白來(lái)航雞半乳糖凝集素-1基因克隆、生物信息學(xué)及組織表達(dá)特性分析

張 凱,夏宇欣,王立強(qiáng)，侯少陽(yáng),溫海燕,葛仕豪,周宛蓉,姜莉莉，樊兆斌

(菏澤學(xué)院藥學(xué)院，菏澤 274015)

半乳糖凝集素(galectin)是一種典型的動(dòng)物半乳糖結(jié)合蛋白，在多種動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布，對(duì)β-半乳糖苷具有較強(qiáng)的親和力，在細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-2]。半乳糖凝集素-1(Gal-1)是第一個(gè)被報(bào)道的哺乳動(dòng)物半乳糖凝集素[3]，作為可溶性多功能蛋白，可通過(guò)結(jié)合多種病毒表面的聚糖從而介導(dǎo)宿主與病原體的相互作用[4]。Gal-1能夠與流感病毒[5]和Nipha病毒[6]的囊膜糖蛋白結(jié)合，抑制二者的感染；通過(guò)與人類(lèi)免疫缺陷病毒1型(HIV-1)殼膜蛋白gp120和宿主受體蛋白CD4上的多糖結(jié)合，促進(jìn)HIV-1的吸附和感染[7]。新城疫病毒(NDV)等禽類(lèi)呼吸道病毒可以誘導(dǎo)雞Gal-1基因在主要靶器官中的表達(dá)上調(diào)。雞Gal-1基因通過(guò)與新城疫病毒(NDV)血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)糖蛋白上的G-四鏈體(G4)N-聚糖結(jié)合發(fā)揮抗NDV作用；對(duì)HN糖基化突變的NDV在Gal-1基因敲除和過(guò)表達(dá)細(xì)胞中的復(fù)制研究表明，NDV的復(fù)制與Gal-1基因的表達(dá)存在特定的糖依賴(lài)方式[8]。Gal-1基因參與機(jī)體在病毒感染早期的抗病毒固有免疫反應(yīng)，可誘導(dǎo)鴨瘟病毒感染鴨的免疫應(yīng)答和抗病毒能力，顯著抑制感染早期鴨瘟病毒的復(fù)制[9]。

目前針對(duì)哺乳動(dòng)物Gal-1基因的研究較為廣泛和深入[3-6]，但對(duì)于家禽Gal-1基因的研究報(bào)道相對(duì)較少。本研究通過(guò)對(duì)白來(lái)航雞Gal-1基因進(jìn)行克隆、測(cè)序及序列分析，利用在線軟件對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并檢測(cè)不同組織中Gal-1基因的表達(dá)，以期為Gal-1基因編碼蛋白的抗病毒功能的深入研究提供有價(jià)值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 3只3周齡健康的白來(lái)航雞購(gòu)自菏澤市某養(yǎng)殖場(chǎng)。屠宰后，采集每只白來(lái)航雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、十二指腸、空腸、盲腸、直腸、腺胃、肌胃、胸肌和腿肌組織，置于1.5 mL RNase/DNase Free離心管中，―70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、2×TaqPCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、質(zhì)粒小提試劑盒、pGM-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、T4 DNA連接酶等均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶BamH Ⅰ與NotⅠ購(gòu)均自寶日醫(yī)學(xué)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中原雞Gal-1基因序列(登錄號(hào)：NM_205495.2)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)Gal-1基因擴(kuò)增引物及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物信息見(jiàn)表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2Gal-1基因克隆及測(cè)序 按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取雞各組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的脾臟cDNA為模板，進(jìn)行雞Gal-1基因PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL:2×TaqPCR MasterMix 25 μL,cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)膠回收試劑盒回收，與pGM-T載體16 ℃過(guò)夜連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種于LB(Amp+)平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)圓滑白色菌落，PCR驗(yàn)證正確后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。用NCBI中BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行相似性比對(duì)。

1.2.3 相似性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 利用DNAStar中的MegAlign軟件將白來(lái)航雞(White Leghorn chicken)與綠頭鴨(Anasplatyrhynchos，XM_005015962.4)、火雞(Meleagrisgallopavo，XM_003202240.3)、珍珠鳥(niǎo)(Taeniopygiaguttata，XM_012569200.1)、馬(Equuscaballus，XM_001501032.5)、藏羚羊(Pantholopshodgsonii，XM_005955615.1)、羊駝(Vicugnapacos，XM_006207063.2)、人(Homo，CR456511.1)、小鼠(Musmusculus，NM_008495.2)、大鼠(Rattusnorvegicus，NM_019904.1)的Gal-1基因核苷酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)，利用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 用ProtParam在線軟件(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析Gal-1蛋白的理化性質(zhì)；用ProtScale在線軟件(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析蛋白親/疏水性；用TMHMM 2.0在線軟件(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)對(duì)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；用NetPhos 3.1 Server(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)、NetOGlyc 4.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0)和NetNGlyc 1.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)在線軟件進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)及O-糖基化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)；用SignalP 5.0在線軟件(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；用SMART在線軟件(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域；用SOPMA在線軟件(http:∥npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)SWISS-MODEL在線軟件(http:∥swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5Gal-1基因組織表達(dá)特性檢測(cè) 以雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、腺胃、肌胃、胸肌、腿肌、十二指腸、空腸、盲腸和直腸cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Gal-1基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系10 μL:SYBR Premix ExTaq(2×) 5 μL，上、下游引物各0.3 μL,cDNA 0.5 μL，ddH2O 3.9 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共45個(gè)循環(huán)；熔解程序:95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個(gè)組織樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，利用2-ΔΔCt法計(jì)算Gal-1基因在雞不同組織中的表達(dá)情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有試驗(yàn)都重復(fù)至少3次。使用SPSS 28.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD和鄧肯氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 Gal-1基因CDS區(qū)克隆及序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，擴(kuò)增片段大小約為432 bp(圖1)，與預(yù)期大小一致。應(yīng)用DNAMAN軟件分析測(cè)序結(jié)果顯示，Gal-1基因CDS區(qū)全長(zhǎng)為408 bp，與NCBI上發(fā)表的雞Gal-1基因(登錄號(hào)：NM_205495.2)序列相似性為99.9%，共編碼135個(gè)氨基酸，堿基組成分別為A(24.02%)、C(28.19%)、G(24.51%)、T(23.28%)，GC含量為52.7%，高于AT含量，說(shuō)明Gal-1基因編碼區(qū)的DNA雙鏈較穩(wěn)定。

2.2 Gal-1基因核苷酸序列相似性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用DNAStar中的MegAlign軟件對(duì)不同物種Gal-1基因序列進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果顯示，白來(lái)航雞Gal-1基因與火雞、綠頭鴨和珍珠鳥(niǎo)的相似性分別為97.1%、88.4%和82.2%，與其他物種的相似性較低(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，白來(lái)航雞與火雞親緣關(guān)系最近，與綠頭鴨的親緣關(guān)系相對(duì)較近，形成一個(gè)分支；與其他物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，人、小鼠、馬等哺乳動(dòng)物形成另外一個(gè)分支(圖3)。

圖2 不同物種間Gal-1基因核苷酸序列相似性比對(duì)Fig.2 Similarity alignment of nucleotide sequences of Gal-1 gene in different species

圖3 Gal-1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of Gal-1 gene

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用ExPASy在線工具ProtParam對(duì)Gal-1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，Gal-1蛋白分子式為C677H1034N184O195S6，理論分子質(zhì)量為15.06 ku，理論等電點(diǎn)為6.57，編碼135個(gè)氨基酸，其中甘氨酸(Gly)和亮氨酸(Leu)含量最多，所占比例均為8.9%，含量最低的氨基酸是色氨酸(Tyr)，所占比例為0.7%。Gal-1蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為36.05，低于閾值40，表明該蛋白比較穩(wěn)定。在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)的半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為74.30。

表2 白來(lái)航雞Gal-1蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

2.3.2 親/疏水性預(yù)測(cè) 利用ProtScale工具分析Gal-1蛋白的親/疏水性，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，在72位氨基酸處親水性最強(qiáng)，在23位氨基酸處疏水性最強(qiáng),整個(gè)多肽鏈有2個(gè)明顯的親水區(qū)，綜合平均親水指數(shù)為-0.259。說(shuō)明Gal-1蛋白為親水性蛋白。

2.3.3 跨膜區(qū)、信號(hào)肽和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 利用TMHMM 2.0在線軟件分析Gal-1蛋白跨膜區(qū)，結(jié)果表明該蛋白不存在跨膜區(qū)(圖5)。利用SignalP 5.0 Server工具預(yù)測(cè)Gal-1蛋白信號(hào)肽，結(jié)果表明該蛋白不含信號(hào)肽(圖6)，說(shuō)明該蛋白不是分泌型蛋白。利用EMB的SMART程序?qū)al-1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白具有GLECT家族典型的同源結(jié)構(gòu)域(圖7)。

圖4 白來(lái)航雞Gal-1蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 Hydrophilic and hydrophobic prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

圖5 白來(lái)航雞Gal-1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.5 Transmembrane domain prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

圖6 白來(lái)航雞Gal-1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.6 Signal peptide prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

圖7 白來(lái)航雞Gal-1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.7 Conserved structure domain prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

2.3.4 磷酸化位點(diǎn)與糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 蛋白修飾結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白有6個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)(圖8)；不存在O-糖基化位點(diǎn)，在第94位天冬酰胺殘基的酰胺氮原子處存在1個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)(圖9)，其概率為0.5062。

圖8 白來(lái)航雞Gal-1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.8 Phosphorylation site prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

圖9 白來(lái)航雞Gal-1蛋白N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.9 N-glycosylation site prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

2.3.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)Gal-1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該蛋白由α-螺旋、β-折疊、延伸鏈及無(wú)規(guī)則卷曲組成，所占比例分別為2.22%、10.37%、41.48%和45.93%(圖10)；利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)卷曲及延伸鏈構(gòu)成(圖11)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

①h，α-螺旋；t，β-轉(zhuǎn)角；c，無(wú)規(guī)則卷曲；e，延伸鏈。②線條從長(zhǎng)到短依次代表α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲 ①h,Alpha helix;t,Beta turn;c,Random coil;e,Extended chain.②The lines by the length represent alpha helix,extended chain,beta turn and random coil,respectively圖10 白來(lái)航雞Gal-1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 Secondary structure prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

圖11 白來(lái)航雞Gal-1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.11 Tertiary structure prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

2.4 Gal-1基因在雞各組織中的表達(dá)

由圖12可知，Gal-1基因在肺臟中的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)，在腦中表達(dá)量最低。在不同組織中的表達(dá)排序?yàn)椋悍闻K>盲腸>脾臟>直腸>空腸>肌胃>腺胃>十二指腸>腿肌>肝臟>腎臟>胸肌>心>腦。

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05) Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖12 Gal-1基因在白來(lái)航雞不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.12 Relative expression of Gal-1 gene in different tissues of White Leghorn chickens

3 討 論

半乳糖凝集素是一類(lèi)多功能凝集素,在病原體黏附宿主細(xì)胞和激活宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其不僅可以作為模式識(shí)別受體，還可以作為效應(yīng)因子，通過(guò)促進(jìn)吞噬、自噬等方式調(diào)節(jié)機(jī)體反應(yīng)[10]。Gal-1是一種結(jié)合β-半乳糖苷的哺乳動(dòng)物凝集素，可表達(dá)于多種類(lèi)型的細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)的黏附，在誘導(dǎo)凋亡、影響細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮作用[11-12]。Gal-1可通過(guò)與囊膜病毒表面的糖蛋白結(jié)合，介導(dǎo)宿主與病原體之間的相互作用[13-15]，已有研究結(jié)果表明，Gal-1與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)膜蛋白 E相互作用抑制病毒的復(fù)制，此外，Gal-1可抑制豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、馬動(dòng)脈炎病毒、日本腦炎病毒和豬流行性腹瀉病毒等多種病毒復(fù)制[16]。本研究結(jié)果表明，Gal-1基因CDS區(qū)長(zhǎng)度為408 bp，編碼135個(gè)氨基酸，編碼蛋白無(wú)跨膜區(qū)、不含信號(hào)肽，這與Han等[9]和趙志峰等[17]對(duì)櫻桃谷鴨和梅花鹿的Gal-1基因研究結(jié)果一致。本研究對(duì)Gal-1基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果提示該蛋白可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能，與Camby等[18]研究發(fā)現(xiàn)Gal-1基因主要分布于細(xì)胞質(zhì)，可能通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核中的核糖核蛋白結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、mRNA前體剪切和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮功能的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。本研究對(duì)白來(lái)航雞Gal-1基因編碼蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，該編碼蛋白共有13個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，提示這些位點(diǎn)作為Gal-1蛋白翻譯后修飾的關(guān)鍵位點(diǎn)可能在其發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫等生物學(xué)功能中起到一定作用。本研究通過(guò)預(yù)測(cè)分析雞Gal-1基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)及功能，可為Gal-1蛋白的抗病毒功能的深入研究提供參考依據(jù)。

Han等[9]對(duì)櫻桃谷鴨Gal-1基因組織表達(dá)特性研究發(fā)現(xiàn)，Gal-1在健康櫻桃谷鴨心臟、肺臟、脾臟、腎臟、食管、氣管等不同組織中均有不同程度的表達(dá)。本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)白來(lái)航雞Gal-1基因分析顯示，該基因在白來(lái)航雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、十二指腸、空腸、盲腸、直腸、腺胃、肌胃、胸肌、腿肌組織中均有表達(dá)，其中在肺臟中表達(dá)量最高，在腦中表達(dá)量最低，提示Gal-1基因廣泛分布于宿主的先天免疫系統(tǒng)中，且其表達(dá)量具有組織特異性。Gal-1一般可參與腫瘤細(xì)胞的各個(gè)發(fā)展階段，在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[19-20]。高波波等[21]研究表明，肺癌組織中Gal-1基因陽(yáng)性表達(dá)率較高，張卉等[22]研究證實(shí)Gal-1基因在結(jié)腸腺癌組織中高表達(dá)，且與結(jié)腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)Gal-1基因在多種腫瘤如黑色素瘤、星形細(xì)胞瘤、前列腺癌、甲狀腺腫瘤等中的表達(dá)均增高[23]。因此，抑制Gal-1被認(rèn)為是潛在的治療癌癥的方法之一[24]。Gal-1還能夠與CD4細(xì)胞特異性結(jié)合，被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)抗艾滋病藥物的有效分子靶點(diǎn)[25]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)白來(lái)航雞Gal-1基因編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)及組織表達(dá)特性分析，為后續(xù)研究Gal-1基因在先天免疫系統(tǒng)中的作用提供數(shù)據(jù)支撐，并為Gal-1編碼蛋白功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功克隆了白來(lái)航雞Gal-1基因CDS序列，其全長(zhǎng)為408 bp，編碼135個(gè)氨基酸。Gal-1基因編碼蛋白不屬于分泌蛋白，不存在跨膜結(jié)構(gòu)，無(wú)信號(hào)肽，為穩(wěn)定的親水性蛋白。Gal-1基因在雞不同組織中均有表達(dá)，其中在肺臟表達(dá)量最高，在脾臟和盲腸表達(dá)量相對(duì)較高，在腦中表達(dá)量最低。