帶魚蛋白抗菌肽抑菌效果的影響因素

李遠(yuǎn)慧，鄭霖波，謝超，鄭煒

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316022；2.舟山市常青海洋食品有限公司，浙江 舟山 316021）

帶魚（Trichiurus lepturu），在各地區(qū)[1]尤其沿海城市[2]海洋漁業(yè)的發(fā)展中，都占據(jù)重要位置[3]。帶魚的肉質(zhì)口感滑嫩，深受人們的喜愛[4]。帶魚富含蛋白質(zhì)和脂肪，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為17.57%、5.16%[5]。帶魚還含有各種人體所必需的氨基酸，具有抗癌、降低血脂和膽固醇等功能；同時(shí)因帶魚中不飽和脂肪酸含量高，其營(yíng)養(yǎng)成分能夠較好地被人體吸收。

抗菌肽(antibacterial peptide)是一種抗生素肽[6]，在生物體中普遍存在，具有免疫效果，有阻止病原微生物入侵生物體的作用[7]。抗菌肽可構(gòu)成生物體內(nèi)的天然保護(hù)屏障，這使其具有抑制病毒、真菌、細(xì)菌等微生物繁殖的功能[8]，深入研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在抗菌肽作用下會(huì)生長(zhǎng)和擴(kuò)散減緩甚至死亡[9]，抗菌肽的優(yōu)點(diǎn)有抗菌范圍大、肽種類繁多、抗菌機(jī)理獨(dú)一、產(chǎn)生耐藥性的幾率低等，可在一定程度上代替青霉素等抗生素對(duì)生物體的作用[10]，可用于食品業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)[11]。

大部分抗菌肽在一定程度的高溫處理后，仍然可以表現(xiàn)出較好的抑菌性，也有的抗菌肽在進(jìn)入人體后，由于消化系統(tǒng)具有酶解作用，抗菌肽的抑菌性可能會(huì)發(fā)生改變[12]。有研究發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶對(duì)牙鲆不同組織的抗菌粗提物的抑菌性有一定的促進(jìn)效果[13]。這說明經(jīng)過胰蛋白酶處理后，抗菌肽很有可能會(huì)產(chǎn)生一些抑菌效果更強(qiáng)的新組分。帶魚蛋白抗菌肽營(yíng)養(yǎng)組成豐富且均衡，抑菌效果良好，在食品添加劑行業(yè)具有很好的前景。但在食品加工、貯藏等環(huán)節(jié)，一些不可避免的因素（高溫、pH值、金屬效應(yīng)等）會(huì)使抗菌肽的抑菌性能發(fā)生改變。本文主要研究帶魚蛋白抗菌肽的抑菌性，及其抑菌性在不同溫度、pH值、胰蛋白酶、β-內(nèi)酰胺酶、凍融次數(shù)和金屬離子條件下的穩(wěn)定性，為帶魚蛋白抗菌肽的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

舟山帶魚：市售。

胃蛋白酶（200 000 U/g）、胰蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g）、β-內(nèi)酰胺酶（200 000 U/g）：北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀-HCl、氯化鈉、氯化鋅、青霉素、氯化鈣、硫酸亞鐵、三氯化鐵、氯化鎂（均為分析純）：天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

高速組織搗碎機(jī)（JJ-2）：常州方科儀器有限公司；智能生化培養(yǎng)箱（BPC-70F）：上海一恒儀器有限公司；離心機(jī)（TD4C）：前沿科技有限公司；海爾冰柜（BD-203HTD）：青島海爾集團(tuán)；電子分析天平（FA1004）、電熱恒溫水浴鍋（HWS）、水浴恒溫振蕩器（ZD-85A）：浙江力辰儀器科技有限公司；攪拌機(jī)（M-402028-IKA）：北京海富達(dá)科技有限公司；pH計(jì)（PHS-25）：上海越平儀器有限公司；鼓風(fēng)干燥箱（DHG）：上海尚儀儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1D）：蘇州凈化科技有限公司；紫外分光光度計(jì)（752G）：上海榮惠儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理

取冷凍舟山帶魚，流動(dòng)水解凍后人工去除頭部和內(nèi)臟，清洗干凈，將其置于高速組織搗碎機(jī)中攪碎，得到帶魚魚糜，按每100 g分裝于保鮮袋中，置于-20℃下貯藏。

1.2.2 帶魚抗菌肽的制備

將冷凍帶魚魚糜在流動(dòng)水下解凍，取10 g帶魚魚糜加入到100mL蒸餾水中，溶解攪勻，調(diào)節(jié)至蛋白酶的最適酶解pH值和溫度，加入0.2g/100mL的蛋白酶[14]，為酶解完全將溶液放入攪拌機(jī)中攪拌10 min～15 min，放入80 r/min搖床中酶解[15]。酶解完成后將酶解液進(jìn)行滅酶處理（電熱恒溫水浴，95℃～100℃，20 min）。取滅酶后酶解液進(jìn)行離心處理（4℃，8 000 r/min，15 min），取中間澄清液，于-20℃冷凍保藏。

1.2.3 抑菌率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]中的光密度法，并稍作改動(dòng)。各蛋白酶解液用0.22 μm濾膜過濾后，調(diào)節(jié)成一致濃度，各取2 mL，加入10 mL肉湯液體培養(yǎng)基中，并和200 μL大腸桿菌（107CFU/mL）混合均勻，37℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)定吸光值（570 nm波長(zhǎng)）記為A樣品。不加大腸桿菌且其他條件一致的為空白樣品，測(cè)定吸光值記為A空樣；對(duì)照樣品為相同量的肉湯液體培養(yǎng)基加入2 mL滅菌生理鹽水和200 μL大腸桿菌，測(cè)定其吸光值記為A對(duì)照。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行測(cè)定，抑菌率計(jì)算公式如下。

1.2.4 酶的篩選

根據(jù)前期研究結(jié)果[17]，選擇胃蛋白酶∶木瓜蛋白酶（體積比）=1∶1為復(fù)合酶制劑，以最佳酶解條件進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[12]，最佳酶解條件見表1。

表1 酶解條件Table 1 Conditions of enzymatic hydrolysis

1.2.5 帶魚蛋白抗菌肽抑菌效果的影響因素

1.2.5.1 熱穩(wěn)定性

將抗菌肽酶解液于溫度為 70、80、90、100、121 ℃的烘箱中進(jìn)行加熱處理，加熱時(shí)間為30 min，取出后放置至室溫。將未經(jīng)過加熱處理的抗菌肽抗菌效力做為對(duì)照組，其抑菌率記為100%，測(cè)定處理后各組抗菌肽的抑菌率。

1.2.5.2 pH耐受性

將抗菌肽酶解液加入鄰苯二甲酸氫鉀-HCl調(diào)節(jié)pH 值，獲得 pH 值為 2.8、3.8、4.8、5.8、6.8、7.8、8.8、9.8的相同質(zhì)量濃度（100 mg/mL）的抗菌肽溶液。將抗菌肽溶液靜置1 h（室溫），測(cè)定各組的抑菌率。

1.2.5.3 胰蛋白酶穩(wěn)定性

將抗菌肽酶解液分成相同質(zhì)量的若干份，部分加入等質(zhì)量濃度為0.25%胰蛋白酶150 μL，在37℃水浴鍋中分別酶解 1、2、3、4、5 h；酶解結(jié)束后進(jìn)行滅酶處理，95℃加熱15 min，測(cè)定各組分酶解液抑菌率。對(duì)照組為未經(jīng)胰蛋白酶處理的抗菌肽酶解液，其抑菌率記為100%。

1.2.5.4 β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性

取相同質(zhì)量濃度的青霉素和抗菌肽酶解液若干份，部分加入等質(zhì)量濃度的β-內(nèi)酰胺酶150μL，在37℃中水浴1 h進(jìn)行酶解，當(dāng)酶解過程完成，95℃水浴加熱15 min，測(cè)定各組分酶解液抑菌率。

1.2.5.5 對(duì)反復(fù)凍融的穩(wěn)定性

將抗菌肽酶解液分成相同質(zhì)量的若干份，在-18℃的冰柜中冷凍，取出后再用流動(dòng)水解凍。每次冷凍確保中心溫度達(dá)到-18℃方可取出進(jìn)行解凍，解凍后測(cè)定抗菌肽酶解液的抑菌率，凍融次數(shù)為1次～6次。對(duì)照組為未進(jìn)行冷凍的抗菌肽酶解液，其抑菌率記為100%。

1.2.5.6 對(duì)金屬離子的穩(wěn)定性

配制 0.04 mol/L Na+、K+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Fe3+7種金屬離子溶液[18]，與等體積的抗菌肽酶解液混合，在室溫中靜置3 h，充分反應(yīng)后測(cè)定每個(gè)組分的抑菌率。以未與金屬離子混合的組分為對(duì)照組，其抑菌率記為100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組樣品均進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，用Excel軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽的熱穩(wěn)定性

因?yàn)榇娣趴咕臅r(shí)，會(huì)不可避免地遇到高溫高熱的情況，所以研究抗菌肽的熱耐受性是十分必要的。各溫度下抗菌肽抗菌效力結(jié)果如圖1所示。

圖1 抗菌肽的熱穩(wěn)定性Fig.1 Thermal stability of antimicrobial peptide

通過分析圖1可得，隨著溫度的升高，抗菌肽的抑菌率先增大后減小。在70℃～90℃范圍內(nèi)，溫度對(duì)抗菌肽的抗菌效果影響較?。╬＞0.05），在90℃時(shí)抗菌肽的抑菌率相對(duì)于對(duì)照組依然有97.26%，而當(dāng)溫度上升至121℃時(shí)抑菌率只有86.43%，原因可能是在100℃以上的高溫條件下，部分有抗菌效果的肽鏈被破壞，導(dǎo)致抗菌效力下降?？偟膩碚f，各組分在高溫處理后抑菌率能夠保持在85%以上，表明抗菌肽的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，能夠適應(yīng)較高的溫度而不失去抗菌活性。

2.2 抗菌肽的pH值耐受性

抗菌肽在一系列過程中會(huì)接觸到不同的pH值環(huán)境，因此研究在不同pH值環(huán)境下抗菌肽的抑菌率是否會(huì)改變是十分必要的?？咕牡膒H值耐受性試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 抗菌肽的pH值耐受性Fig.2 pH tolerance of antimicrobial peptide

pH值溶液本身對(duì)指示菌沒有抑菌效果，所以可以推斷抗菌肽的抑菌率變化是因?yàn)榄h(huán)境pH值的變化引起的。從圖2中可以看出，抗菌肽的抑菌率隨著pH值的增加出現(xiàn)了先增大后減小再增大的趨勢(shì)，最大抑菌率是在pH值為4.8時(shí)，為45.12%；之后隨pH值繼續(xù)增大，抗菌肽抑菌率下降，在pH值為8.8時(shí)出現(xiàn)最低值40.08%。

2.3 抗菌肽對(duì)胰蛋白酶的穩(wěn)定性

作為人體消化道中的主要蛋白酶，胰蛋白酶在人體進(jìn)行消化時(shí)起到重要的作用，所以研究抗菌肽的胰蛋白酶穩(wěn)定性具有現(xiàn)實(shí)意義。胰蛋白酶酶解不同時(shí)間對(duì)抗菌肽抑菌率的影響見圖3。

圖3 抗菌肽對(duì)胰蛋白酶的穩(wěn)定性Fig.3 Stability of antimicrobial peptide to trypsin

從圖3中可以看出在酶解較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，抑菌率出現(xiàn)小幅度的上升，可能是因?yàn)橐鹊鞍酌笇儆谧鍖Ｒ恍悦福瑢Ｒ粸閷?duì)堿性氨基酸一端進(jìn)行水解[19]，水解后出現(xiàn)的肽鏈也存在抗菌效力，對(duì)總體的抑菌率有正向作用?？傮w而言各組分之間的抑菌率差別不大，說明胰蛋白酶對(duì)抗菌肽幾乎沒有影響（p＞0.05），抗菌肽有較強(qiáng)的胰蛋白酶穩(wěn)定性。

2.4 抗菌肽對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，β-內(nèi)酰胺類抗生素是醫(yī)學(xué)使用較多的抗生素[20]，很多致病菌由于長(zhǎng)期使用此類抗生素，已經(jīng)出現(xiàn)了耐藥性，就是因?yàn)榧?xì)菌內(nèi)出現(xiàn)了β-內(nèi)酰胺酶[21]。此類酶的產(chǎn)生，使β-內(nèi)酰胺類抗生素被破壞，從而喪失了一定的抗菌效果[22]。β-內(nèi)酰胺酶對(duì)抗菌肽的抑菌率影響見圖4。

圖4 抗菌肽對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性Fig.4 Stability of antimicrobial peptide to β-lactamase

分析圖4可以得出，抗菌肽和抗菌肽+β-內(nèi)酰胺酶組的抑菌率無顯著差異，但經(jīng)過β-內(nèi)酰胺酶處理后，青霉素的抑菌率出現(xiàn)了大幅度的下降，可以證明該酶在試驗(yàn)中起到了水解β-內(nèi)酰胺環(huán)的作用，導(dǎo)致青霉素失去抑菌活性。而抗菌肽的抗菌效果沒有被抑制，依然保持了原有的抗菌效果，說明抗菌肽的有效抗菌組分不包含β-內(nèi)酰胺環(huán)，因此不受β-內(nèi)酰胺酶影響，抗菌肽有較強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性。

2.5 抗菌肽在不同凍融次數(shù)下的穩(wěn)定性

在食品的保藏過程中，低溫凍藏是非常有效的一種保存方式。在反復(fù)凍融過程中，蛋白質(zhì)的構(gòu)型會(huì)發(fā)生變化，可能會(huì)失去原有的活性[23]。凍融次數(shù)對(duì)抗菌肽抑菌率的影響見圖5。

圖5 抗菌肽在不同凍融次數(shù)下的穩(wěn)定性Fig.5 Stability of antimicrobial peptides at different freeze-thaw times

從圖5中可以得出，反復(fù)凍融使抗菌肽的抑菌率呈下降的趨勢(shì)，在凍融了6次以后，抑菌率下降到了90.28%，但大部分具有抗菌活性的肽鏈形態(tài)不受影響（p＞0.05）。

2.6 抗菌肽對(duì)金屬離子的穩(wěn)定性

由于食品加工需要經(jīng)過多道程序步驟，在加工包裝過程中不可避免地會(huì)接觸到不同的金屬離子，因此有必要對(duì)抗菌肽的金屬離子穩(wěn)定性進(jìn)行討論。試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 抗菌肽對(duì)金屬離子的穩(wěn)定性Fig.6 Stability of antimicrobial peptide to metal ions

由圖6可知，當(dāng)抗菌肽與 Na+、K+、Ca2+、Mg2+接觸作用時(shí)，抑菌率并沒有被影響（p＞0.05），依舊保持了原有的抑菌活性，對(duì)這些金屬離子保持了很高的穩(wěn)定性。當(dāng)抗菌肽被Zn2+接觸作用后，抑菌率下降到86.25%，而接觸到Fe2+和Fe3+時(shí)則下降得更多，分別為76.38%、74.97%，抑菌率出現(xiàn)了較大幅度的下降。

3 討論

抗菌肽在生產(chǎn)中，受到多種環(huán)境因素的影響，例如高溫環(huán)境、酸堿度、人和動(dòng)物口腔、胃、腸道內(nèi)的蛋白酶，反復(fù)凍融以及金屬離子等方面，故本文從以上幾個(gè)方面研究帶魚蛋白抗菌肽的穩(wěn)定性。

研究表明，電荷是決定抗菌肽生物活性的重要因素，細(xì)菌細(xì)胞膜一般帶負(fù)電荷，而抗菌肽帶正電荷，當(dāng)環(huán)境pH值發(fā)生變化時(shí)，會(huì)改變電荷的分布情況，進(jìn)而對(duì)抗菌肽的活性產(chǎn)生影響[24]。當(dāng)電荷發(fā)生改變時(shí)，抗菌肽的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，進(jìn)而改變抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜之間的作用，使抗菌效力也發(fā)生了改變[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)[27]，在酸性pH值條件下，肽強(qiáng)烈干擾細(xì)菌膜的陰離子脂質(zhì)成分，引起細(xì)菌溶解，抗菌肽的抗菌效力增強(qiáng)。但是總體而言，抗菌肽有較好的pH值耐受性，在pH值變化的情況下仍能保持較好的活性，且在酸性條件下保持得更好。

在凍融過程中，肽鏈的構(gòu)型發(fā)生了變化，具有抗菌效力的形態(tài)逐漸被破壞，從而導(dǎo)致了抗菌效力的下降；但是大部分具有抗菌活性的肽鏈形態(tài)不受影響，所以總體而言抗菌肽對(duì)凍融次數(shù)具有良好的穩(wěn)定性。在試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過多次（4次以上）凍融后，會(huì)出現(xiàn)酶解液分層的現(xiàn)象，試管上部有淡黃色覆蓋層，底部出現(xiàn)白色沉淀物，可能是因?yàn)槭艿綔囟茸兓挠绊?，一些蛋白肽出現(xiàn)了聚集沉淀的現(xiàn)象，但是對(duì)抗菌效力不產(chǎn)生影響，因此可以表明抗菌肽酶解液可以進(jìn)行凍藏保存。

金屬離子的存在會(huì)讓蛋白肽鏈發(fā)生疏水聚集[28]，改變肽鏈的溶解度[29]，使一些具有抗菌活性的肽鏈不發(fā)揮作用；同時(shí)因其帶不同的正電荷量，也會(huì)改變肽鏈間靜電斥力[30]，影響肽鏈間以及肽鏈結(jié)合細(xì)胞膜的相互作用，從而影響肽鏈展開和空間結(jié)構(gòu)變化[31]，最終導(dǎo)致了抗菌效力的下降。因此在抗菌肽產(chǎn)品的生產(chǎn)流程中應(yīng)當(dāng)盡量避免接觸到Zn2+、Fe2+和Fe3+，以此保證抗菌肽的抑菌活性不受影響。

4 結(jié)論

本研究通過復(fù)合酶解法制備帶魚蛋白抗菌肽，主要對(duì)酶解所得帶魚蛋白肽的穩(wěn)定性作了探究。得出的結(jié)果如下。

1）抗菌肽有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，各組分在高溫處理后抗菌率能夠保持在相對(duì)85%以上，能夠適應(yīng)較高的溫度而不失去抗菌活性。同時(shí)抗菌肽有較好的pH值耐受性，在pH值為4.8時(shí)達(dá)到最大的抗菌效力（45.12%），當(dāng)pH值達(dá)到堿性時(shí)，抗菌效力下降，在pH值為8.8時(shí)出現(xiàn)最低值（40.08%），表明抗菌肽能夠適應(yīng)pH值環(huán)境的改變而不失活，且在酸性條件下有更好的抑菌活性。

2）抗菌肽有較強(qiáng)的胰蛋白酶穩(wěn)定性，各組分之間的抑菌率差別不大，胰蛋白酶對(duì)抗菌肽幾乎沒有影響。同時(shí)抗菌肽有較強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性，因抗菌肽的有效抗菌組分不包含β-內(nèi)酰胺環(huán)，不受β-內(nèi)酰胺酶影響，其抑菌效力沒有被抑制，依然保持了原有的抑菌活性。

3）隨著凍融次數(shù)的增多，抗菌肽的抗菌效力呈下降的趨勢(shì)，但在凍融了6次之后，也只下降到90.28%，大部分具有抗菌活性的肽鏈形態(tài)不受影響。帶魚蛋白抗菌肽對(duì) Na+、K+、Ca2+、Mg2+具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，抑菌活性基本不受影響；但是對(duì)Zn2+、Fe2+和Fe3+表現(xiàn)出了較低的穩(wěn)定性，其相對(duì)抗菌效力分別降低至86.25%、76.38%和74.97%，應(yīng)當(dāng)避免帶魚蛋白抗菌肽與這些離子的接觸。

本研究初步對(duì)帶魚抗菌肽的制備和其抑菌性進(jìn)行了探究，并重點(diǎn)對(duì)此抗菌肽的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。在此基礎(chǔ)上對(duì)帶魚蛋白抗菌肽進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用于食品保鮮等領(lǐng)域，可提高低值帶魚的利用率。