基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討裘氏二藤湯治療慢性盆腔炎的機(jī)制

王相安 張 勻 王慧銘

慢性盆腔炎為盆腔腹膜、生殖器及周圍組織發(fā)生的炎癥反應(yīng)，臨床上西醫(yī)治療多以抗生素為主，由于病灶多位于盆腔組織深部，抗生素難以獲得較高血藥濃度，且長(zhǎng)期使用抗生素易造成耐藥性及菌群失衡[1]。該病屬中醫(yī)“婦人腹痛”“癥瘕”“帶下病”等范疇，主要是經(jīng)期產(chǎn)后，不慎房事或感染外邪，濕熱之邪浸注下焦，留注沖任、胞宮而至，治療當(dāng)以活血化瘀、清熱利濕、理氣止痛、通經(jīng)活絡(luò)為主[2]。裘氏二藤湯出自全國(guó)首批名老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師、國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)裘笑梅教授，由忍冬藤、大血藤、赤芍、川楝子、丹參、延胡索、大黃、大青葉、甘草、牡丹皮、蒲公英這11 味中藥材組成，廣泛應(yīng)用于盆腔炎癥性疾病，并取得良好的臨床療效[3]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)二藤湯的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、基因通路等方面進(jìn)行分析，通過分子對(duì)接方法驗(yàn)證活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能力。

1 資料與方法

1.1 二藤湯的活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）[4]及中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional Chinese Medicine Integrative Database，TCMID）[5]檢索二藤湯中11 味藥物的活性成分，設(shè)定口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，進(jìn)行活性成分的篩選，以獲得二藤湯的主要活性成分。將收集的主要活性成分輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中，檢索主要活性成分的潛在靶點(diǎn)并去除沒有檢索到靶點(diǎn)的活性成分。同時(shí)，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)[6]，限定物種為“homo sapiens”，校準(zhǔn)主要活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的基因信息，得到標(biāo)準(zhǔn)化的靶點(diǎn)名稱。

1.2 “中藥-活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用篩選出的活性成分和靶基因在Cytoscape3.7.2 軟件上繪制二藤湯-活性成分-靶基因網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)行Network Analyzer 插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)degree 值大小篩選出核心成分。

1.3 慢性盆腔炎相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 利用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)（相關(guān)性評(píng)分即Score 值≥1.0）[7]和OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)[8]，以“Chronic Pelvic Inflammatory Disease”作為檢索詞分別檢索慢性盆腔炎潛在靶點(diǎn)，合并去除重復(fù)基因后，最終獲得與慢性盆腔炎相關(guān)的作用靶點(diǎn)。

1.4 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的篩選 將二藤湯活性成分作用靶點(diǎn)與慢性盆腔炎相關(guān)靶點(diǎn)取交集，并利用Venny 2.1.0 在線軟件繪制Venn 圖，得到藥物-疾病共同的靶基因。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將“1.4”獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)中[9]，限定物種為“homo sapiens”，并以置信度≥0.4 為條件篩選，獲取蛋白相互作用關(guān)系，導(dǎo)出TSV 格式文件，并導(dǎo)入Cytosape 3.7.2 軟件中，運(yùn)行CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)浞治霾⒏鶕?jù)degree值篩選出核心靶基因。

1.6 通路和功能富集的分析 將“1.4”獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺(tái)[10]，將生物種類設(shè)定為“homo sapiens”，根據(jù)P<0.01，進(jìn)行GO（gene ontology）富集分析與KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析，并利用R 語(yǔ)言對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)[11]獲得核心活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入Chem3D 軟件得到優(yōu)化后的3D 結(jié)構(gòu)。在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)尋找靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，運(yùn)用PYMOL 2.3.0 對(duì)靶蛋白進(jìn)行去水分子及去配體等操作，同時(shí)利用AutoDock 4.2.6 軟件對(duì)靶蛋白進(jìn)行加氫，最后，利用AutoDock Vina 1.1.2 軟件將受體蛋白與配體小分子進(jìn)行分子對(duì)接并用PYMOL 2.3.0 進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 二藤湯的活性成分和作用靶點(diǎn)收集 設(shè)定OB≥30%且DL≥0.18 及剔除沒有相應(yīng)靶點(diǎn)的活性成分后，從TCMSP、TCMID 共獲取231 種活性成分，其中赤芍9 種，川楝子5 種，大黃8 種，大青葉6 種，大血藤1 種，丹參56 種，甘草80 種，牡丹皮1 種，蒲公英2 種，忍冬藤2 種，延胡索46 種，15 種各藥物間共同的活性成分，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)校準(zhǔn)所有靶點(diǎn)名稱，去除重復(fù)及無(wú)效值后共得到308 個(gè)靶點(diǎn)。為方便后續(xù)研究，按藥物的首字母縮寫進(jìn)行編碼，其中赤芍活性成分被標(biāo)記為CS1-CS9，以此類推，川楝子、大黃、大青葉、大血藤、丹參、甘草、牡丹皮、蒲公英、忍冬藤、延胡索各自的活性成分被標(biāo)記為CLZ1-CLZ5、DH1 -DH8、DQY1 -DQY6、DXT1、DS1 -DS56、GC1-GC80、MDP1、PGY1-PGY2、RDT1-RDT2、YHS1-YHS46。15 種共同的活性成分被標(biāo)記為A1-O1。

2.2 “中藥-活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape3.7.2 繪制中藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)總共包括550 個(gè)節(jié)點(diǎn)（11 個(gè)藥材節(jié)點(diǎn)、231 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)、308 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和5373 條邊，見圖1。通過內(nèi)置的Network Analyzer 分析該網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，并根據(jù)degree 值大小選取排名前15 的核心成分，見表1。

表1 二藤湯的核心活性成分信息

2.3 慢性盆腔炎靶點(diǎn)的收集與韋恩圖的構(gòu)建 利用GeneCards 數(shù)據(jù)（Relevance score≥1.0）庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Chronic Pelvic Inflammatory Disease”為關(guān)鍵詞，檢索慢性盆腔炎的靶點(diǎn)，并將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)合并刪除重復(fù)值后,共得到4835 個(gè)靶點(diǎn)，與二藤湯相關(guān)的308 個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)導(dǎo)入Venny 2.1.0 在線軟件進(jìn)行交集分析并繪制Venn 圖，共獲得211 個(gè)交集靶點(diǎn)，即為二藤湯治療慢性盆腔炎的潛在作用靶點(diǎn)。見圖2。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將二藤湯與慢性盆腔炎的211 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種“Homo sapiens”，設(shè)置置信度≥0.4，獲取蛋白相互作用關(guān)系圖及TSV 格式文件，見圖3。將TSV 格式文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件中，運(yùn)行CytoNCA 插件對(duì)共有靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治觯⒏鶕?jù)degree 值大小篩選前20位關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建得到關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。同時(shí)根據(jù)度值的大小進(jìn)行排列，得到PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)柱狀圖，見圖5。

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 利用Metascape 平臺(tái)，設(shè)置P<0.01 作為篩選條件，將交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）分析，總共富集到2538 個(gè)條目，其中2174 項(xiàng)BP，233項(xiàng)MF，131 項(xiàng)CC，根據(jù)富集顯著程度篩選出排名前10 的條目，并利用R 語(yǔ)言繪制柱狀圖，見圖6。其中，BP 主要涉及細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)及氮化合物的反應(yīng)，外來(lái)刺激的反應(yīng)等；CC 主要涉及等細(xì)胞質(zhì)膜、激素受體復(fù)合物等；MF 主要涉及等DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子等。

2.5.2 KEGG 通路富集分析 利用Metascape 平臺(tái)，設(shè)置P<0.01 作為篩選條件，將交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析，共得到209 條信號(hào)通路，根據(jù)富集顯著程度篩選出排名前20 條目，并利用R 語(yǔ)言繪氣泡圖，見圖7。主要涉及糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號(hào)通路、雌激素信號(hào)、MAPK、AMPK 等信號(hào)通路,同時(shí)，為了進(jìn)一步探索排名前10 種活性成分及其靶點(diǎn)在疾病通路中發(fā)揮的作用，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖8。

2.6 分子對(duì)接結(jié)果 使用AutoDock Vina 1.1.2 軟件對(duì)排名前8 位的關(guān)鍵靶點(diǎn)和活性成分進(jìn)行分子對(duì)接（見表2）。結(jié)合能值越低，二者的結(jié)合效果越好，通常以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 作為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，各靶點(diǎn)和活性成分之間對(duì)接的最低結(jié)合能結(jié)果均小于-5.0 kJ/mol，說明活性成分與受體蛋白具有較好的結(jié)合活性，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果。其中，活性成分與AKT1 及CASP3 對(duì)接后的平均結(jié)合能最小，故選取與AKT1 及CASPS 的對(duì)接結(jié)果并用PYMOL 2.3.0 展示，見圖9。

表2 核心活性成分和核心靶蛋白的結(jié)合能（kcal/mol）

3 討論

本研究通過“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)篩選出核心活性成分主要為槲皮素、木犀草素、山奈酚等。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，具有減少炎癥細(xì)胞因子分泌、抗氧化、清除自由基等藥理作用[12]，槲皮素通過調(diào)節(jié)分子伴侶HSC70 負(fù)向控制MNSFβ 從而抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子[13]。木犀草素通常以糖基化形式存在于各種藥材及食物中,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，木犀草素通過調(diào)控小鼠骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞的極性而抑制炎癥反應(yīng)[14]。山奈酚可以通過對(duì)Dectin-1 和p38 MAPK 通路的抑制，下調(diào)白介素-1β（IL-1β）、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)[15]。因此，筆者推測(cè)二藤湯的關(guān)鍵活性成分主要通過抗炎機(jī)制作用于慢性盆腔炎。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明，AKT1、TNF、IL6、ESR1 及PTGS2 等均具有較高的度值，可能是二藤湯發(fā)揮抗慢性盆腔炎作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。AKT1、TNF、IL6 均參與免疫及炎癥反應(yīng)。細(xì)菌感染后炎癥因子迅速升高，促進(jìn)炎癥細(xì)胞激活，引起盆腔周圍結(jié)締組織發(fā)生充血、水腫，逐漸演變成慢性盆腔炎[16]。PTGS2 又稱環(huán)氧化酶-2（COX-2），是一種前列腺素生成的合成酶，在促炎細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)下，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及凋亡等多種病理過程，ESR1 編碼雌激素受體，當(dāng)與雌激素結(jié)合，釋放致痛物質(zhì)，導(dǎo)致慢性盆腔痛的發(fā)生[17]。

KEGG 通路分析顯示藥物作用靶點(diǎn)主要富集于MAPK、AMPK 及GE-RAGE 信號(hào)等于炎癥及疼痛相關(guān)的通路。其中，AMPK 信號(hào)通路激活可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1 型極化，減少TNF-α、IL-6 等炎癥因子的釋放，從而抑制炎癥反應(yīng)[18]。MAPK 信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，研究表明，通過抑制miR-21 的表達(dá)進(jìn)而抑制MAPK 信號(hào)通路的活化，可以起到抗炎及止痛作用[19]。AGERAGE 信號(hào)通路在糖尿病及其并發(fā)癥的形成與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，AGEs 可以激活RAGE，會(huì)引起全身性炎癥反應(yīng)和氧化損傷[20]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接初步預(yù)測(cè)裘氏二藤湯多成分、多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路治療慢性盆腔炎的分子機(jī)制，符合中醫(yī)“整體觀”理論。本研究存在一定局限性，由于公共數(shù)據(jù)庫(kù)是實(shí)時(shí)更新的，所以本研究結(jié)果只在一定程度上揭示二藤湯抗慢性盆腔炎的作用機(jī)制，后續(xù)有必要進(jìn)行細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。