針刺對(duì)胚胎著床障礙大鼠子宮CD68+巨噬細(xì)胞的影響

高偉娜 董浩旭 唐 瀟 黃光英△

1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，鄭州 450052 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430030 3恩施自治州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北恩施 445000

巨噬細(xì)胞是由單核細(xì)胞分化產(chǎn)生的白細(xì)胞，幾乎存在于人體的所有組織中。它們參與人體多種生理和病理過(guò)程，表現(xiàn)出吞噬作用、參與先天性或適應(yīng)性免疫、促炎(M1)和抗炎(M2)等多種作用，具體取決于各組織的微環(huán)境[1]。在母胎著床微環(huán)境中，子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞是胚胎著床環(huán)節(jié)的重要參與者之一，對(duì)成功妊娠起著至關(guān)重要的作用。母胎界面數(shù)量最多的免疫細(xì)胞是自然殺傷細(xì)胞，占總免疫細(xì)胞的50%～60%；其次為子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞，占20%～30%[2]。除了在蛻膜中作為主要抗原呈遞細(xì)胞的作用外，巨噬細(xì)胞還積極參與妊娠早期的滋養(yǎng)層侵襲、組織和血管重塑等過(guò)程，并在妊娠的不同階段表現(xiàn)出不同的表型和極性[3]。子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞的數(shù)量或功能異常可能導(dǎo)致各種病理性妊娠的發(fā)生，如先兆子癇、復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)、不孕、宮內(nèi)生長(zhǎng)受限和早產(chǎn)等。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺具有調(diào)節(jié)胚胎著床障礙模型動(dòng)物母胎界面趨化因子CCR2[4]、CXCL8[5]和CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[6]等的作用，表現(xiàn)出通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)[7]發(fā)揮促進(jìn)胚胎著床的療效。鑒于子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞是母胎界面第二大免疫細(xì)胞群體，本研究聚焦子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞，旨在研究針刺是否可通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)胚胎著床的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

未經(jīng)孕產(chǎn)的雌性Wistar成年大鼠(SPF級(jí)，10～12周，220 g～230 g)和生育能力正常的成年雄性Wistar大鼠(SPF級(jí)，250 g～300 g)購(gòu)買于湖北省疾病控制中心。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)中。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用陰道涂片的方法觀察并記錄雌性大鼠動(dòng)情周期，動(dòng)情周期正常者納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨后，動(dòng)情期的雌性大鼠與雄性大鼠以2∶1的比例于6 pm進(jìn)行合籠，并以次日8 am時(shí)行大鼠陰道涂片發(fā)現(xiàn)有大量精子者作為妊娠標(biāo)準(zhǔn)，并記錄為妊娠第1天(D1)。妊娠大鼠被隨機(jī)分為正常組(N)、模型組(M)、針刺組(A)和黃體酮組(P)，每組12只。

1.2 試劑與儀器

主要的試劑：小鼠抗大鼠單克隆抗體CD68購(gòu)于英國(guó)AbD serotec公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、兔抗大鼠β-actin多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H + L)和DAB顯色試劑盒購(gòu)于中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Cocktail蛋白酶抑制劑購(gòu)于瑞士Roche公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于中國(guó)碧云天生物科技研究所；Trizol RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR熒光定量試劑盒來(lái)源于中國(guó)Takara公司；NC膜來(lái)自德國(guó)Pierce公司。

實(shí)驗(yàn)藥品：米非司酮片(湖北葛店人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20083780)、黃體酮注射液(浙江仙琚制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33020828)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部提供。

主要設(shè)備：PCR儀(Eppendorf Company，德國(guó))；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))；核酸蛋白質(zhì)分析儀(DU730，BeckmanCoulter，美國(guó))；全能酶標(biāo)儀(BioTek Synergy2，Vermote，美國(guó))和尼康顯微成像系統(tǒng)(TE2000-U日本)。

1.3 造模與干預(yù)措施

在超凈工作臺(tái)中將米非司酮片研末后用麻油溶解，配制成2 mg/mL的米非司酮-麻油溶液，分裝后于4℃冰箱備用。M組、A組和P組孕鼠于D1 9 am于頭頸部皮下注射米非司酮-麻油溶液(5 mg/kg)造模。N組孕鼠則給予等量的純麻油溶液于同一時(shí)間進(jìn)行注射。

針刺操作：A組從D1直至處死當(dāng)日，每日3 pm用自制布袋固定后，使用規(guī)格0.30 mm ×13 mm(華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)針灸針針刺大鼠雙側(cè)后三里和三陰交，使用手動(dòng)針刺刺激，每5 min行針1次，共留針25 min，穴位的定位和進(jìn)針深度參考前期的研究[4-7]；同時(shí)M組和N組大鼠僅固定不予針刺；P組大鼠則每日肌肉注射黃體酮(40 mg/kg)。

1.4 取材

分別于D8和D10處死各組大鼠，收集子宮標(biāo)本，每個(gè)處死時(shí)間節(jié)點(diǎn)每組大鼠各6只。取材時(shí)，使用1%的戊巴比妥納對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行麻醉，剖腹后暴露子宮，觀察胚泡著床情況。其中，取1/3的著床點(diǎn)子宮組織，使用4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋并切片用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。剩余的子宮組織使用錫箔紙包裹后立即置于-80℃冰箱冷凍保存。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1 免疫組織化學(xué)法觀察各組大鼠子宮巨噬細(xì)胞的分布

首先，將5 μm的石蠟切片置于60 ℃烤箱中烤片1 h。然后，經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精水化后，用PBS漂洗，并將切片置于枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中微波修復(fù)15 min(98℃)。隨后，用3 %的H2O2室溫下封閉過(guò)氧化氫酶10 min。漂洗切片后，用5% BSA室溫下封閉20 min。隨后，孵育一抗(CD68 1∶100)，4 ℃過(guò)夜。第2天漂洗切片后，孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)二抗，37 ℃孵育30 min。漂洗切片后，經(jīng)DAB顯色、蘇木精染核、氨水返藍(lán)、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片等步驟后，使用顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.5.2 Western-blot法檢測(cè)各組大鼠子宮CD68的蛋白表達(dá)

首先，沿子宮系膜對(duì)側(cè)將子宮沿長(zhǎng)軸剪開，并在解剖顯微鏡下將胎兒剔除，收集著床點(diǎn)子宮組織。隨后將這些組織剪碎，置于預(yù)冷的RIPA裂解液中在冰上研磨成勻漿狀，并靜置30 min。然后，在4 ℃條件下，12000 g離心20 min。最后，收集其上清并分裝放于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Western-blot具體步驟：組織樣本的蛋白濃度用BCA試劑盒定量，并使用酶標(biāo)儀進(jìn)行分析；樣本加入上樣緩沖液，98 ℃蒸煮10 min；樣本加入12% SDS-PAGE中電泳；電泳后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上；用5%的脫脂牛奶室溫下封閉2 h后，一抗孵育4℃過(guò)夜(β-actin 1∶200；CD68 1∶500)；漂洗后，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶20000)，于室溫下孵育1 h；根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行ECL曝光；掃描膠片，用Quantity One軟件分析獲得積分光密度值。

1.5.3 Real-time PCR法檢測(cè)各組大鼠子宮CD68的mRNA表達(dá)

首先，將剪碎的著床點(diǎn)子宮組織置于預(yù)冷的Trizol中按說(shuō)明書的步驟提取RNA。隨后，取2 μl RNA用核酸蛋白質(zhì)分析儀測(cè)定其濃度和純度。隨后，用Prime Script RT Re-agent Kit將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。然后，在20 μL體系下進(jìn)行擴(kuò)增[10 μL SYBR Premix Ex Taq(2×)，2 μL cDNA樣品，10 μM的引物各0.4 μL，0.4 μL ROX Reference Dye(50×)，6.8 μL無(wú)菌DECP水]。反應(yīng)條件為：第一步95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；第二步95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；第三步95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。其中，每個(gè)樣本做2個(gè)復(fù)孔，β-actin作為內(nèi)參。最后，通過(guò)2-△△ct法計(jì)算各組樣本中CD68的相對(duì)RNA含量。所用引物序列見表1。

表1 CD68和β-actin的引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞分布

免疫組化結(jié)果顯示：子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞在母胎界面分布較為廣泛，主要在集中在子宮內(nèi)膜腺上皮、腔上皮和螺旋動(dòng)脈附近，其次在蛻膜區(qū)和子宮肌層。與N組相比，M組大鼠子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞少量散在分布，且主要集中在子宮內(nèi)膜腺上皮、腔上皮附近和子宮肌層；與M組相比，A組和P組大鼠子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞數(shù)量較多，且分布廣泛，除了子宮內(nèi)膜腺上皮、腔上皮附近和子宮肌層分布外，在螺旋動(dòng)脈和蛻膜區(qū)亦有較多分布。見圖1。

N：正常組；M：模型組；A：針刺組；P：黃體酮組；棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)(× 200)

2.2 各組大鼠子宮CD68蛋白表達(dá)

與N組相比，M組大鼠D8、D10子宮CD68的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與M相比，A組和P組大鼠D8、D10子宮CD68的蛋白表達(dá)均明顯上升(P< 0.05)。A組和P組CD68的蛋白表達(dá)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

N：正常組；M：模型組；A：針刺組；P：黃體酮組；與N組比較#P<0.05；與M組比較*P<0.05

2.3 各組大鼠子宮CD68 mRNA表達(dá)

與N組相比，M組大鼠D8、D10子宮CD68 mRNA表達(dá)明顯降低(P< 0.05)。與M組相比，A組大鼠D8、P組大鼠D8、D10子宮CD68 mRNA表達(dá)均明顯上升(P<0.05)；與M組相比，A組大鼠D10子宮CD68 mRNA表達(dá)有上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組和P組之間CD68 mRNA表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

N：正常組；M：模型組；A：針刺組；P：黃體酮組；與N組比較#P<0.05；與M組比較*P<0.05

3 討論

妊娠早期的蛻膜中有著大量白細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，這些免疫細(xì)胞組成了復(fù)雜而精細(xì)的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)著母胎免疫耐受的過(guò)程，且在整個(gè)妊娠期呈現(xiàn)時(shí)空有序的動(dòng)態(tài)變化。研究表明，子宮巨噬細(xì)胞在非妊娠子宮內(nèi)膜中占一般白細(xì)胞抗原的10%[8]，而在妊娠早期占蛻膜細(xì)胞的20%～30%[2]。既往研究顯示，子宮巨噬細(xì)胞遍布整個(gè)母胎界面，主要在子宮螺旋動(dòng)脈附近[9-10]，并且在分娩時(shí)數(shù)量顯著增加[11]。1項(xiàng)關(guān)于胚胎著床和妊娠早期子宮內(nèi)膜白細(xì)胞亞類的研究顯示，恒河猴早期妊娠蛻膜中CD68+巨噬細(xì)胞的比率明顯增加[12]；這與本研究結(jié)果相一致。在人孕早期，子宮巨噬細(xì)胞在母胎界面分布較為廣泛，主要在集中在子宮內(nèi)膜腺上皮、腔上皮和螺旋動(dòng)脈附近，其次在蛻膜區(qū)和子宮肌層。

子宮巨噬細(xì)胞在母胎界面具有多重作用，具體表現(xiàn)在參與半異體胎兒的免疫耐受、滋養(yǎng)層入侵以及組織和血管重塑等過(guò)程[13]。此外，它具有可塑性，可通過(guò)改變其功能以響應(yīng)組織中不斷變化的微環(huán)境，從而廣泛參與生理功能和疾病過(guò)程[3]。根據(jù)它們功能和產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同，可分為經(jīng)典激活(M1)和交替激活(M2)表型[14]。M1型巨噬細(xì)胞由干擾素-γ誘導(dǎo)，其特點(diǎn)是主動(dòng)產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、活性氮和氧中間體，并促進(jìn)Th1反應(yīng)。M1型巨噬細(xì)胞本質(zhì)上是促炎性的。相比之下，M2型巨噬細(xì)胞被IL-4激活，并與炎癥消退和促進(jìn)組織重塑和纖維化有關(guān)。巨噬細(xì)胞這種可塑性稱為M1/M2極化。在母胎界面，M1/M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量和比例在整個(gè)妊娠期都會(huì)發(fā)生變化，以保護(hù)胎兒免受母體免疫微環(huán)境的影響并建立母胎耐受。在圍著床期，M1型占主導(dǎo)地位，之后過(guò)渡到M1型和M2型的混合型，在此期間滋養(yǎng)細(xì)胞侵入基質(zhì)并定居在子宮內(nèi)膜；這種混合型的主導(dǎo)地位持續(xù)至孕中期的早期階段[1]。隨后，隨著胎盤的建立，M2表型占主導(dǎo)地位，促使母胎免疫耐受。CD68是溶酶體和內(nèi)體膜上與吞噬活性相關(guān)的抗原[15]，其表達(dá)被視為M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志[16]。本研究通過(guò)米非司酮誘導(dǎo)胚胎著床障礙，發(fā)現(xiàn)著床障礙大鼠母胎界面M1型巨噬細(xì)胞的低表達(dá)，這表明米非司酮可能抑制M1型巨噬細(xì)胞在母胎界面的表達(dá)，而黃體酮和針刺可能通過(guò)逆轉(zhuǎn)M1型巨噬細(xì)胞的低表達(dá)而改善胚胎著床障礙。

與西藥相比，針刺具有明顯的整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)；同時(shí)在針刺的現(xiàn)代機(jī)制研究中，“免疫調(diào)節(jié)機(jī)制”被認(rèn)為是其中十分重要的途徑。課題組前期一系列研究表明，針刺可通過(guò)調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的功能、Th1/Th2比例和趨化因子CXCL8受體的表達(dá)提高胚泡著床障礙模型大鼠受孕率[4-7]；提示針刺可能通過(guò)“調(diào)節(jié)母胎局部免疫”的途徑促進(jìn)胚胎著床。而本研究關(guān)注的子宮巨噬細(xì)胞是母胎界面另一重要免疫細(xì)胞，本研究結(jié)果表明，針刺可以改善胚胎著床障礙模型大鼠子宮著床位點(diǎn)巨噬細(xì)胞CD68的蛋白和mRNA表達(dá)，從而表現(xiàn)出調(diào)節(jié)M1/M2極化的作用，這可能是針刺改善胚胎著床障礙、促進(jìn)著床的分子機(jī)制之一。

然而，本研究也具有一定的局限性：本研究只觀察到針刺可以調(diào)節(jié)子宮巨噬細(xì)胞表達(dá)的現(xiàn)象，而未進(jìn)一步探討針刺對(duì)巨噬細(xì)胞促炎(M1)和抗炎(M2)活性的影響。未來(lái)有待開展更多機(jī)制研究、深入揭示針刺如何通過(guò)免疫調(diào)節(jié)途徑促進(jìn)胚胎著床。