熱毒寧注射液聯(lián)合西藥對耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌體外抑菌作用實(shí)驗(yàn)研究*

肖衍豪 廖 彬△ 陸巧燕 譚穎華 賢永嫦 賀 勤 謝友鳳 杜順霞 蒙 鋮 張 宇

南寧市第八人民醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2藥劑科，3輸血科，南寧 530001

銅綠假單胞菌是院內(nèi)感染的主要致病菌，主要發(fā)生在ICU、呼吸科及燒傷科[1]。由于抗菌藥物濫用、誤用等不正規(guī)使用情況日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌(carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa，CRPA)所致感染日趨增多[2]。因此，中西藥聯(lián)合治療細(xì)菌感染逐漸受到關(guān)注。熱毒寧注射液由青蒿、金銀花和梔子3味中藥組成，具有清熱、疏風(fēng)、解毒作用，臨床上常用于上呼吸道感染、急性支氣管炎的治療；其臨床療效確切，具有較高的安全性[3-4]。為了解決臨床對CRPA治療藥物選擇的難題，本實(shí)驗(yàn)探討熱毒寧注射液分別與頭孢他啶(ceftazidime，CAZ)、頭孢哌酮/舒巴坦(cefoperazone/sulbactam，SCF)聯(lián)合用藥的體外抑菌作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集南寧市第八人民醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室2020年1月—2021年12月的臨床標(biāo)本，從中分離非重復(fù)株CRPA 40株。40個(gè)樣本來源情況：男27人，女13人；年齡30～95歲，平均(75±14)歲；60歲以上34人，占85%。標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌ATCC27853購自國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 培養(yǎng)基和抗菌藥物

血液增菌培養(yǎng)基(杭州濱和，批號：210907)，水解絡(luò)蛋白瓊脂(杭州濱和，批號：210816)，血瓊脂培養(yǎng)基(鄭州安圖)，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(鄭州安圖)，生化藥敏鑒定板(法國梅里埃公司)。注射用頭孢他啶(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，1.0 g/瓶，批號：201260)；注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉(頭孢哌酮：舒巴坦=1∶1，輝瑞制藥有限公司，1.0 g/瓶，批號：20201223)；熱毒寧注射液(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號：210302)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

生物安全柜(海爾)、ABT半自動(dòng)生化藥敏鑒定儀(法國生物梅里埃公司)、顯微鏡(奧林巴斯)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn))、手提式不銹鋼蒸汽消毒鍋(型號：YX20B)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌的檢驗(yàn) 將臨床收集到的菌株進(jìn)行重新分離鑒定，按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第三版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分純培養(yǎng)、鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)菌液配制 取經(jīng)過分純培養(yǎng)的菌落1～2個(gè)，用5 mL生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，再用MH肉湯稀釋10倍備用，稀釋的菌液應(yīng)在15 min內(nèi)接種完畢。

1.4.3 確定單藥最低抑菌濃度 對熱毒寧注射液進(jìn)行濃度遞減實(shí)驗(yàn)，確定熱毒寧的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)：取12支試管按1～12順序進(jìn)行編號，依次在1～12號試管中加入不同濃度的熱毒寧溶液，用微量移液器向每支試管中加入實(shí)驗(yàn)菌液，保證最終試管內(nèi)的接種濃度為5×105CFU/mL。置于35℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

分別對頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦進(jìn)行倍比稀釋實(shí)驗(yàn)，確定頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦的MIC：分別取2組各12支試管按順序編號，在2～12號試管中加入1 mL的MH肉湯，分別在1號和2號試管中加入頭孢他啶(或頭孢哌酮/舒巴坦)1 mL(濃度為4096 g/mL)，從2號試管開始對倍稀釋直至12號試管，用微量移液器向1～12號試管中分別加入實(shí)驗(yàn)菌液，保證最終試管內(nèi)的接種濃度5×105CFU/mL。置于35℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4.4 確定聯(lián)合用藥稀釋度 采用微量棋盤稀釋法分別配制不同濃度的熱毒寧+頭孢他啶、熱毒寧+頭孢哌酮/舒巴坦肉湯。依據(jù)96孔板自帶的孔位編號，在橫排中，將頭孢他啶(或頭孢哌酮/舒巴坦)按12→1方向進(jìn)行倍比稀釋；在縱列中，將熱毒寧按A→H方向進(jìn)行梯度稀釋，同時(shí)保證第H排只有頭孢他啶(或頭孢哌酮/舒巴坦)1種藥，第1列只有熱毒寧1種藥物。最后加入實(shí)驗(yàn)菌液，保證最終接種濃度為5×105CFU/mL，置于35℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

40株CRPA均與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853平行操作。

1.5 結(jié)果判讀

經(jīng)培養(yǎng)后觀察各孔位的渾濁情況，澄清表明細(xì)菌生長受抑制，渾濁表明細(xì)菌生長。以無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。

1.6 聯(lián)合用藥的部分抑菌濃度指數(shù)計(jì)算

部分抑菌濃度(fraction inhibitory concentration，F(xiàn)IC)指數(shù)=A藥聯(lián)合的MIC/A藥單用的MIC+B藥聯(lián)合的MIC/B藥單用的MIC。相互作用解釋：FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用；0.52.0為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 3種藥物單用對標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853及40株CRPA的MIC值

根據(jù)上述熱毒寧濃度遞減實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定熱毒寧對ATCC27853的MIC為400 μL/mL；根據(jù)上述頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦?jié)舛缺侗认♂屢志鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果，頭孢他啶對ATCC27853的MIC為16 μg/mL，頭孢哌酮/舒巴坦對ATCC27853的MIC為32 μg/mL。

40株CRPA中，熱毒寧MIC集中于500 μL/mL，共有31株(77.5%)；頭孢他啶MIC集中于32 μg/mL～64 μg/mL，共有31株(77.5%)；頭孢哌酮/舒巴坦MIC集中于64 μg/mL～128 μg/mL，共有35株(87.5%)。見表1。

表1 熱毒寧、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦單獨(dú)用藥的MIC

2.2 熱毒寧與頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合用藥結(jié)果

熱毒寧與頭孢他啶聯(lián)用：ATCC27853的熱毒寧MIC為200 μL/mL，頭孢他啶MIC為4 μg/mL；40株CRPA中，有30株(75.0%)CRPA的熱毒寧MIC位于250 μL/mL～350 μL/mL，有26株(65.0%)CRPA的頭孢他啶MIC位于8 μg/mL～16 μg/mL。

熱毒寧與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)用：ATCC27853的熱毒寧MIC為150 μL/mL，頭孢哌酮/舒巴坦MIC為8 μg/mL；40株CRPA中，有28株(70.0%)CRPA的熱毒寧MIC位于250 μL/mL～350 μL/mL，有34株(85.0%)CRPA的頭孢哌酮/舒巴坦MIC位于8 μg/mL～32 μg/mL。

熱毒寧與頭孢他啶聯(lián)用FIC指數(shù)：FIC≤0.5為2.5%(1/40)，0.52.0為0%(0/40)；熱毒寧與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)用FIC指數(shù)：FIC≤0.5為10.0%(4/40)，0.52.0為0%(0/40)。見表2、表3。

表2 熱毒寧與頭孢他啶聯(lián)合用藥的MIC和FIC指數(shù)

表3 熱毒寧與頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合用藥的MIC和FIC指數(shù)

3 討論

碳青霉烯類抗生素被認(rèn)為是治療銅綠假單胞菌感染的強(qiáng)效藥物，但在過去的幾年里，世界各地均監(jiān)測到碳青霉烯類抗生素耐藥率的上升[5]。中藥具有應(yīng)用方便、經(jīng)濟(jì)安全的優(yōu)勢，且許多中藥具有抗菌活性，同時(shí)不良反應(yīng)小、不易產(chǎn)生耐藥性，故從天然藥物中尋找高效、低毒的抗菌藥物，對解決細(xì)菌耐藥性具有重要意義[6-7]。

熱毒寧注射液以青蒿為君藥，能清熱涼血、透散肌表；金銀花為臣藥，擅清熱解毒、透散表邪，協(xié)助增強(qiáng)青蒿清熱透散之力；梔子為佐藥，具有解毒、清熱、涼血、清泄心肺胃的功效[8]。研究[9]表明，熱毒寧注射液具有較好的解熱抗炎功效。本實(shí)驗(yàn)中，熱毒寧注射液聯(lián)合頭孢他啶時(shí)，共有30株(75.0%)CRPA的熱毒寧MIC降至250 μL/mL～350 μL/mL，聯(lián)合用藥后頭孢他啶MIC均較單獨(dú)用藥時(shí)下降50%及以上，與劉佳[10]的研究結(jié)果相似。當(dāng)熱毒寧聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦時(shí)，有28株(70.0%)CRPA的熱毒寧MIC降至250 μL/mL～350 μL/mL，聯(lián)合用藥后共有34株(85.0%)CRPA的頭孢哌酮/舒巴坦MIC較單獨(dú)用藥時(shí)下降50%及以上，與林昱等[11]研究報(bào)道結(jié)果相似。此外，熱毒寧注射液與頭孢他啶聯(lián)用以相加(67.5%)和無關(guān)(30.0%)作用為主；熱毒寧注射液和頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)用以相加(70.0%)和無關(guān)(20.0%)作用為主；熱毒寧注射液與上述2種抗生素聯(lián)用均未發(fā)現(xiàn)拮抗作用，聯(lián)合用藥抑菌作用均表現(xiàn)良好。

綜上所述，熱毒寧與頭孢他啶和頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合應(yīng)用后，其抑菌所需濃度明顯低于單獨(dú)用藥濃度；這可能得益于中藥多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，但具體抑菌機(jī)制需進(jìn)一步研究。此外，本次實(shí)驗(yàn)所用藥品均為注射制劑，其在體內(nèi)的抑菌效果如何仍有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。