響應(yīng)面法優(yōu)化秦嶺黑木耳多糖提取工藝及抗氧化性研究

楊夢佳，韓曉江，王 濤，張 念

（商洛學(xué)院健康管理學(xué)院，陜西 商洛 726000）

0 引言

木耳（Auricularia auricula），又稱黑菜、桑耳、本菌、樹雞等，是一種藥食同源真菌，不僅可以食用，還可以作為藥用，營養(yǎng)豐富且具有很好的保健效果，被稱為“黑色瑰寶”和“人體的清道夫”[1-4]。其主要生理活性成分是木耳多糖，具有較強(qiáng)的抗氧化性[5]，還可以抗腫瘤[6]、抗?jié)?、抑菌[7]、抗衰老、降血糖[8]、降血脂[9]、提高機(jī)體免疫力，對人體組織有一定的保護(hù)作用。秦嶺山區(qū)之中，獨特的氣候條件生長出的黑木耳不僅作為“小木耳，大產(chǎn)業(yè)”助力脫貧致富，更賦予了該地區(qū)黑木耳獨特的口感、營養(yǎng)價值、生理活性等[10-11]。

通過熱水浸提輔助超聲波提取木耳多糖，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化最佳工藝得到提取木耳多糖的最佳工藝參數(shù)，同時對當(dāng)?shù)靥崛〉哪径嗵沁M(jìn)行抗氧化研究，為秦嶺地區(qū)黑木耳食物資源的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陜西秦嶺特產(chǎn)柞水黑木耳；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；苯酚（5%苯酚溶液）、濃硫酸、無水乙醇等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DFY-500C 型搖擺式高速粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；721 型可見光分光光度計，上海菁華科技有限公司產(chǎn)品；TD4-WS 型低速離心機(jī)、HH-S4 型四孔恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 木耳多糖提取工藝

將從秦嶺深處柞水購買的黑木耳除去雜質(zhì)，烘干后密封保存。

黑木耳→烘干→粉碎→熱水浸提（超聲輔助）→抽濾→濃縮→5%苯酚溶液→濃硫酸→蒸餾水定容→冷卻→測定。

1.3.2 單因素試驗

根據(jù)參考文獻(xiàn)[12-16]，結(jié)合試驗研究，最終確定超聲時間20 min，超聲溫度60 ℃，浸提溫度80 ℃，浸提時間60 min，研究料液比分別為1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80 時對多糖提取率的影響。

確定料液比為1∶60，超聲溫度為60℃，浸提時間為60 min，浸提溫度為80 ℃。同時，超聲時間單因素試驗條件定為10，20，30，40，50 min。

確定料液比為1∶60，浸提時間為60min，超聲時間為20min，浸提溫度為80℃。同時，超聲溫度分別設(shè)置為20，30，40，50，60 ℃。

確定料液比為1∶60，超聲時間為20 min，浸提時間為60 min，超聲溫度為60 ℃。同時，設(shè)置浸提溫度分別為50，60，70，80，90 ℃。

確定料液比為1∶60，超聲時間為20 min，浸提時間為60 min，超聲溫度為60 ℃。同時，設(shè)置浸提時間為 15，30，45，60，75 min。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化

通過單因素試驗，確定了提取木耳多糖的最佳料液比為1∶60，最佳熱水浸提時間為80 ℃。利用響應(yīng)面法設(shè)計試驗，試驗因素確定為超聲時間、超聲溫度、浸提時間。水平設(shè)置為三水平，超聲時間分別為40，50，60 min；超聲溫度分別為20，30，40 ℃；浸提時間設(shè)置為75，80，85 min。

1.3.4 多糖提取率計算公式

本試驗采用硫酸－苯酚法[17-18]測定多糖的含量。

式中：C——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的木耳多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——定容后的體積，mL；

N——溶液最終的稀釋倍數(shù)；

m——木耳粉質(zhì)量，g。

1.3.5 木耳多糖的抗氧化性

試驗采用體外方法1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼（DPPH 法） 測多糖的抗氧化性[19-20]。

配制DPPH 溶液。準(zhǔn)確稱取0.8 mg 的DPPH 試劑，溶液用無水乙醇，溶解DPPH 試劑并定容至100 mL 的棕色容量瓶中，得到濃度為0.008 mmoL/L的DPPH 溶液，放入冰箱中避光保存。

取濃度為 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的木耳多糖溶液1 mL 放入具塞試管里，再加3 mL DPPH 溶液，避光反應(yīng)20 min，用無水乙醇作空白，于波長517 nm 處測吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

單因素曲線采用Excel 處理，響應(yīng)面使用Design Expert 11 軟件處理[21-22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對多糖提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對多糖提取率的影響

由圖1 可知，木耳多糖的提取率隨著料液比的增加先增加后下降，最低提取率為22.29%時，料液比為1∶40；最高提取率為22.41%時，料液比為1∶60，極差是0.12%。經(jīng)過料液比的單因素試驗，可以確定出在該試驗中提取秦嶺黑木耳多糖的最佳料液比為1∶60。

2.1.2 超聲時間對多糖提取率的影響

超聲時間對多糖提取率影響結(jié)果見圖2。

由圖2 可知，木耳多糖的提取率隨著超聲時間的增加呈上升趨勢，但在20～50 min 時多糖提取率的增加偏緩，只有在超聲時間由10 min 變?yōu)?0 min時，多糖的提取率有顯著的提升，隨著超聲時間延長，可能會有其他雜質(zhì)隨著多糖一起流入溶液中，影響多糖的測定。在不同超聲時間下，作為響應(yīng)面法研究的影響木耳多糖提取率的單因素之一，以此確定最佳的超聲時間。

圖2 超聲時間對多糖提取率影響結(jié)果

2.1.3 超聲溫度對多糖提取率的影響

超聲溫度對多糖提取率影響結(jié)果見圖3。

圖3 超聲溫度對多糖提取率影響結(jié)果

由圖3 可知，超聲溫度為20～50 ℃時木耳多糖的提取率直線下降。超聲溫度為60 ℃時，木耳多糖的提取率又突然升高，這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是因為超聲溫度越高，對細(xì)胞的破壞性就越大，細(xì)胞中的多種內(nèi)容物就融入到了溶液中，導(dǎo)致測多糖溶液的吸光度突然升高。同時，考慮和其他因素的交互作用，選擇多糖提取率最高的3 個溫度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以此確定超聲溫度提取黑木耳多糖的最佳溫度。

2.1.4 浸提溫度對多糖提取率的影響

浸提溫度對多糖提取率影響結(jié)果見圖4。

圖4 浸提溫度對多糖提取率影響結(jié)果

由圖4 可知，浸提溫度為80 ℃時，木耳多糖的提取率達(dá)到最高，為23.64%。浸提溫度對多糖提取的影響趨勢有規(guī)律可循，選擇水提法的浸提最佳溫度為80 ℃。

2.1.5 浸提時間對多糖提取率的影響

浸提時間對多糖提取率影響結(jié)果見圖5。

圖5 浸提時間對多糖提取率影響結(jié)果

由圖5 可知，熱水提取黑木耳多糖時對黑木耳多糖的提取率影響很大，但沒有規(guī)律可循。當(dāng)浸提時間為30～60 min 時，多糖提取率突然降低，當(dāng)浸提時間為75 min 時，多糖提取率突然上升，不能確定隨著時間延長多糖得率變化趨勢，但浸提時間對多糖提取率極差在0.2%以內(nèi)，考慮因素交互作用，選擇浸提時間作為響應(yīng)面法因素進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面法試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

響應(yīng)面分析試驗設(shè)計表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計

通過單因素試驗，其中有2 個因素的試驗結(jié)果顯著，即料液比1∶60，提取溫度80℃，其余3 個因素超聲時間、超聲溫度和浸提時間有待進(jìn)一步確定。單因素試驗結(jié)果表明，超聲時間在50 min 時，木耳多糖的提取率最高，所以在設(shè)計響應(yīng)面試驗時，超聲時間設(shè)置為50 min 左右2 個水平，即40，50，60 min。超聲溫度和浸提時間水平選擇原理一樣，但由于超聲波清洗儀溫度設(shè)置太低容易受到室內(nèi)溫度的影響，因此選擇超聲溫度為20，30，40 ℃。通過響應(yīng)面法設(shè)計試驗，共設(shè)計17 組試驗。

響應(yīng)面分析試驗設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計

用Design Expert 11 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到以下回歸方程：

為了檢驗黑木耳多糖提取工藝的回歸模型有效性，對該模型進(jìn)行檢驗和方差分析（見表3）。該回歸模型的p＜0.01，表明這個回歸模型極顯著，并且失擬項p=0.112 9＞0.05，表示不顯著，說明該模式成立?？梢杂迷撃Ｊ竭M(jìn)行木耳多糖的最佳工藝優(yōu)化。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面因素交互作用分析

任意兩因素之間的相互作用結(jié)果見圖6。

圖6 任意兩因素之間的相互作用結(jié)果

響應(yīng)面的等高線顏色從藍(lán)變紅表示提取的物質(zhì)含量由少到多，2 個因素的相互作用越大，等高線形成的形狀越趨近橢圓，離心率就越大。等高線所形成的橢圓越扁，則表明這2 個因素的交互作用越明顯。由圖6 可知，超聲時間和浸提時間相互作用的等高線形狀是橢圓形，說明這2 個因素的交互作用較大，超聲時間和超聲溫度的交互作用不是很明顯。木耳多糖的影響因素還可以通過觀察曲線的走勢來判斷。曲線的走勢越陡，說明該因素對木耳多糖的提取率越大，反之則越小。由圖6 可知，影響木耳多糖提取含量的重要因素是超聲溫度，其次是浸提時間，最后是超聲時間。這個結(jié)果和表3 一致。由響應(yīng)面法回歸模型預(yù)測的木耳多糖的最佳提取工藝條件為超聲溫度26.813 ℃，浸提時間75.776 min，超聲時間50.856 min，最大的多糖提取率預(yù)測為25.302%。為了驗證試驗操作方便快捷，將響應(yīng)面法模型優(yōu)化的提取條件設(shè)置為整數(shù)，即超聲溫度26 ℃，浸提時間75 min，超聲時間50 min。在改變條件的情況下，進(jìn)行3 次平行驗證試驗，3 次木耳多糖提取率的平均結(jié)果是24.95%，與模型預(yù)測的結(jié)果相差不大。因此，試驗?zāi)Ｐ涂梢暂^好地模擬和預(yù)測木耳多糖的浸提率和最優(yōu)條件。

2.3 木耳多糖抗氧化性結(jié)果與分析

木耳多糖對DPPH 自由基清除率見圖7。

圖7 木耳多糖對DPPH 自由基清除率

由圖7 可知，木耳多糖有一定的抗氧化性，其抗氧化能力隨多糖含量的提高而提高，與現(xiàn)在有文獻(xiàn)的結(jié)論基本一致[23]。在木耳多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL 時，對自由基的清除率高達(dá)60.4%。木耳多糖的抗氧化性的發(fā)現(xiàn)和研究可以使木耳的銷路更好，使木耳的產(chǎn)業(yè)鏈更加完整，可將其加入到保健食品中，對緩解人體的衰老速度具有積極的意義。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對木耳多糖的最佳提取工藝條件進(jìn)行研究，響應(yīng)面法回歸模型預(yù)測木耳多糖的最佳提取工藝條件為超聲時間50.856 min，超聲溫度26.813 ℃，浸提時間75.776 min，最大的多糖提取率預(yù)測為25.302%。為了驗證試驗操作方便快捷，將響應(yīng)面法模型優(yōu)化的提取條件設(shè)置為整數(shù)，即超聲溫度26 ℃，浸提時間75 min，超聲時間50 min，進(jìn)行3 次平行驗證試驗，3 次木耳多糖提取率的平均結(jié)果為24.95%，與模型預(yù)測的結(jié)果相差不大。木耳多糖的抗氧化性采用DPPH 法對其進(jìn)行測定，不同質(zhì)量濃度的多糖溶液的抗氧化性不同，質(zhì)量濃度越大，抗氧化性越強(qiáng)。當(dāng)木耳多糖的質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除率達(dá)到60.4%。