枯草芽孢桿菌DZSY21 對致病菌生物膜的抑制研究

付春情，薛婉婷，韓旺旺，魯瞳彤，王海心，陳冠宇，姚沛琳，徐禮生，蘇 博

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000）

食品中毒及食品安全問題長期以來備受人們關(guān)注，常見致病菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌[1-2]。傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑存在潛在的危害，因此新型天然生物防腐劑的開發(fā)已成為食品添加劑發(fā)展最熱門的方向之一。目前，我國允許使用的2 種天然微生物防腐劑為納他毒素和乳酸鏈菌素[3]。然而，乳酸鏈菌素的抑菌譜較窄，僅對G+細(xì)菌有明顯的抑制生長作用，不能抑制G-細(xì)菌和真菌；納他毒素能殺死霉菌、酵母菌和絲狀真菌，但不能殺死細(xì)菌。因此，開發(fā)出一種安全、廣譜的微生物天然食品防腐保鮮劑具有重要意義[4]。

枯草芽孢桿菌是一種需氧產(chǎn)芽孢的G+細(xì)菌，其特性各式各樣，廣泛存在于自然界中[5]。因其不產(chǎn)生有害毒素，是公認(rèn)的安全微生物[6]。它通過產(chǎn)生活性抗菌物質(zhì)發(fā)揮生物防治作用，主要包括兩類活性抗菌物質(zhì)：抗菌肽和脂肽類化合物[7]?？莶菅挎邨U菌可產(chǎn)生廣譜的抗菌活性物質(zhì)，能明顯抑制植物病原菌、致病菌等的生長，抗氧化能力強(qiáng)，是極具研發(fā)潛能的微生物天然食品防腐劑和保鮮劑[8-9]。

多數(shù)自然界的細(xì)菌都可形成生物膜，這是對不利環(huán)境的一種保護(hù)機(jī)制[10]。細(xì)菌生物膜是指在相對惡劣的環(huán)境下細(xì)菌生長過程中形成的一種膜狀結(jié)構(gòu)[11]。絕大多數(shù)細(xì)菌在自然界和人類生活中以生物膜存在，并黏附在各類有機(jī)或無機(jī)物體表面[12-14]。此外，細(xì)菌生物膜耐藥性極強(qiáng)，可以在宿主的免疫應(yīng)答和吞噬作用下保護(hù)細(xì)菌[15]。因此，研究如何抑制細(xì)菌生物膜的形成成為食品及其他學(xué)科的要點(diǎn)[16-17]。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

試驗(yàn)菌：枯草芽孢桿菌DZSY21（分離于杜仲葉內(nèi)）、解淀粉芽孢桿菌FZB42、枯草芽孢桿菌OKB105。

指示菌（致病菌）：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、李斯特菌。

1.1.2 試劑及儀器

主要試劑：腦心浸出液肉湯（BH）I，青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司提供；PI 染料，上海生物工程有限公司提供；胰蛋白胨、牛肉浸膏等其他化學(xué)試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

主要儀器：WT-ZNO 型超凈工作臺，鄭州中旺實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司產(chǎn)品；智能生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；MuLtiskan GO 酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司產(chǎn)品；OLYMPUS IX71 型熒光倒置顯微鏡，廣州市明美科技有限公司產(chǎn)品等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌對指示菌生物膜形成定量和定性分析

（1） 微孔板法定量。O Toole G A 等人[18]方法中，聚苯乙烯材質(zhì)的96 平底孔板通常作為對體外生物膜進(jìn)行定量的載體。指示菌過夜培養(yǎng)，分別調(diào)節(jié)菌液濃度 OD600=0.3、OD600=0.5、OD600=0.7，96 孔板每孔加入不同吸光度下指示菌菌懸液150 μL 與試驗(yàn)菌菌液或上清液150 μL，于37 ℃下培養(yǎng)24 h。移除孔內(nèi)液體，pH 值為7 的PBS 緩沖液洗滌2 次，甲醇溶液固定15 min，移除孔內(nèi)液體，吹干。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的結(jié)晶紫溶液染色20 min，清除染液，pH 值為7 的PBS 緩沖液洗滌2 次，吹干。加體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇 300 μL，靜置 30 min，吸出 200 μL 洗脫液到另一孔板中，酶標(biāo)儀于波長570 nm 測吸光度。做5 組平行試驗(yàn)，并重復(fù)3 次。分別以甲醇和培養(yǎng)基做陽性和陰性對照。

（2） 熒光顯微鏡法。在直徑6 cm 的玻璃培養(yǎng)皿中放入18 mm×18 mm 規(guī)格的無菌蓋玻片，加入1 mL指示菌懸液和3 mL 試驗(yàn)菌懸液，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，取出玻片PBS 沖洗3 次，去除表面浮游細(xì)菌，立即室溫避光條件用熒光染料PI 對死菌進(jìn)行染色。30 min 后，取出玻片，沖洗染液，在熒光顯微鏡下觀察成膜情況[19]。

1.2.2 應(yīng)用性試驗(yàn)

牛奶和蔬果防腐試驗(yàn)：向每個試管中加入15 mL純牛奶，再加入300 μL 的指示菌菌液?？瞻讓φ战M不加試驗(yàn)菌，其余分別加入500 μL DZSY21、FZB42、OKB105 菌液及其上清液。振蕩混勻后置于37 ℃下培養(yǎng)，觀察牛奶變質(zhì)情況。用75%乙醇對蔬果表面消毒后，將致病菌噴灑在其表面，于37 ℃下培養(yǎng)4 h，分為3 組，空白組不進(jìn)行操作，分別將DZSY21、FZB42、OKB105 菌液及其上清液涂抹在它們表面，再次放入37 ℃培養(yǎng)箱中觀察腐敗狀況。做3 組平行試驗(yàn)，并重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物膜抑制性分析

2.1.1 生物膜形成量分析

不同OD 值指示菌生物膜形成量見圖2，試驗(yàn)菌菌液對指示菌生物膜形成量的影響見圖3，試驗(yàn)菌上清液對指示菌生物膜形成量的影響見圖4。

圖2 不同OD 值指示菌生物膜形成量

圖3 試驗(yàn)菌菌液對指示菌生物膜形成量的影響

圖4 試驗(yàn)菌上清液對指示菌生物膜形成量的影響

由圖2 可看出，在吸光度為0.3 時生物膜形成量最多，故在后續(xù)試驗(yàn)在吸光度為0.3 時進(jìn)行。在以培養(yǎng)基為陰性對照，甲醇為陽性對照的條件下，由圖3可看出，枯草芽孢桿菌DZSY21 菌體抑制指示菌生物膜形成量最好，F(xiàn)ZB42 其次，OKB105 最差。由圖4 可看出，枯草芽孢桿菌DZSY21 上清液抑制指示菌生物膜形成量最好，OKB105 其次，F(xiàn)ZB42 最差。從綜合的角度來看，枯草芽孢桿菌菌體和上清液對試驗(yàn)菌生物膜的形成均表現(xiàn)出較好的抑制效果，但是枯草芽孢桿菌上清液的作用效果較菌體抑制效果差。

2.1.2 熒光顯微鏡定性檢測生物膜構(gòu)造

熒光顯微鏡下生物膜構(gòu)造見圖5。

圖5 熒光顯微鏡下生物膜構(gòu)造

由圖5 可看出，A、B 和C 圖分別為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和李斯特菌的生物膜構(gòu)造，D、E 和F 圖分別為加了DZSY21 后的生物膜構(gòu)造。同一熒光強(qiáng)度下，未添加試驗(yàn)菌處理的細(xì)菌生物膜，死菌菌體成團(tuán)塊蘑菇狀緊密地連接在一起，黑色區(qū)域?yàn)榭谞钔ǖ?，呈現(xiàn)出典型的生物膜結(jié)構(gòu)。添加試驗(yàn)菌的指示菌生物膜都呈現(xiàn)出被打散抑制的情況，且DZSY21 抑制效果最好，OKB105 次之，F(xiàn)ZB42 最差。

2.2 牛奶及蔬果防腐試驗(yàn)結(jié)果

牛奶防腐試驗(yàn)見圖6，尖椒防腐試驗(yàn)見圖7，千禧果防腐試驗(yàn)見圖8，草莓防腐試驗(yàn)見圖9。

圖6 牛奶防腐試驗(yàn)

圖7 尖椒防腐試驗(yàn)

圖8 千禧果防腐試驗(yàn)

圖9 草莓防腐試驗(yàn)

由圖6 可看出，在37 ℃下放置5 d 后，空白組的牛奶已發(fā)生變質(zhì)，出現(xiàn)分層，伴有明顯酸味。從左到右分別為上清液和菌液 OKB105、FZB42、DZSY21，除DZSY21 試驗(yàn)組未見明顯腐敗現(xiàn)象外，其余都出現(xiàn)明顯腐敗狀況，且OKB105 腐敗最為嚴(yán)重，F(xiàn)ZB42 其次。

由圖7 ～圖9 可看出，從左到右分別為空白組、菌液組與上清液組，噴灑致病菌的空白組腐敗最為嚴(yán)重，而噴灑離心上清液組有較明顯腐爛情況，其中腐爛情況OKB105＞FZB42＞DZSY21，噴灑菌液一組基本完好。

3 結(jié)論

在指示菌OD600為0.3 時生物膜的形成量最多，OD 值大小與生物膜形成量并非呈現(xiàn)正相關(guān)。抑制生物膜的試驗(yàn)結(jié)果表明，在OD 值恒定時，枯草芽孢桿菌DZSY21 及其上清液的抑制效果要好于另2 個試驗(yàn)菌，且菌體的抑制效果好于上清液。試驗(yàn)中，菌液和上清液對于抑制致病菌生物膜形成差別較大，且尚未發(fā)現(xiàn)二者的相關(guān)性。熒光顯微鏡下，枯草芽孢桿菌DZSY21 對致病菌生物膜具有破壞力，且對不同致病菌破壞力不同，對照組試驗(yàn)菌對致病菌的破壞力較弱。應(yīng)用性試驗(yàn)中，選用易被致病菌感染或存在的蔬果和牛奶，處理后的牛奶于37 ℃下放置5 d 后，空白對照組的牛奶已明顯變質(zhì)，有分層現(xiàn)象和酸味，添加菌體的試驗(yàn)組腐敗現(xiàn)象稍好于上清液組，而枯草芽孢桿菌組幾乎沒有變質(zhì)。在蔬果的防腐試驗(yàn)中，經(jīng)枯草芽孢桿菌處理后的試驗(yàn)組品相均好于其他試驗(yàn)組，且菌體組要好于上清液組，表現(xiàn)出枯草芽孢桿菌具有良好的防腐保鮮效果。盡管如此，但還需通過基因調(diào)控機(jī)制與動物臨床試驗(yàn)進(jìn)一步研究枯草芽孢桿菌DZSY21 應(yīng)用于食品是否安全。