半滑舌鰨養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)中硝化細菌分離篩選及脫氮效果研究

馬 超，陳春秀，王 宇，劉 皓，于燕光，殷小亞，鄭德斌，賈 磊，王群山，周 勇

(天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221)

水產(chǎn)養(yǎng)殖快速發(fā)展在創(chuàng)造漁業(yè)經(jīng)濟的同時也產(chǎn)生了大量的含有有機物、含氮有害物質(zhì)及抗生素等物質(zhì)的養(yǎng)殖尾水，大量有害物質(zhì)超標的水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水直接排放會對周圍水生生態(tài)系統(tǒng)或近海生態(tài)系統(tǒng)造成顯著影響。近年來，開發(fā)高效的海產(chǎn)養(yǎng)殖廢水治理技術(shù)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的熱點問題，而養(yǎng)殖廢水中含氮元素的污染物是造成水體污染和富營養(yǎng)化的主要原因之一，因此如何去除養(yǎng)殖廢水中的含氮有害物質(zhì)對海水養(yǎng)殖廢水排放及循環(huán)利用具有重要意義。為有效解決水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水排放所引起的環(huán)境問題，目前各界學(xué)者通過研究開發(fā)出各種水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理的技術(shù)，包括物理處理、化學(xué)處理和生物處理等技術(shù)，其中生物處理技術(shù)具有環(huán)保、經(jīng)濟、高效等優(yōu)點，在水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水處理中應(yīng)用廣泛。

氨氮主要來源于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的殘餌、排泄物、尸體等有機物，亞硝酸鹽氮則是氮元素在養(yǎng)殖水體循環(huán)中的一種中間產(chǎn)物，含有一定毒性，高濃度氨氮及亞硝酸鹽氮的養(yǎng)殖水體不僅嚴重危害水產(chǎn)動物的正常生長發(fā)育及導(dǎo)致病害頻發(fā)，還會對周邊生態(tài)環(huán)境造成惡劣的影響。而生物處理技術(shù)中主要是通過微生物調(diào)控來實現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水脫氮處理，目前生物脫氮技術(shù)已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點，國內(nèi)外學(xué)者從環(huán)境中分離篩選出多種高效脫氮細菌，包括芽孢桿菌()、假單胞菌()、不動桿菌()、紅球菌()等細菌，因此篩選高效的脫氮細菌并應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水處理中，是調(diào)控養(yǎng)殖水體、保持循環(huán)養(yǎng)殖水體水質(zhì)良好、實現(xiàn)綠色養(yǎng)殖的有效途徑。該研究通過對半滑舌鰨養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)生物填料中細菌進行分離、篩選、鑒定，并對其在養(yǎng)殖尾水中脫氮效果進行初步研究，對提高海水養(yǎng)殖水體處理系統(tǒng)的脫氮效率具有指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

該試驗菌株分離篩選自天津漢沽區(qū)半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖系統(tǒng)尾水處理中的生物填料。

取生物填料的水樣懸液10 mL，用無菌水稀釋制備成10的稀釋液，取0.1 mL涂布在異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，再挑取不同形態(tài)特點的菌落分離純化3次以上直到獲得單一的菌落為止。鏡檢驗純并采用甘油保存法-80 ℃保種。

將分離純化的菌株送往上海微基生物科技有限公司進行16S rDNA序列測序，所得結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，最后得出同源性最高的物種。

將分離純化的菌株分別接種至裝有100 mL異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中富集培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱中28 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h。再將富集后的菌懸液再次分別以1%的接種量接種至分別裝有異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于培養(yǎng)箱中28 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，移取搖勻的10 mL菌液，用離心機8 000 r/min離心后取上清液，檢測其中氨氮濃度。測定方法參照海洋監(jiān)測規(guī)范(GB 17378.7—2007)與《水和廢水監(jiān)測分析方法》進行。根據(jù)氨氮去除率，初篩出高效的硝化細菌。

菌株形態(tài)學(xué)鑒定。將初篩的高效硝化細菌接種于固體培養(yǎng)基平板，在培養(yǎng)箱中28 ℃條件下培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察、記錄菌落特征。在平板上選取單菌落挑于涂片上固定并進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察、拍照和記錄菌落形態(tài)特點，隨后對篩選菌株進行掃描電鏡觀察并拍攝照片。

初篩菌株對養(yǎng)殖尾水的脫氮效果初步研究。從半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖系統(tǒng)尾水處理池取養(yǎng)殖尾水，抽濾后，分裝到18個錐形瓶中，每瓶250 mL，向各水樣瓶中分別以1%的接種量接入2株篩選得到的菌株(每組3個平行)。接種后，將水樣置于28 ℃、120 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后取出水樣測定水體中氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮的含量，測定方法參照海洋監(jiān)測規(guī)范(GB 17378.7—2007)與《水和廢水監(jiān)測分析方法》進行。

使用SPSS 20.0軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。采用Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

采集的生物濾池填料樣品經(jīng)分離純化出7株形態(tài)大小不同的菌株，分別命名為WY1、WY3、WY4、WY5、WY6、WY8、WY10，將所測7株菌株的16S rDNA測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中核酸序列進行比對，結(jié)果顯示，WY1、WY3、WY4、WY5、WY6、WY8、WY10分別與脫氮鮑曼氏菌()、麥氏交替單胞菌()、仙河鹽單胞菌()、杜氏硫桿菌()、黃醇假交替單胞菌()、紅色假交替單胞菌()和施氏假單胞菌()同源性最高，其初步鑒定結(jié)果見表1。

為進一步篩選出能夠高效進行硝化作用的菌株，對7株菌株進行了氨氮去除能力檢測，圖1為7株菌株在氨氮初始濃度為101 mg/L的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中接種24 h后的氨氮去除率，結(jié)果表明，分離純化的7株菌株對氨氮均有一定的去除能力，其中WY10的氨氮去除率最高，為64.52%，其次為WY4的53.99%。因此，選擇WY4和WY10為目標菌株進行下一步研究。

表1 不同菌株的16S rDNA同源性比較

圖1 菌株在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的氨氮去除率Fig.1 The NH4+-N removal rates of each strain in heterotrophic nitrification medium at 24 h

菌株形態(tài)及染色。WY4和WY10這2株菌株氨氮去除率效果較理想，對這2株細菌進行形態(tài)鑒定。將2株細菌在培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)特征，主要形態(tài)學(xué)特點見表2。革蘭氏染色結(jié)果如圖2所示，2株菌株均為革蘭氏陰性菌。通過掃描電鏡結(jié)果(圖3)觀察到WY4菌株為球狀，WY10菌株為桿狀。

表2 菌株的菌落形態(tài)特征

高效硝化細菌對養(yǎng)殖尾水脫氮效果。開展對養(yǎng)殖尾水脫氮效果初步研究，將篩選出的2株菌(WY4、WY10)接種到養(yǎng)殖尾水中(氨氮濃度為0.819 mg/L，亞硝態(tài)氮濃度為0.571 mg/L，硝態(tài)氮濃度為0.193 mg/L，總氮濃度為1.857 mg/L)培養(yǎng)24 h，結(jié)果如圖4～5所示。從圖4～5可以看出，菌株處理養(yǎng)殖尾水24 h后，水體中氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮濃度均出現(xiàn)明顯下降，WY4處理后水體中氨氮濃度為0.038 mg/L(去除率95.36%)，亞硝態(tài)氮濃度為0.002 mg/L(去除率99.65%)，硝態(tài)氮濃度為0.026 mg/L(去除率86.53%)，而菌株WY10處理養(yǎng)殖尾水24 h后，水體中的氨氮濃度為0.222 mg/L(去除率72.89%)，亞硝態(tài)氮濃度為0.032 mg/L(去除率94.40%)，硝態(tài)氮濃度為0.033 mg/L(去除率82.90%)，表明2株菌株均具有好氧反硝化作用，能夠顯著降低養(yǎng)殖水體中的硝態(tài)氮。

圖2 菌株WY4(a)和WY10(b)的革蘭氏染色Fig.2 Gram stain graph for strains WY4(a)and WY10(b)

圖3 菌株WY4(a)和WY10(b)的掃描電鏡Fig.3 The scanning electron micrograph of strains WY4(a)and WY10(b)

圖4 接入菌株24 h后養(yǎng)殖尾水的氨氮、硝態(tài)氮、亞硝化氮濃度變化Fig.4 Concentration changes of ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrite nitrogen in aquaculture tail water 24 hours after inoculated strains

圖5 不同菌株在養(yǎng)殖尾水中對氨氮、硝態(tài)氮、亞硝化氮的去除率Fig.5 Removal rates of ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrous nitrogen by different strains in aquaculture tail water

3 討論

施氏假單胞菌()于1895年被Burri和Stutzer首次描述，近年來，越來越多的施氏假單胞菌菌株被從不同的環(huán)境中分離出來，如Su等從處理豬場廢水處理系統(tǒng)中、Rezaee等從石油化工廢水中都分離出施氏假單胞菌。此外有研究表明此細菌為異養(yǎng)硝化好氧反硝化細菌，此類細菌因以生長速度快、脫氮反應(yīng)高效等優(yōu)點被廣大研究人員關(guān)注并應(yīng)用，Ji等將施氏假單胞菌接種在生物濾池的硝酸鹽廢水中，結(jié)果表明廢水中硝態(tài)氮去除率達到98.5%；張達娟等用從凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘中分離出來的施氏假單胞菌凈化模擬養(yǎng)殖水體，結(jié)果表明，氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮去除率分別達到91.73%、97.39%、91.22%。該研究從半滑舌鰨養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)中分離篩選出的施氏假單胞菌菌株WY10通過鑒定為一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化革蘭氏陰性菌，具有良好的氨氮去除效果，而且還有效降低了亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的濃度，表現(xiàn)出良好的脫氮能力，施氏假單胞菌僅能以無機碳源為底物進行硝化-好氧反硝化脫氮，因此推斷其代謝途徑可能為完全硝化反硝化通路，與上述學(xué)者研究結(jié)果相似，但去除率有所差異，可能與菌株差異、培養(yǎng)溫度、接種量等條件有關(guān)。

鹽單胞菌()為中度嗜鹽革蘭氏陰性菌，大多數(shù)菌株適合在30 ℃和pH 7.2～7.5條件下生長，多數(shù)研究集中在鹽堿環(huán)境中的石油烴降解，只有少數(shù)幾株菌株的脫氮作用被報道，如孫雪梅等在網(wǎng)箱魚類養(yǎng)殖區(qū)沉積環(huán)境中分離出的鹽單胞菌X3和沈輝等在海洋灘涂沉積物中分離出的鹽單胞菌MD5，在高鹽環(huán)境下均具有較強的脫氮能力。該試驗中分離的菌株WY4，通過16S rDNA序列同源性分析與仙河鹽單胞菌()相似度最高，且生長特點符合鹽單胞菌，有較強的脫氮能力，同時研究表明鹽單胞菌菌株WY4具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化細菌的特點，是一株具有潛力的海水養(yǎng)殖尾水凈化菌株。通過試驗發(fā)現(xiàn)，在處理養(yǎng)殖尾水時菌株WY4氨氮24 h去除率(95.36%)比初篩(53.99%)有所提高，王歡等研究表明細菌的異養(yǎng)硝化和反硝化作用是相互促進的，當(dāng)硝化反硝化同時進行時，比單一作用的脫氮效率和菌體生長速度都有所提高。而該試驗中，初篩時的溶液中氮主要以氨氮形式存在，而養(yǎng)殖尾水中不僅含有氨氮，還有一定濃度的亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮，24 h各形態(tài)氮的濃度都有所減少，由此推斷菌株WY4在處理養(yǎng)殖尾水的同時發(fā)生了硝化和反硝化作用，從而提高了氨氮24 h去除率。

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的高速發(fā)展，工廠化養(yǎng)殖密度逐漸加大，殘餌、糞便、養(yǎng)殖生物殘骸等含氮有機物質(zhì)不斷積累，使得養(yǎng)殖尾水難以循環(huán)使用，加之環(huán)境資源保護意識不斷提升及各種環(huán)保政策的落實，也使得養(yǎng)殖尾水排放成為困擾養(yǎng)殖企業(yè)的重要問題。傳統(tǒng)的微生態(tài)制劑僅為光合細菌、乳酸菌和芽孢桿菌中的一種或多種，品種較為單一，且很少用于尾水處理，因此尋找具有綠色、環(huán)保同時能改善水質(zhì)的菌株制成微生態(tài)制劑成為近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖的熱點。眾多研究也表明從養(yǎng)殖尾水或池塘底泥中分離篩選的土著菌種脫氮效果更高。該研究從半滑舌鰨養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)中分離篩選出的假單胞菌和鹽單胞菌是常見的脫氮細菌，對養(yǎng)殖尾水也具有較強的脫氮能力，因此，它們具有廣泛應(yīng)用于工廠化養(yǎng)殖尾水處理的潛力，具有廣泛的市場應(yīng)用前景。但對這2株土著硝化細菌的脫氮機理和性質(zhì)還有待進一步研究，尤其是作為微生態(tài)制劑的工藝和組合方式還有待探究。

4 結(jié)論

從半滑舌鰨養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)中分離純化出7株異養(yǎng)硝化細菌，對分離的菌株用16S rDNA序列分析進行了鑒定，7株菌株同源性最高的分別為脫氮鮑曼氏菌(WY1)、麥氏交替單胞菌(WY3)、仙河鹽單胞菌(WY4)、杜氏硫桿菌(WY5)、黃醇假交替單胞菌(WY6)、紅色假交替單胞菌(WY8)和施氏假單胞菌(WY10)。通過對7株菌株氨氮去除能力檢測得到高效硝化細菌WY4和WY10，氨氮去除率分別為53.99%和64.52%，并對其進行了形態(tài)學(xué)觀察和處理養(yǎng)殖尾水24 h脫氮效果的初步研究，結(jié)果表明WY10和WY4 這2株菌株均為革蘭氏陰性菌，在處理養(yǎng)殖尾水24 h后，WY4菌株氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮去除率分別為95.36%、99.65%、86.53%，WY10菌株氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮去除率分別為72.89%、94.40%、82.90%。因此該研究篩選出的2株異養(yǎng)硝化細菌均為異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細菌，具有調(diào)控海水養(yǎng)殖尾水的潛在應(yīng)用價值。