基于ISSR分子標(biāo)記的楓香遺傳多樣性分析

黃 敏, 黃旭萍, 陳孝丑, 吳明晶, 翁建宇, 陳發(fā)興

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院， 福建 福州 350007；2.福州植物園， 福建 福州 350012；3.福建省將樂國有林場， 福建 三明 353300)

楓香(LiquidambarformosanaHance)為金縷梅科楓香樹屬落葉喬木，主要分布于秦嶺和淮河以南，且為福建省重要的鄉(xiāng)土彩葉樹種，常用于行道綠化和園林建設(shè)等[1-2].楓香樹不僅具有觀賞價值[3-4]、經(jīng)濟價值[5]和藥用價值[6-7]，還能消除有害氣體，改善氣體環(huán)境[8].

彩葉樹種對于城市景配色和美麗鄉(xiāng)村建設(shè)具有重要意義，目前我國彩葉樹種品種較少.根據(jù)國外城市園林發(fā)展法[9]，我國未來對種苗的需求必然會轉(zhuǎn)向特色種苗，這將促進彩葉樹種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.而楓香不僅色彩鮮艷、葉子美觀，而且用途廣泛、經(jīng)濟效益高，具有良好的發(fā)展前景.ISSR分子標(biāo)記的主要特點是可以在目標(biāo)靶標(biāo)序列未知的條件下使用，擁有條帶清晰明亮、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性強、重復(fù)性好、簡便易于操作、價格比較低廉、產(chǎn)物特異性強等優(yōu)點[10]，已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析[11-13]、種質(zhì)資源的保護與鑒定[14]、遺傳結(jié)構(gòu)[15]等研究.林驥光等[16]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對12份楓香種質(zhì)資源進行分析，其中4號樣本和11號樣本的遺傳相似度最高.畢泉鑫等[17]對浙江省自然種群楓香進行遺傳多樣性研究，將5個居群分為兩大類群.對楓香種質(zhì)資源的研究主要集中在繁殖技術(shù)[18-19]、造林[20]和材質(zhì)[21]等，而對彩葉觀賞樹種的遺傳關(guān)系研究較少.本試驗利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對來自福建、江西和安徽3個省份的137份彩葉觀賞價值高的楓香樣品進行親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析，探索不同居群間楓香的親緣關(guān)系，并從分子水平分析不同居群楓香的遺傳特點，為彩葉楓香種質(zhì)資源的收集和優(yōu)良彩葉觀賞價值新品種的選育提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從福建省三明市將樂國有林場收集到的4 178株楓香種質(zhì)資源中，選出137份秋季呈色良好的楓香種質(zhì)，樣品編號如表1.對選中單株的東南西北4個方位各取一個枝條作標(biāo)記，從枝條頂端往下數(shù)第4片葉片，采集健康楓香嫩葉，放在裝有冰袋的采樣貯藏箱中保存.用超純水將葉片表面所帶的污染物洗干凈后晾干，去除主要葉脈并剪碎后裝入離心管，放在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

表1 137份楓香樣品信息Table 1 Information of 137 L.formosana samples

續(xù)表1

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑包括高效植物基因組DNA提取試劑盒、氯仿、異戊醇、β-巰基乙醇、乙醇、緩沖液A、Goldview核酸染料、Mark DL2000和2×Taq Master Mix、異丙醇.主要儀器設(shè)備包括YMY組織研磨儀(浙江托普儀器公司產(chǎn)品)、2-16KL低溫冷凍離心機(美國密理博公司產(chǎn)品)、DK-S28恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備公司產(chǎn)品)、VORTEX-KB3旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造公司產(chǎn)品)、NanoDrop One超微量紫外可見光光度計(上海土森視覺科技有限公司產(chǎn)品)、T100梯度PCR儀(北京楚齊儀表有限公司產(chǎn)品)和Wide Mini-sub cell GT水平電泳槽(濟南好來寶醫(yī)療器材有限公司產(chǎn)品).

1.3 試驗方法

提取楓香基因組DNA采用改良的十六烷基三甲基溴化銨方法[22]，所提取的楓香DNA用超微量紫外可見光光度計檢測純度(D260 nm/D280 nm)，并用瓊脂糖凝膠電泳來檢測所提取楓香DNA的質(zhì)量.將光密度為1.7～2.0的楓香葉片DNA進行ISSR-PCR擴增.用質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳(110 V，30～40 min)檢測DNA片段大小和質(zhì)量.使用1×TAE電泳緩沖液(DNA樣品與loading buffer體積比為5∶1)進行點樣，計算出濃度后進行稀釋，用于后續(xù)試驗.

ISSR-PCR擴增反應(yīng)體系[23](20 μL)：模板DNA濃度為20 ng，Taq Master Mix用量為10 μL，引物濃度為0.6 μmol·L-1，ddH2O 7.8 μL.PCR反應(yīng)擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s.選用本試驗室已篩選出的17條引物及退火溫度[23](表2)，退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.ISSR-PCR的擴增產(chǎn)物利用質(zhì)量分數(shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳(110 V，30～40 min)，成像并保存在Gel DocTM XR凝膠成像系統(tǒng)中.

表2 適合楓香ISSR-PCR擴增的17條ISSR引物的最適退火溫度及多態(tài)性Table 2 Optimal annealing temperature for ISSR-PCR amplification of L.formosana and polymorphism of 17 ISSR primers

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)擴增條帶，記錄200～2 000 bp的清晰條帶.對同一引物的擴增條帶，擴增陽性記為1，擴增陰性記為0，用Excel表格建成0～1數(shù)據(jù)矩陣.用Popgene 32軟件進行親緣關(guān)系分析，用SPSS 19軟件對各遺傳系數(shù)的顯著性進行分析.利用NTSYS 2.1軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計算樣品間的相似系數(shù)，并進行非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean, UPGMA)遺傳相似度聚類分析，繪制137份樣品和6個居群的遺傳聚類圖.用iTOL美化遺傳聚類圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的質(zhì)量檢測

本試驗所采用的楓香DNA的光密度均為1.7～2.0.電泳檢測結(jié)果如圖1所示，條帶明亮、整齊、無污染，說明所提取的樣品較好，可用于后續(xù)試驗.

M為15 000 bp的DNA 分子標(biāo)記量，1～20分別為DT38、DT46、DT36、AH6、AH58、AH63、AH66、AH43、JL59、NJ3、NJ4、NJ8、NJ9、NJ10、NJ24、NJ20、NJ13、JL50、GZ39、GZ51樣品編號.圖1 部分楓香種質(zhì)資源DNA提取的電泳效果Fig.1 Electropherogram of DNA extracted from some L.formosana germplasm resources

2.2 同一居群內(nèi)楓香種質(zhì)資源的親緣關(guān)系

對6個居群137份楓香材料之間的遺傳距離和遺傳一致度進行計算，結(jié)果表明：137份樣品間的遺傳一致度為0.350 0～0.922 2，遺傳距離為0.081 0～1.049 8.

從表3可知，同一安徽祁門居群內(nèi)樣品的遺傳一致度為0.377 8～0.905 6，平均值為0.625 7；遺傳距離為0.099 2～0.973 4，平均值為0.489 9.AH3和AH4的遺傳一致度最高(0.905 6)，相對應(yīng)的遺傳距離最近(0.099 2)，說明兩者的親緣關(guān)系最近；AH2和AH6的遺傳一致度最低(0.377 8)，遺傳距離最遠(0.973 4)，說明兩者的親緣關(guān)系最遠.

表3 6個楓香群體內(nèi)的遺傳距離與遺傳一致度Table 3 Genetic distance and genetic identity within 6 L.formosana populations

同一福建大田居群內(nèi)樣品的遺傳一致度為0.383 3～0.888 9，平均值為0.603 2；遺傳距離為0.117 8～0.958 9，平均值為0.522 8.DT8和DT42的遺傳一致度最高(0.888 9)，相對應(yīng)的遺傳距離最近(0.117 8)，說明兩者親緣關(guān)系最近；DT15和DT36的遺傳一致度最低(0.383 3)，相對應(yīng)的遺傳距離最遠(0.958 9)，說明兩者的親緣關(guān)系最遠.

后期時，因經(jīng)歷與北方異族作戰(zhàn)，盟中人數(shù)驟然減少，風(fēng)氣也更為自由。盟主時常一年輪換一次，也不必特意召開比武大會。而是由現(xiàn)任盟主與選好的下任盟主對打一次，儀式性居多，其結(jié)果必定是現(xiàn)任盟主（或真或假的）落敗，隨后新任盟主上任。

同一福建南靖居群內(nèi)樣品的遺傳一致度為0.427 8～0.905 6，平均值為0.6591；遺傳距離為0.099 2～0.849 2，平均值為0.426 5.NJ11和NJ16的遺傳一致度最高(0.905 6)，相對應(yīng)的遺傳距離最近(0.099 2)，說明兩者親緣關(guān)系最近；NJ13和NJ18的遺傳一致度最低(0.427 8)，相對應(yīng)的遺傳距離最遠(0.849 2)，說明兩者的親緣關(guān)系最遠.

同一福建光澤居群內(nèi)樣品的遺傳一致度為0.416 7～0.922 2，平均值為0.628 2；遺傳距離為0.081 0～0.875 5，平均值為0.483 2.GZ54和GZ51的遺傳一致度最高(0.922 2)，相對應(yīng)的遺傳距離最近(0.081 0)，說明兩者親緣關(guān)系最近；GZ41和GZ4的遺傳一致度最低(0.416 7)，相對應(yīng)的遺傳距離最遠(0.875 5)，說明兩者親緣關(guān)系最遠.

同一福建將樂居群內(nèi)樣品的遺傳一致度為0.438 9～0.911 1，平均值為0.642 1；遺傳距離為0.093 1～0.823 5，平均值為0.459 8.JL18和JL19的遺傳一致度最高(0.911 1)，相對應(yīng)的遺傳距離最近(0.093 1)，說明兩者親緣關(guān)系最近；JL27和JL50的遺傳一致度最低(0.438 9)，相對應(yīng)的遺傳距離最遠(0.823 5)，說明兩者親緣關(guān)系最遠.

同一江西永豐居群內(nèi)樣品的遺傳一致度為0.650 0～0.900 0，平均值為0.811 7；遺傳距離為0.105 4～0.430 8，平均值為0.211 4.JX4和JX16的遺傳一致度最高(0.900 0)，相對應(yīng)的遺傳距離最近(0.105 4)，說明兩者親緣關(guān)系最近；JX20和JX19的遺傳一致度最低(0.650 0)，相對應(yīng)的遺傳距離最遠(0.430 8)，說明兩者親緣關(guān)系最遠.

2.3 不同居群間楓香種質(zhì)資源的親緣關(guān)系

從表3可知，6個居群中，江西永豐的樣品表現(xiàn)為平均遺傳一致度最高(0.811 7)，相對應(yīng)的遺傳距離最近(0.211 4)；福建大田的樣品表現(xiàn)為平均遺傳距離最遠(0.522 8)，相對應(yīng)的平均遺傳一致度最低(0.603 2).GZ45和DT36來自不同居群，遺傳距離最遠，相對應(yīng)的遺傳一致度最低，說明兩者的親緣關(guān)系較遠.GZ51和GZ54來自相同的居群，遺傳距離最近(0.081 0)，相對應(yīng)的遺傳一致度最高(0.922 2)，說明兩者的親緣關(guān)系最近.

從表4、5可知，6個楓香居群的遺傳一致度為0.832 8～0.971 1，遺傳距離為0.029 4～0.182 9，福建大田和安徽祁門的遺傳一致度最高(0.971 1)，其對應(yīng)的遺傳距離最近(0.029 4)，說明兩者親緣關(guān)系最近；福建南靖和江西永豐的遺傳一致度最低(0.832 8)，其對應(yīng)的遺傳距離最遠(0.182 9)，說明兩者親緣關(guān)系最遠.

表4 楓香居群間的遺傳距離Table 4 Genetic distance among L.formosana populations

表5 楓香居群間的遺傳一致度Table 5 Genetic identity among L.formosana populations

2.4 楓香的遺傳多樣性

對137份楓香種質(zhì)資源的總體遺傳多樣性參數(shù)進行分析，結(jié)果如表6所示.從表6可知，平均等位基因數(shù)為2.000 0，平均有效等位基因數(shù)為 1.656 7，平均遺傳多樣性指數(shù)為0.378 8，平均Shannon信息多樣性指數(shù)為 0.559 0，說明供試的137份楓香樣品間的遺傳多樣性較為豐富.

表6 居群內(nèi)楓香種質(zhì)資源的遺傳多樣性參數(shù)分析1)Table 6 Genetic diversity parameters of L.formosana germplasm resource within single population

對6個居群內(nèi)楓香種質(zhì)資源進行遺傳多樣性參數(shù)分析，結(jié)果如表6所示.從表6可知，6個居群的等位基因數(shù)為1.511 1～1.977 8，平均等位基因數(shù)為1.638 9；有效等位基因數(shù)為1.306 4～1.645 5，平均有效等位基因數(shù)為1.506 0；Nei′s基因多樣性指數(shù)為0.177 7～0.371 9，平均基因多樣性指數(shù)為0.293 0；Shannon指數(shù)為0.265 7～0.508 6，平均Shannon指數(shù)為0.435 1；多態(tài)位點百分率為51.11%～97.78%，平均多態(tài)位點百分率為80.56%；多肽為點數(shù)為92～176，平均多態(tài)為點數(shù)為145.平均等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei′s基因多樣性指數(shù)、Shannon指數(shù)、多態(tài)位點數(shù)和多態(tài)位點百分率均表現(xiàn)為福建大田居群最高，江西永豐最低.總體來說，在6個居群中福建大田的遺傳多樣性高于其他5個居群.

對6個居群間楓香種質(zhì)資源的遺傳多樣性參數(shù)差異性進行分析，結(jié)果表明，等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei′s基因多樣性指數(shù)、Shannon指數(shù)、多態(tài)位點百分率、多態(tài)位點數(shù)在江西居群樣品與其余5個種源地中均有顯著性差異(P<0.05)；在福建南靖與福建將樂居群中均無顯著性差異(P<0.05).安徽祁門、福建大田、福建光澤種質(zhì)的等位基因數(shù)分別與福建南靖、福建將樂的均有顯著性差異(P<0.05)；福建大田種質(zhì)的Nei′s基因多樣性指數(shù)、Shannon指數(shù)與福建南靖、福建將樂的均有顯著性差異(P<0.05)；福建大田、福建南靖、福建光澤間多態(tài)位點百分率、多態(tài)位點數(shù)均有顯著性差異(P<0.05).相對于遺傳多樣性最高的福建大田居群來說，遺傳多樣性最低的江西永豐居群的等位基因數(shù)少了23.6%，有效等位基因數(shù)少了20.61%，基因多樣性指數(shù)降低了52.22%，Shannon指數(shù)降低了51.62%，多態(tài)位點數(shù)少了47.73%.

M為DL 2 000 DNA 分子標(biāo)記量，1～24號為部分樣品的擴增條帶.圖2 引物UBC-834與部分樣品的擴增結(jié)果Fig.2 Amplification results of some L.formosana samples using primer UBC834

2.5 楓香遺傳分化

楓香的總遺傳分化系數(shù)為0.146 3，表明楓香85.7%的遺傳分化在居群內(nèi)，14.63%的遺傳分化在居群間.6個楓香居群基因流較大(2.916 5>1)，說明不同楓香居群之間的基因交流未受到影響.對6個楓香居群間和居群內(nèi)的遺傳差異分析結(jié)果表明，居群內(nèi)部個體間遺傳多樣性僅是0.319 0，居群間的遺傳多樣性為0.373 7.

2.6 UPGMA聚類分析

從圖3可看出，當(dāng)遺傳相似系數(shù)達到0.92時，將6個居群分為3個大類，第1類包括兩個亞群，其中一個亞群包括安徽祁門、福建大田和福建光澤居群，另外一個亞群包括福建南靖居群；第2大類包括福建將樂居群；第3類包括江西永豐居群.

圖3 6個群居楓香樹的UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA cluster map of 6 populations of L.formosana

從圖4可看出，當(dāng)遺傳相似系數(shù)達到0.62時，將137份楓香材料分為4個大類：第1類包括1份；第2類有兩個亞群，一個亞群包括45份，另外一個亞群包括24份；第3類包括兩個亞群；第4類包括兩個亞群，一個亞群有41份，另外一個亞群有24份.

3 討論與結(jié)論

環(huán)境的變化和植物本身內(nèi)在因素都可能會對遺傳多樣性造成影響，如外部的氣候、溫度和內(nèi)部基因突變、基因流等[23].本試驗中平均多態(tài)位點百分率為80.56%，表明ISSR是一種楓香親緣關(guān)系鑒定的有效技術(shù)手段.137份楓香種質(zhì)資源遺傳多樣性高于林驥光[16]和畢泉鑫等[17]對浙江楓香種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究結(jié)果.本試驗中，安徽祁門和福建大田居群間的親緣關(guān)系最近，據(jù)觀察兩個居群的楓香葉片葉型相似度較高，說明分子標(biāo)記可以作為葉片表型分類的輔助手段.楓香居群間的遺傳一致度相較于居群內(nèi)表現(xiàn)為較高且范圍較小，遺傳距離相較于居群內(nèi)表現(xiàn)為較近且范圍較小，說明楓香居群間有一定的遺傳多樣性.但是相對于單株來說遺傳多樣性較低，植物的交配方式會影響植物的群居結(jié)構(gòu)[17]，自交的物種遺傳多樣性主要存在于種群間，異交物種則以種群內(nèi)為主[25]，Sun[26]和李芳芳等[22]對楓香的研究結(jié)果表明居群內(nèi)遺傳分化顯著高于居群間，而本研究中85.7%的遺傳分化在楓香居群內(nèi)，顯著高于居群間的遺傳分化，與其研究結(jié)果一致.一般認為基因流大于1，可以阻止遺傳漂變產(chǎn)生遺傳分化[27].本研究中基因流較大(2.916 5>1)，說明居群間基因交流豐富，影響了楓香居群間的遺傳分化,這與在李芳芳[22]的研究結(jié)果一致.

圖4 137份楓香樹的UPGMA聚類圖Fig.4 UPGMA cluster map of 137 L.formosana germplasm resources

在遺傳相似系數(shù)為0.92時，將6個居群分為3類，第1類為安徽祁門、福建大田、福建光澤和福建南靖居群，第2類為福建將樂居群，第3類為江西永豐居群.第1類中安徽居群和福建的3個居群在地理位置上差異較大，卻被聚為一類，說明安徽居群的楓香種質(zhì)對環(huán)境的適應(yīng)性強，受環(huán)境的影響小.第2類福建將樂居群生長狀態(tài)好，葉片色彩豐富且光澤度.，可能是因為福建將樂居群楓香種質(zhì)為本地種質(zhì)，對生長環(huán)境適應(yīng)，也可能是因為楓香自身內(nèi)部的基因在調(diào)控.第3類江西居群單獨成類.從實地考察來看，江西居群的楓香種質(zhì)生長狀態(tài)差、葉片不易變色且落葉期過早，說明江西居群的楓香種質(zhì)對環(huán)境的適應(yīng)性弱，受環(huán)境的影響大.