,*

(1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津 300384; 2.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院,天津 300384)

病原微生物污染是引起食源性疾病的主要原因之一,嚴(yán)重威脅著人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1]。抑制食品中腐敗微生物生長(zhǎng)繁殖,提高食品安全的研究水平尤為重要[2-3]。隨著科技的發(fā)展和現(xiàn)代食品安全質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高,綠色、安全、高效的抑菌劑開(kāi)發(fā)成為學(xué)者研究的重點(diǎn)[4]。研究發(fā)現(xiàn),小分子肽經(jīng)美拉德反應(yīng)后,不僅可以提升產(chǎn)物氣味和滋味[5],其終產(chǎn)物的抑菌作用也有所增強(qiáng)[6-7]。

陳金斌等[8]研究發(fā)現(xiàn)蟹肉酶解多肽與木糖等美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌等四種常見(jiàn)食品污染菌均有不同程度的抑制作用。李婷等[9]研究發(fā)現(xiàn),100 ℃加熱60 min,黃鯽蛋白抗菌肽-葡萄糖美拉德反應(yīng)物對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑可達(dá)28.9 mm。董志儉等[10]以低值蝦酶解液為原料,通過(guò)美拉德反應(yīng)制備蝦味香精,發(fā)現(xiàn)其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有較好的抑菌性。研究表明,美拉德反應(yīng)的抑菌性可能與產(chǎn)物中的類黑精[11]、氨基還原酮、吲哚[12]等衍生物及其氧化還原電位有關(guān)[13]。發(fā)酵牛肉調(diào)味料(Fermented Beef Flavorings,FBF)是以牛骨肉末為原料,經(jīng)高壓浸提、酶解、發(fā)酵、美拉德反應(yīng)等環(huán)節(jié)制成的一種熱反應(yīng)肉味香精[14]。本實(shí)驗(yàn)室前期確定了FBF的抑菌活性,同時(shí)從常用的15株肉品發(fā)酵劑中篩選得到WBL-45(木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+清酒乳桿菌)、VHI-41(木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌)、清酒乳桿菌(Lactobacillussake,LS)為發(fā)酵劑制得的FBF抑菌活性更強(qiáng)[15],但是FBF的抑菌方式并未明確。

試驗(yàn)以WBL-45、VHI-41、LS為發(fā)酵劑制作FBF,選用大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分別作為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的典型指示菌,通過(guò)測(cè)定不同F(xiàn)BF對(duì)三株指示菌的半數(shù)抑制濃度(Inhibitory Concentration 50,IC50)、FBF處理指示菌后的生長(zhǎng)曲線、菌體細(xì)胞形態(tài)的變化以及FBF對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響,綜合分析FBF的抑菌機(jī)理,從而為FBF更好地應(yīng)用于食品產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍牛骨肉末(骨肉比為3∶7) 頂興(天津)食品科技發(fā)展有限公司提供;WBL-45、VHI-41 意大利薩科公司；LS 薩科商業(yè)復(fù)合菌中分離純化獲得;風(fēng)味蛋白酶(500 LAPU/g)、復(fù)合蛋白酶(1.5 AU/g) 丹麥諾維信公司;金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌(CMCC 50094) 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供;MRS液體培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨、氯化鈉、氫氧化鈉 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy有限公司;THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Friocell 22恒溫恒濕培養(yǎng)箱 艾力特國(guó)際貿(mào)易有限公司;Bioscreen C微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司;Phenom Pro臺(tái)式掃描電鏡 Phenom word BV公司;2265FS溶液EC計(jì) 沃德精準(zhǔn)(北京)科貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)了四組,具體分組介紹見(jiàn)表1。

1.2.2 菌種的活化及菌懸液的制備 WBL-45、VHI-41、LS發(fā)酵劑于MRS液體培養(yǎng)基37 ℃連續(xù)活化3代。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下活化3代,用無(wú)菌LB稀釋至107CFU/mL。

1.2.3 不同F(xiàn)BF的制作

1.2.3.1 工藝流程 原料選擇(牛骨肉末)→高壓浸提→酶解→發(fā)酵12 h(或不發(fā)酵)→美拉德反應(yīng)→過(guò)濾[15]。

1.2.3.2 操作要點(diǎn) a.高壓浸提:將63 g牛骨肉末及252 g蒸餾水以1∶4的比例混合,0.1 MPa、121 ℃下加熱4 h。吸取5 mL用于pH的測(cè)定。

b.酶解:浸提液冷卻至室溫,分別添加0.186 g風(fēng)味蛋白酶和0.093 g的復(fù)合蛋白酶,于50 ℃振蕩4.5 h,酶解結(jié)束后沸水浴滅酶20 min。吸取5 mL用于pH的測(cè)定。

c.發(fā)酵:將WBL-45、VHI-41、LS分別接種,30 ℃發(fā)酵12 h,接種量保證在106CFU/mL,發(fā)酵結(jié)束后沸水浴滅菌20 min。吸取5 mL用于pH的測(cè)定。CK組跳過(guò)此步驟。

d.美拉德反應(yīng):添加3.6 g木糖、3.6 g葡萄糖、2.7 g半胱氨酸、1.35 g甘氨酸、1.35 g丙氨酸、5.4 g VB1,攪拌均勻后在110 ℃下美拉德反應(yīng)60 min。吸取5 mL用于pH的測(cè)定。

e.過(guò)濾:將美拉德反應(yīng)液于4 ℃靜置12 h,雙層紗布過(guò)濾去除骨渣和脂肪,過(guò)0.45 μm水膜。FBF于4 ℃貯藏備用。

1.2.4 三種FBF分別對(duì)三株指示菌IC50的確定 參考林洋等[16]方法并作適當(dāng)修改。試驗(yàn)通過(guò)光密度法確定FBF對(duì)指示菌抑制率的影響。設(shè)置7個(gè)系列濃度梯度FBF,通過(guò)觀察指示菌菌液在含不同濃度FBF培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)的差異,探究FBF濃度與抑菌率關(guān)系,以7個(gè)濃度梯度中,抑菌率最接近50%(±5%)的稀釋濃度為IC50濃度。具體操作如下:采用二倍稀釋法,用無(wú)菌鹽水將三種FBF分別稀釋成7個(gè)系列濃度梯度(分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 mL/100 mL),移取上述稀釋液30 μL于96孔板中,與70 μL指示菌懸液進(jìn)行混合。每種FBF終濃度分別為30、15、10、7.5、3.75、1.88、0.93 mL/100 mL。37 ℃反應(yīng)12 h,測(cè)定600 nm下的OD指示菌+FBF值。同時(shí)做空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照,分別測(cè)定600 nm下的ODLB+鹽水、OD指示菌+鹽水、ODLB+FBF。試驗(yàn)以O(shè)D對(duì)照表征指示菌正常生長(zhǎng)狀態(tài),OD實(shí)際值表征指示菌在含有FBF培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況,通過(guò)計(jì)算觀察FBF對(duì)指示菌生長(zhǎng)狀態(tài)的影響,由此確定三種FBF對(duì)三株指示菌IC50。計(jì)算公式如下所示。

表2 FBF處理3株指示菌的終濃度(mL/100 mL)Table 2 Final concentration of three indicator strains treated with FBF(mL/100 mL)

OD實(shí)際值=OD指示菌+FBF-ODLB+FBF

OD對(duì)照=OD指示菌+鹽水-ODLB+鹽水

式中,ODLB+鹽水為70 μL LB+30 μL鹽水600 nm下的OD值;ODLB+FBF為70 μL LB+30 μL FBF600 nm下的OD值;OD指示菌+鹽水為70 μL指示菌+30 μL鹽水600 nm下的OD值。

1.2.5 不同F(xiàn)BF濃度下三個(gè)指示菌的生長(zhǎng)曲線 參考Shi等[17]方法并作適當(dāng)修改。通過(guò)1.2.4試驗(yàn)結(jié)果,確定了三組FBF針對(duì)三株指示菌各自的IC50濃度。由于同一FBF針對(duì)不同指示菌IC50濃度存在差異,同一指示菌不同F(xiàn)BF的IC50濃度也不同。為方便操作和表述,三組FBF均選用兩個(gè)濃度進(jìn)行此部分試驗(yàn)。濃度1的FBF為針對(duì)三株指示菌IC50濃度所對(duì)應(yīng)的不同稀釋倍數(shù),濃度2的FBF為原液。將兩種濃度的FBF 60 μL置于酶標(biāo)板中,分別與140 μL指示菌菌液混合,使得酶標(biāo)板中各組FBF終濃度分別為針對(duì)不同指示菌的IC50濃度和30 mL/100 mL。具體處理的終濃度如表2所示。將樣品置于微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中,于37 ℃條件下每隔15 min測(cè)定各孔樣品在波長(zhǎng)600 nm下的OD值,繪制指示菌經(jīng)FBF處理后的生長(zhǎng)曲線。試驗(yàn)設(shè)置60 μL鹽水+140 μL指示菌為對(duì)照組,同時(shí)測(cè)定CK組原液對(duì)指示菌生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。

1.2.6 不同F(xiàn)BF對(duì)指示菌細(xì)胞形態(tài)的影響 為了更加直觀有效地觀察FBF對(duì)指示菌菌體形態(tài)的影響,試驗(yàn)以LS組為代表,采用高濃度FBF處理指示菌。參考石超[18]方法并作適當(dāng)修改。將大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌于37 ℃,130 r/min活化12 h。三株指示菌均在4 ℃,2000×g下離心15 min,收集菌體,用無(wú)菌生理鹽水沖洗3次后重懸于鹽水中,使OD600 nm約為0.5。取700 μL指示菌重懸液,加入300 μL FBF混合,以700 μL指示菌液+300 μL鹽水為對(duì)照,37 ℃反應(yīng)12 h,離心(4 ℃、6000×g、10 min),2%多聚甲醛溶液(Paraformaldehyde,PFA)+2.5%戊二醛固定,4 ℃過(guò)夜。0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液沖洗樣品3次,每次10 min。使用呈梯度濃度的酒精(50%、70%、80%、90%、100%)洗脫,叔丁醇置換酒精,冷凍干燥,噴金后上掃描電鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.2.7 不同F(xiàn)BF對(duì)指示菌膜通透性的影響 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定指示菌液的相對(duì)電導(dǎo)率研究不同F(xiàn)BF濃度對(duì)膜通透性的影響。參考張赟彬等[19]、Diao等[20]的方法并作適當(dāng)修改。用滅菌的5%葡萄糖溶液將WBL-45、VHI-41、LS組FBF稀釋至不同指示菌的IC50濃度。三株指示菌分別接種于 LB 液體培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h,離心(4000×g,4 ℃,10 min),5%葡萄糖溶液沖洗菌體三次,重懸于5%葡萄糖溶液中,使OD600 nm約為0.5,此為等滲菌液。取等滲菌液3.5 mL,加入IC50濃度的FBF 1.5 mL,37 ℃下培養(yǎng)12 h。測(cè)定0和12 h的電導(dǎo)率,分別記為EC1和EC2，通過(guò)公式計(jì)算，了解IC50濃度下FBF處理指示菌菌液后的相對(duì)電導(dǎo)率(相對(duì)電導(dǎo)率(IC50-FBF),%)。試驗(yàn)采用沸水加熱5 min的指示菌菌液的相對(duì)電導(dǎo)率為對(duì)照[相對(duì)電導(dǎo)率(0FBF)(%)，即不使用FBF處理指示菌，通過(guò)沸水加熱5 min，對(duì)指示菌進(jìn)行處理，觀察菌液相對(duì)電導(dǎo)率的變化]。具體操作如下:取3.5 mL等滲菌液與1.5 mL葡萄糖溶液混合,37 ℃培養(yǎng)12 h后沸水浴 5 min,測(cè)定沸水浴前后的相對(duì)電導(dǎo)率,分別記為EC3和EC4。菌種膜通透性的相對(duì)電導(dǎo)率根據(jù)如下公式計(jì)算。

式中,EC1為FBF與指示菌菌液剛混合時(shí)的電導(dǎo)率;EC2為FBF與指示菌菌液混合12 h后的相對(duì)電導(dǎo)率;EC3為沸水浴前無(wú)菌生理鹽水與指示菌菌液的電導(dǎo)率;EC4為沸水浴后無(wú)菌生理鹽水與指示菌菌液的電導(dǎo)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016處理數(shù)據(jù),用Sigma plot 10.0繪圖,用Statistix 8.1中Tukey HSD進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定FBF對(duì)指示菌的IC50

光密度法是檢測(cè)微生物生長(zhǎng)狀態(tài)的方法之一,微生物菌體在600 nm有特征吸收峰,OD600 nm越高代表菌體數(shù)量越多。本研究測(cè)定了指示菌在含不同濃度FBF培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后的OD600 nm,以反映FBF對(duì)指示菌的生長(zhǎng)抑制作用。OD600 nm值越低,代表FBF對(duì)指示菌生長(zhǎng)抑制越強(qiáng)烈,反之則代表抑制效果較弱。

大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌經(jīng)不同濃度FBF處理后的生長(zhǎng)情況分別見(jiàn)圖1A～C?？傮w而言,高濃度的對(duì)照組(CK)和三組FBF對(duì)大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用(P<0.05);低濃度的牛肉調(diào)味料,尤其是CK組對(duì)菌體的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。與CK組相比,FBF對(duì)菌體的生長(zhǎng)抑制作用更強(qiáng),三組FBF濃度在1.88～30 mL/100 mL范圍內(nèi)對(duì)指示菌的生長(zhǎng)抑制作用呈濃度依賴關(guān)系。WBL-45、VHI-41、LS組FBF對(duì)大腸桿菌的IC50均為3.75 mL/100 mL,而CK組終濃度為30 mL/100 mL時(shí)(體系中最高濃度),其對(duì)大腸桿菌抑制率僅為22%左右。對(duì)乙型副傷寒沙門氏菌而言,WBL-45、VHI-41、LS組IC50為7.5、3.75和3.75 mL/100 mL。四種牛肉調(diào)味基料對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用均隨濃度的增加而增強(qiáng)。VHI-41、LS組FBF對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng),IC50均為1.88 mL/100 mL,WBL-45對(duì)金黃色葡萄球菌的IC50為3.75 mL/100 mL,CK組為10 mL/100 mL。高壓浸提、酶解、發(fā)酵等環(huán)節(jié)可使牛骨肉末中的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)蛋白質(zhì)等降解為小分子肽或氨基酸,低濃度FBF中小分子物質(zhì)的存在可促進(jìn)指示菌生長(zhǎng)繁殖,隨著FBF濃度的升高,抑菌物質(zhì)不斷累積,FBF的抑菌作用增強(qiáng),FBF抑菌作用與濃度存在依賴關(guān)系。

圖1 指示菌IC50的確定Fig.1 Determination of target bacteria IC50 注:A:大腸桿菌IC50的確定;B:乙型副傷寒沙門氏菌 IC50的確定;C:金黃色葡萄球菌IC50的確定。

2.2 指示菌的生長(zhǎng)曲線

進(jìn)一步采用生長(zhǎng)曲線法,探討牛肉調(diào)味基料對(duì)指示菌生長(zhǎng)的控制作用。將大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)在含有IC50及30 mL/100 mL FBF培養(yǎng)基上,監(jiān)控培養(yǎng)24 h的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果如圖2～圖4,曲線1、11、21分別為大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌在37 ℃條件下正常的生長(zhǎng)曲線,可以明確區(qū)分生長(zhǎng)的4個(gè)時(shí)期:延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期[21]。0～100 min是延滯期,100～800 min為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,隨后是穩(wěn)定期。

圖2 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Escherichia coli

注:1:對(duì)照組大腸桿菌生長(zhǎng)曲線;2:WBL-45組濃度2處理的大腸桿菌(WBL-45終濃度為30 mL/100 mL)的生長(zhǎng)曲線(WBL45-30 mL/100 mL);3:VHI41-30 mL/100 mL;4:LS-30 mL/100 mL;5:CK-30 mL/100 mL;6:用濃度1的WBL-45處理的大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線(WBL45-IC50);7:VHI41-IC50;8:LS-IC50。

圖3 乙型副傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of Salmonella paratyphi B

注:11:對(duì)照組乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線;12:WBL-45濃度2處理的乙型副傷寒沙門氏菌(WBL-45終濃度為30 mL/100 mL)的生長(zhǎng)曲線(WBL45-30 mL/100 mL);13:VHI41-30 mL/100 mL;14:LS-30 mL/100 mL;15:CK-30 mL/100 mL;16:用濃度1的WBL-45處理的乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線(WBL45-IC50);17:VHI41-IC50;18:LS-IC50。

圖4 金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of Staphylococcus aureus

注:21:對(duì)照組金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線;22:WBL-45濃度2處理的金黃色葡萄球菌(WBL-45終濃度為30 mL/100 mL)的生長(zhǎng)曲線(WBL45-30 mL/100 mL);23:VHI41-30 mL/100 mL;24:LS-30 mL/100 mL;25:CK-30 mL/100 mL;26:用濃度1的WBL-45處理的金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線(WBL45-IC50);27:VHI41-IC50;28:LS-IC50。

觀察FBF處理對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)狀況的影響,VHI41-IC50、LS-IC50組與對(duì)照組大腸桿菌在100 min左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,CK-30 mL/100 mL組約在150 min進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí),正常狀態(tài)生長(zhǎng)的大腸桿菌菌液OD600 nm約為0.6,高于經(jīng)3組濃度1和濃度2的FBF處理后的大腸桿菌菌液。經(jīng)CK組和三組FBF處理后,大腸桿菌出現(xiàn)延滯期延長(zhǎng),對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延后,穩(wěn)定期OD600 nm值降低的現(xiàn)象。說(shuō)明FBF處理能夠延遲指示菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的到來(lái),降低指示菌的最大比生長(zhǎng)速率,從而抑制其生長(zhǎng)繁殖。這種現(xiàn)象與其他抑菌物質(zhì)對(duì)病原菌的生長(zhǎng)抑制效果一致[22]。在含有高濃度(30 mL/100 mL)FBF的情況下,指示菌在培養(yǎng)的24 h內(nèi)始終未出現(xiàn)明顯增長(zhǎng),OD600 nm接近于平滑直線,說(shuō)明高濃度的FBF可以完全抑制三株指示菌的生長(zhǎng)繁殖,不過(guò)本研究檢測(cè)時(shí)間有限,不確定在延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后指示菌是否還能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。綜合分析圖2～圖4可知,添加IC50濃度的FBF延長(zhǎng)了大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)延滯期,另外,FBF明顯降低了指示菌的最大比生長(zhǎng)速率以及成熟期的最高菌量。與CK組相比,同等濃度的FBF對(duì)菌體的生長(zhǎng)抑制作用更強(qiáng),尤其是對(duì)抑制指示菌最大比生長(zhǎng)速率抑制作用更明顯。FBF與CK組的差異主要在于發(fā)酵處理的差異。發(fā)酵處理使得FBF中抑菌物質(zhì)大量累積,抑制了指示菌的生長(zhǎng)繁殖速度,指示菌37 ℃下生成量少,成熟期指示菌OD600 nm小。

2.3 FBF對(duì)指示菌細(xì)胞形態(tài)的影響

FBF對(duì)菌體生長(zhǎng)的強(qiáng)烈抑制作用,可能源于FBF中各類抑菌物質(zhì)對(duì)菌體代謝的干擾甚至結(jié)構(gòu)的破壞。圖5直觀地展現(xiàn)了經(jīng)LS組FBF處理的各種指示菌的形態(tài)變化。結(jié)果表明:正常狀態(tài)下大腸桿菌(圖5A)、乙型副傷寒沙門氏菌(圖5C)呈桿狀,金黃色葡萄球菌(圖5E)呈球狀,三株指示菌形態(tài)飽滿、外表光滑;而經(jīng)LS組FBF處理12 h后,細(xì)菌表面塌陷,菌體變形,大腸桿菌細(xì)胞表面出現(xiàn)較嚴(yán)重的皺縮和塌陷,部分細(xì)菌表面出現(xiàn)小孔,甚至發(fā)生斷裂(圖5B);乙型副傷寒沙門氏菌細(xì)胞出現(xiàn)孔洞,菌體扭曲變形(圖5D);金黃色葡萄球菌失去了圓滑的球狀形態(tài),部分菌體表面出現(xiàn)孔洞,胞膜完整性遭到破壞,某些菌體出現(xiàn)溶解現(xiàn)象(圖5F)。FBF中的抑菌物質(zhì)可能包含發(fā)酵劑代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、短鏈脂肪酸、抗菌肽以及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等。因此FBF處理后菌體呈現(xiàn)明顯破壞作用。

圖5 掃描電鏡觀察指示菌的形態(tài)(50000×)Fig.5 The morphology of target bacteria observed under scanning electron microscope(50000×)

注:A:正常大腸桿菌形態(tài);B:30% LS處理12 h的大腸桿菌形態(tài);C:正常乙型副傷寒沙門氏菌形態(tài);D:30% LS處理12 h乙型副傷寒沙門氏菌形態(tài);E:正常金黃色葡萄球菌形態(tài);F:30% LS處理12 h的金黃色葡萄球菌形態(tài)。

2.4 FBF對(duì)指示菌膜通透性的影響

試驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)相對(duì)電導(dǎo)率的變化來(lái)考察FBF對(duì)指示菌細(xì)胞膜通透性的影響。一般情況下,相對(duì)電導(dǎo)率越大,說(shuō)明菌體電解質(zhì)滲漏量越多,細(xì)胞膜受損越嚴(yán)重[23]。IC50濃度FBF處理對(duì)指示菌液相對(duì)電導(dǎo)率的影響如圖6所示。不同F(xiàn)BF組對(duì)指示菌液相對(duì)電導(dǎo)率的影響存在明顯差異。IC50濃度FBF和沸水殺菌處理后,大腸桿菌的相對(duì)電導(dǎo)率均升高。沸水殺菌使大腸桿菌的相對(duì)電導(dǎo)率升高了2%,IC50濃度下的WBL-45、VHI-41、LS處理可分別使大腸桿菌的相對(duì)電導(dǎo)率升高10%、3%、11%,由此說(shuō)明:FBF及沸水殺菌處理均可使大腸桿菌細(xì)胞膜通透性增大,胞內(nèi)電解質(zhì)外泄,從而抑制大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖。

圖6 FBF處理對(duì)指示菌菌液相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effects of rhe FBF treatment on relative conductivity of target bacteria 注:不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

觀察乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌經(jīng)IC50濃度FBF處理12 h后相對(duì)電導(dǎo)率的變化,兩種指示菌的相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)降低現(xiàn)象,該結(jié)果與畢振飛等[24]的研究有相似之處,該試驗(yàn)研究了植物抗菌液處理金黃色葡萄球菌8 h內(nèi)相對(duì)電導(dǎo)率的變化,試驗(yàn)結(jié)果表明,抗菌液作用于指示菌后其相對(duì)電導(dǎo)率值呈先下降、后上升的趨勢(shì)。有研究表明,相對(duì)電導(dǎo)率和膜電位存在相關(guān)性,細(xì)胞通透性主要由膜電位決定,小分子電解質(zhì)(鉀電導(dǎo)和鈉電導(dǎo))隨著膜電位去極化程度的增大而增大,隨著超極化程度的增大而降低[25],細(xì)胞發(fā)生去極化,膜電位降低,相對(duì)電導(dǎo)率升高[26],細(xì)胞發(fā)生超極化現(xiàn)象,膜電位升高,相對(duì)電導(dǎo)率降低。由此可以推斷,三組FBF對(duì)大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌膜通透性影響作用不同,FBF處理使大腸桿菌細(xì)胞膜受損,胞內(nèi)電解質(zhì)大量泄露,瓦解了細(xì)胞質(zhì)膜屏障,最終導(dǎo)致菌體死亡。FBF作用于乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌,使細(xì)胞發(fā)生超極化現(xiàn)象,胞膜離子穩(wěn)態(tài)遭到破壞,菌體代謝發(fā)生異常,繼而對(duì)乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制作用。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明:低濃度WBL-45組、VHI-41組、LS組FBF對(duì)大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用,當(dāng)FBF濃度增高到1.88～3.75 mL/100 mL時(shí),其對(duì)指示菌的生長(zhǎng)開(kāi)始出現(xiàn)抑制,且存在著濃度依賴關(guān)系。WBL-45組對(duì)大腸桿菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的IC50濃度依次為3.75、7.5、3.75 mL/100 mL,VHI-41組和LS組FBF對(duì)三株指示菌IC50濃度依次為3.75、3.75、1.88 mL/100 mL。三種FBF能夠抑制三株指示菌的正常生長(zhǎng)和增殖,延長(zhǎng)指示菌延滯期、延遲對(duì)數(shù)期、降低最大生長(zhǎng)速率,從而抑制指示菌生長(zhǎng);IC50濃度下處理指示菌,可使細(xì)胞發(fā)生去極化或超極化,影響菌體電解質(zhì)或小離子物質(zhì)正常運(yùn)輸;FBF還可以破壞細(xì)胞的正常形態(tài),造成菌體死亡。本研究初步探討了FBF的抑菌機(jī)理,其關(guān)鍵抑菌物質(zhì)及作為調(diào)味料應(yīng)用于產(chǎn)品中的實(shí)際抑菌性還需更進(jìn)一步的研究。