasativeL.)作為世界上最主要的糧食作物之一，養(yǎng)活了世界約50%的人口，為人類提供了19%的膳食能量[1]，自20世紀(jì)70年代中期以來，除草劑應(yīng)用的數(shù)量、種類逐年增加，然而長期過量使用除草劑會使雜草產(chǎn)生抗性和再生猖獗等問題，并且除草劑的殘留關(guān)系著糧食的安全生產(chǎn)[2].稗草(EchinochloacrusgalliL.)是主要的稻田雜草之一，影響著水稻的生長發(fā)育和產(chǎn)量[3].化感水稻可通過根系釋放、葉片淋溶、秸稈分解等方式向環(huán)境釋放酚酸類、黃酮類、萜類等化感物質(zhì)[4-7]，抑制田間雜草的生長發(fā)育，提高水稻產(chǎn)量[8-10].研究表明[11-13]，通過雜草脅迫和稗草種植液誘導(dǎo)有利于促進水稻分泌化感物質(zhì)，從而提高水稻抑草潛力.在水培條件下[14]，稗草和水稻混種時與水稻酚類化合物合成相關(guān)的PAL、C4H、F5H、COMT基因上調(diào)表達，可提高水稻的化感抑草潛力.也有研究表明[15-17]，采用稻/稗共培抑草圈土培種植法能夠模擬大田種植的水稻對稗草的化感抑制作用，已經(jīng)成為研究水稻化感作用的重要種植模式.化感水稻的抑草模式主要是通過根系分泌化感物質(zhì)，以土壤為媒介，傳輸?shù)绞荏w根際從而形成抑草圈，在此過程中，水稻和稗草土壤中的酶活性和微生物種群受到一定程度的干擾或促進，從而影響水稻的化感抑制作用[18].研究表明[19]，三葉期旱作水稻根際土壤的脲酶、多酚氧化酶活性與水稻化感潛力呈顯著負(fù)相關(guān)，酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性與水稻化感潛力呈顯著正相關(guān).化感水稻PI312777 根際土壤脲酶、蛋白酶和蔗糖酶活性高于非化感水稻Lemont，經(jīng)過稗草種植液誘導(dǎo)后，化感水稻PI312777根際土壤的多酚氧化酶、蔗糖酶和磷酸單酯酶活性顯著提高[12-13].從化感水稻PI312777水培液中分離出粘細菌屬Myxococcussp.，外源添加酚酸類化感物質(zhì)(對羥基苯甲酸、肉桂酸和阿魏酸)，阿魏酸可以顯著提高粘細菌的數(shù)量[20].化感水稻分泌的黃酮類物質(zhì)5,7,4′-trihydroxy-3′,5′-dimethoxyflavone顯著降低土壤中的真菌數(shù)量，而其在土壤中的降解產(chǎn)物苯甲酸物質(zhì)提高水稻根際土壤中的細菌數(shù)量[21].旱直播模式下強弱化感水稻根際土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)存在較大的多樣性[22].以上研究結(jié)果均表明，植株根際土壤的酶活性和微生物群落與其化感作用的發(fā)揮顯著相關(guān)，但同時監(jiān)測化感作用的供體植株和受體植株根際土壤的酶活性和微生物變化還未見相關(guān)報道.本試驗利用前期建立的稻/稗共培抑草圈土培種植法，探究化感作用供體(水稻)和化感作用受體(稗草)共培下水稻化感潛力與兩者根際土壤酶活性和微生物變化之間的關(guān)系，為揭示水稻化感作用的微生態(tài)變化提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設(shè)計

供試品種為國際公認(rèn)的強化感潛力水稻PI312777(PI，秈稻)和非化感水稻Lemont (LE，粳稻)[23]，采用自然條件下土壤種植.

試驗于2021年6—9月在福建農(nóng)林大學(xué)室外網(wǎng)室進行.取12 kg土壤于塑料盆中，加水并攪拌均勻，靜置1 d.在每個盆的中心均勻播下5顆預(yù)萌發(fā)的2種水稻種子，每天補充水分以保持土壤濕潤，并拔出試驗過程中長出來的雜草.待水稻長到5葉期，距水稻12 cm處均勻播下5顆預(yù)萌發(fā)的稗草種子，以2種水稻和稗草共培種植為試驗組，以單種稗草為對照組，每個處理設(shè)置3個重復(fù).待稗草移栽2周后，收集稗草地上部并測定其株高、干鮮重，計算抑制率.

1.2 水稻和稗草根際土壤收集

參照抖落法分別收集水稻和稗草的根際土壤[24]，將每個處理的3個重復(fù)的水稻或稗草根際土壤收集后混勻，過1 mm篩，再重新三等分用于后續(xù)試驗.2種水稻的根際土壤分別記為PI和LE，3種稗草的根際土壤分別記為CK-稗,PI-稗,LE-稗.

土壤酶活性參照李振高等[25]的方法測定.各酶檢測方法簡述如下：脲酶采用苯酚鈉比色法，以24 h后1 g干土中氨基氮的含量表示酶活性；蔗糖酶采用硝基水楊酸比色法測定，以24 h后1 g干土中葡萄糖的含量表示酶活性；蛋白酶采用Folin-Ciocslteu比色法測定，以24 h后1 g干土中氨基氮的含量表示酶活性；過氧化物酶采用紫色沒食子酸比色法測定，以2 h后1 g干土中紫色沒食子素的含量表示酶活性.各酶活性測定3個重復(fù).

1.3 水稻和稗草根際土壤微生物多樣性測定

根際土壤微生物功能多樣性采用 BIOLOG ECO微平板法測定[26]：取5g新鮮土壤置于100 mL滅菌組培瓶中，加入45 mL 0.85%的NaCl滅菌溶液，封口，120 r·min-1振蕩10 min，冰浴靜置2 min，取上清液5 mL，置于裝有45 mL滅菌超純水的100 mL滅菌組培瓶中混勻，重復(fù)1次，制得1∶1 000的土壤提取液，用于 ELSIA反應(yīng).試驗前將 BIOLOG ECO平板置于25 ℃預(yù)熱，使用移液槍吸取150 μL提取液于各孔中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，每24 h采用酶標(biāo)儀(INFINITE 200 PRO, Tecan, Austria)讀取各反應(yīng)孔在590 nm處的吸光值，連續(xù)讀取168 h，試驗設(shè)置3次重復(fù).以BIOLOG ECO平板中每孔顏色平均變化率(average well color development, AWCD)表示土壤微生物群落ELISA反應(yīng)的結(jié)果.AWCD=[∑(C-R)]/31，其中C是所測定的31個碳源孔的吸光值，R為對照孔的吸光值.根據(jù) BIOLOG微生態(tài)板中的31種單一碳源分類，將碳源分為糖類、氨基酸類、羧酸類、胺類、多聚物類和酚酸類[11].

1.4 數(shù)據(jù)分析

水稻對稗草生長的抑制率計算公式：抑制率/%=[(單種組生長指標(biāo)-共培組生長指標(biāo))/單種組生長指標(biāo)]×100.數(shù)據(jù)分析過程中的方差分析、顯著性分析使用DPS 軟件進行，相關(guān)性分析采用IBM SPSS Statistics 19進行，主成分分析采用Origin 2021軟件進行.

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻抑草效應(yīng)

試驗結(jié)果表明(表1)：稗草的株高、地上部鮮重和地上部干重均表現(xiàn)為CK-稗>LE-稗>PI-稗草，且存在顯著差異.從抑制率上看，化感水稻PI312777對稗草的株高、鮮重及干重的抑制率均顯著高于非化感水稻Lemont(P<0.05).此結(jié)果與前期抑草圈種植試驗的結(jié)果一致，表明12 cm為合適的水稻對稗草化感抑草圈的距離，此時水稻和稗草根際的土壤能夠代表化感作用的供體和受體供下一步研究.

表1 不同化感潛力水稻對稗草的抑制率1)Table 1 Inhibition rate of barnyard grass by rice with different allelopathic potential

2.2 根際土壤酶活性分析

水稻根際土壤酶活性測定結(jié)果表明(表2)，當(dāng)在12 cm距離處種植稗草后，不同化感潛力水稻根際土壤的過氧化物酶、蛋白酶、蔗糖酶和脲酶活性存在差異.化感水稻PI312777根際土壤的過氧化物酶、蔗糖酶、脲酶活性均高于非化感水稻Lemont根際，其中過氧化物酶和蔗糖酶達到了顯著水平(P<0.05)，兩種酶活性分別升高了1.05、1.63倍.

表2 不同化感潛力水稻的根際土壤酶活性1)Table 2 Enzyme activity in rhizosphere soil of rice with different allelopathic potential

稗草根際土壤酶活性測定結(jié)果表明(圖1)：與單種稗草相比，與化感水稻PI312777共培的稗草根際土壤的過氧化物酶、蛋白酶活性呈下降趨勢，其中蛋白酶活性下降達到了顯著水平(P<0.05)，降低了14.76%；而蔗糖酶、脲酶活性均顯著增加(P<0.05)，分別增加了1.35、1.66倍.與單種稗草相比，與非化感水稻Lemont共培的稗草根際土壤的過氧化物酶、蛋白酶、脲酶活性均呈上升趨勢，其中蛋白酶、脲酶活性升高達到了顯著水平(P<0.05)，分別增加了1.10、1.38倍，而蔗糖酶活性顯著降低(P<0.05)，降低了53.55%.

CK-稗：單種稗草；LE-稗：稗草與Lemont共培；PI-稗：稗草與PI312777共培. 小寫字母表示在P<0.05水平的顯著性差異.圖1 與水稻共培后稗草根際土壤的酶活性Fig.1 Effect of co-culture with rice on soil enzyme activities in barnyard grass rhizosphere

2.3 根際土壤微生物碳源代謝特征(BIOLOG)分析

水稻和稗草的根際土壤微生物碳源代謝特征分析結(jié)果表明(圖2)，土壤中的微生物對碳源的利用率隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸升高.從48 h開始，與稗草共培時，非化感水稻Lemont根際土壤微生物對碳源的利用程度顯著高于化感水稻PI312777根際；而在稗草根際，與Lemont共培的稗草根際土壤微生物的碳源利用程度顯著高于單種稗草，同時也顯著高于與PI312777共培的稗草根際(P<0.05)，總體上，水稻根際土壤的AWCD高于稗草根際.

PI-稗：與PI312777共培的稗草；LE-稗：與Lemont共培的稗草；PI：與稗草共培的PI312777；LE：與稗草共培的Lemont；CK-稗：單種稗草.圖2 根際土壤碳源平均顏色變化率(AWCD)變化Fig.2 Variation on average color change rate of carbon sources in rhizosphere soil co-cultured by rice and barnyard grass

比較水稻和稗草根際土壤微生物對6大類碳源利用程度，結(jié)果表明(表3)，與稗草共培后，化感水稻PI312777根際土壤微生物對氨基酸類、糖類和酚酸類的利用程度顯著高于非化感水稻Lemont，分別高了1.53、2.46、1.75倍(P<0.05)，而多聚物類、羧酸類的利用程度顯著低于非化感水稻Lemont，分別低了41.48%、80.60%，對胺類的利用程度無顯著差異.

表3 水稻根際土壤微生物對六大碳源的利用水平1)Table 3 Utilization of 6 carbon sources by microorganism in rice rhizosphere soil

結(jié)果表明(圖3)，與單種稗草相比，化感水稻PI312777共培的稗草根際土壤微生物對氨基酸類、多聚物類、酚酸類、羧酸類的利用程度呈下降趨勢，且達到了顯著水平，分別降低了48.34%、40.49%、50.80%、47.80%，對糖類的利用率顯著升高，升高了2.08倍(P<0.05)；而與非化感水稻Lemont共培的稗草根際土壤微生物對碳源的利用率均呈上升趨勢，其中羧酸類、糖類的利用率達到了顯著水平，分別升高了1.50和3.14倍(P<0.05).兩種水稻抑草圈距離處的稗草根際土壤中的微生物對胺類碳源的利用率無顯著性差異.

CK-稗：單種稗草，LE-稗：稗草與Lemont共培；PI-稗：稗草與PI312777共培.小寫字母表示在P<0.05水平的顯著性差異.圖3 稗草根際土壤微生物對碳源的利用率Fig.3 Utilization of carbon sources by microorganisms in barnyard grass rhizosphere soil

稗草根際土壤微生物對31種碳源利用率劃分為2大成分(圖4)，主成分1(PC1)的貢獻率為59.7%，主成分2(PC2)的貢獻率為40.3%；與非化感水稻Lemont共培的稗草根際土壤微生物對碳源的利用率在PC1正端，與化感水稻PI312777共培的稗草根際土壤微生物對碳源的利用率在PC1的負(fù)端，且大多數(shù)碳源的相關(guān)系數(shù)都指向PC1正端方向.其中與PC1正相關(guān)系數(shù)最高的單一碳源為α-環(huán)式糊精、苯乙胺，而與PC1負(fù)相關(guān)系數(shù)最高的單一碳源為L-天門冬酰胺、肝糖；與PC2正相關(guān)系數(shù)最高的單一碳源為i-赤蘚糖醇、D-甘露醇，與PC2正相關(guān)系數(shù)最高的單一碳源為L-蘇氨酸和α-丁酮酸.

CK-稗：單種稗草，LE-稗：稗草與Lemont共培；PI-稗：稗草與PI312777共培.圖4 根際土壤微生物BIOLOG數(shù)據(jù)主成分分析Fig.4 Principal component analysis of rhizosphere soil microorganisms via BIOLOG

2.4 相關(guān)性分析

稗草生長指標(biāo)與稗草根際土壤微生物碳源利用的相關(guān)性分析表明(表4)，兩種水稻對12cm抑草圈處稗草的株高、鮮重、干重抑制率與多聚物類、羧酸類碳源利用率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而這些抑制率又與酚酸類碳源利用率呈顯著正相關(guān)，鮮重抑制率與氨基酸類碳源利用率呈顯著正相關(guān)，干重抑制率與糖類利用率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，同時水稻對稗草的抑制率與水稻根際土壤的過氧化物酶和蔗糖酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，與蛋白酶活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05).稗草株高與根際土壤微生物對氨基酸類碳源的利用呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與酚酸類碳源利用率呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01).同時，由于不同化感潛力水稻的抑制作用，稗草的生長(株高、地上部鮮重和地上部干重)與脲酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)系(P<0.01).

表4 水稻化感潛力及稗草生長量與水稻根際土壤酶活和微生物碳源利用的相關(guān)性1)Table 4 Correlation between rice allelopathic potential, barnyard grass growth, enzyme activity and microbial utilization of carbon source in rice rhizosphere soil

3 討論

研究表明[27]，強化感水稻PI312777對稗草的抑制效果顯著高于非化感水稻Lemon，本試驗結(jié)果也表明，化感水稻PI312777對稗草株高、鮮重、干重的抑制率顯著高于非化感水稻Lemont(表1).土壤酶參與土壤中的各類生物化學(xué)反應(yīng)[28]，田間雜草的存在和稗草種植液誘導(dǎo)對土壤酶活性和土壤微生物的影響顯著[12]，本試驗中與不同化感潛力水稻共培的稗草根際土壤酶活性存在顯著區(qū)別.水稻化感作用潛力的變化與土壤微生物的活動關(guān)系密切，化感物質(zhì)可影響微生物的生長發(fā)育，如提供營養(yǎng)物質(zhì)從而促進微生物繁殖和聚集[29-30]，同時微生物也能反作用于植物，影響化感物質(zhì)的分泌和消耗，甚至能影響化感物質(zhì)在土壤中的遷移分布[31].不同化感潛力的水稻對土壤微生物對于碳源的利用率存在顯著區(qū)別，證明不同化感潛力水稻和稗草共培可影響土壤微生物的活動.

蔗糖酶能促進土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)，與土壤有機質(zhì)含量、微生物數(shù)量相關(guān)，脲酶活性與土壤氮素循環(huán)相關(guān)[28]，化感水稻PI312777比非化感水稻Lemont能分泌更多酚酸類、黃酮類化合物[31]，土壤中酚酸含量過高會抑制土壤脲酶、蔗糖酶、蛋白酶活性[32].在本試驗中，與稗草共培的化感水稻PI312777根際土壤中的過氧化物酶、蔗糖酶、脲酶活性高于非化感水稻Lemont根際，與林瑞余等[19]關(guān)于化感水稻抑制根際土壤的過氧化物酶和脲酶活性的研究結(jié)果存在一定差異，主要因為在稗草共培條件下，化感水稻根際土壤酶的活性也會提升，與張奇等[13]稗草種植液誘導(dǎo)可提高過氧化物酶、蔗糖酶活性，降低蛋白酶活性的結(jié)論相一致.王禮科等[33]研究表明，半夏連作隨著種植年限的增加，逐漸積累2,6-二叔丁基對甲苯酚(BHT)而導(dǎo)致脲酶活性升高，在本試驗中，化感水稻根際土壤中的脲酶活性也高于非化感水稻，與其結(jié)論一致.與化感水稻PI312777共培的稗草根際土壤中蔗糖酶和脲酶活性比單種稗草顯著提高，而與非化感水稻Lemont共培的稗草根際土壤的蔗糖酶活性顯著降低，脲酶活性提高(圖1)，這可能是因為化感水稻根系分泌的化感物質(zhì)傳輸?shù)?2cm處稗草根際土壤，稗草通過提高根際土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)的吸收來部分削弱水稻的化感抑制作用，此結(jié)論還需進一步證實.相關(guān)性分析表明，在抑草圈種植模式下，水稻對稗草的抑制率與水稻根際土壤的過氧化物酶和蔗糖酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，與蛋白酶活性呈顯著正相關(guān)，稗草的生長與稗草根際土壤的脲酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，這些結(jié)果表明，化感水稻根系分泌的化感物質(zhì)會同時影響化感作用供體和受體植株根際土壤的酶活，這些酶活性也會影響供體對受體的化感潛力.

一些植物釋放的化學(xué)物質(zhì)能夠抑制土壤微生物[34]，本試驗通過BIOLOG微平板分析表明，受到12cm抑草圈距離生長的稗草影響，化感水稻PI312777根際土壤碳源AWCD低于非化感水稻Lemont根際土壤(圖2)，表明化感水稻在土壤中分泌的一些化感物質(zhì)抑制了土壤微生物的生長和聚集，這與張奇等[11]的研究結(jié)果存在差異，可能是由于土壤環(huán)境較復(fù)雜，稗草在土壤中生長脅迫與直接添加稗草根系分泌物存在差異所導(dǎo)致.也有研究表明[35]，通過BIOLOG分析外源添加一定量的百合自毒物質(zhì)鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和2,4-二叔丁基苯酚(2,4-DTBP)，土壤碳源AWCD顯著下降，此結(jié)果與本試驗結(jié)果一致.化感水稻根系分泌的化感物質(zhì)會在土壤中積累，并與土壤中的微生物產(chǎn)生非常復(fù)雜的作用[36]，稗草根際對非糖類碳源的利用率均表現(xiàn)出與非化感水稻Lemont共培的高于單種稗草，也高于強化感水稻PI312777共培組(圖3)，這也意味著水稻分泌的化感物質(zhì)可能抑制了水稻和稗草根際土壤微生物的繁殖和活動.相關(guān)性分析表明，水稻對于稗草的抑制率與多聚物、羧酸類碳源的利用率呈顯著的負(fù)相關(guān)(表4)，這與張奇等[11]的研究存在一定差異，可能是水稻在抑制稗草生長時消耗了多聚物和羧酸類物質(zhì)，但稗草抑制率與酚酸類碳源利用率呈顯著正相關(guān)(表4)的結(jié)果是一致的，同時稗草的生長與其根際土壤中微生物對酚酸類碳源利用呈負(fù)相關(guān)，這些結(jié)果暗示水稻根系分泌的酚酸類化感物質(zhì)會同時影響供體和受體植株根系土壤中微生物種群的多樣性，進而影響受體植株的生長.在后續(xù)研究中，可以對此類利用酚酸類碳源的微生物進行篩選和確定，通過增加微生物活動提高水稻的抑草潛力.

水稻和稗草共培影響化感作用供體和受體植株根際的土壤酶活性和土壤微生物種群，在水稻周圍生長的稗草影響水稻根際的土壤酶活性與土壤微生物，同時水稻分泌化感物質(zhì)抑制稗草的生長，也影響著稗草根際土壤的酶活性和微生物群落，這為通過影響土壤微生物群落和酶活性，改變土壤微生態(tài)環(huán)境，進而控制農(nóng)田雜草，減少化學(xué)除草劑的使用提供了一定的參考意義.但稗草根際與水稻根際土壤中化感物質(zhì)與微生物的互作機制較為復(fù)雜，目前研究報道，黃酮類、酚酸類物質(zhì)能有效影響土壤細菌和真菌的聚集，但是具體還有哪類化感物質(zhì)起作用，影響哪類土壤微生物群落改變還有待于進一步研究.