基于eNOS/NO信號(hào)通路探討腦清通顆粒對(duì)肝熱痰瘀證高血壓大鼠的作用*

嚴(yán)亞鋒，白海俠，周海哲

陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046

高血壓是最常見(jiàn)的心腦血管疾病之一，也是心腦血管病的首要危險(xiǎn)因素，長(zhǎng)期高血壓會(huì)損害心、腦、腎等器官。研究表明，高血壓的發(fā)病機(jī)制主要涉及血管內(nèi)皮功能紊亂、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(rein-angiotensin-aldosterone-system，RAAS)失衡、交感神經(jīng)系統(tǒng)激活、血管平滑肌細(xì)胞增殖、炎性反應(yīng)等[1-2]，其中，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS) /一氧化氮(nitric oxide，NO)信號(hào)通路與高血壓的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[3-5]。腦清通顆粒是首屆國(guó)醫(yī)大師張學(xué)文教授多年臨床實(shí)踐凝練的經(jīng)驗(yàn)方，處方包括決明子、丹參、川芎、 姜半夏等11味中藥，具有清肝活血、滌痰通絡(luò)的功效，主要用于治療肝熱痰瘀證高血壓、中風(fēng)病、頭痛等[6]。課題組前期研究表明，腦清通顆粒治療肝熱痰瘀證高血壓療效確切[7-8]，但降壓機(jī)制尚不清楚。本研究基于eNOS/NO信號(hào)通路探討腦清通顆粒對(duì)肝熱痰瘀證高血壓大鼠的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物70只6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2020-030，合格證號(hào)：0043221。所有大鼠均分籠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室溫(22±2)℃，晝夜各12 h，自由飲水進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，倫理批準(zhǔn)號(hào)為：SUCMDL20210316001。

1.2 藥物與試劑腦清通顆粒(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心，規(guī)格：15 g/袋，批號(hào)：200601)；卡托普利片(山西津華暉星制藥有限公司，規(guī)格：25 mg/片，批號(hào)：200104)；丙硫氧嘧啶片(上海朝暉藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1903N04)；黑順片配方顆粒(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：200902)。環(huán)孢菌素A(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S17068)；注射用大豆油(浙江田雨山藥用油有限公司，批號(hào)：19210KG)；二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)試劑盒(丹麥DAKO公司，貨號(hào)：K5007)；辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體、RIPA裂解液、eNOS多克隆抗體、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)：GB23303、G2002、GB11086、G2014、G2026)；血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)、eNOS試劑盒[艾萊薩生物科技(上海)有限公司，批號(hào)均為202101]；NO測(cè)定試劑盒(微板法，南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A013-2-1)；精煉豬油(臨沂經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)裕升食用油有限公司)；膽固醇、膽酸鈉、吐溫-80、丙二醇(河南萬(wàn)邦化工科技有限公司)。

1.3 儀器BP-300A型全自動(dòng)大小鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；RM2016型病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；A1型研究級(jí)正置數(shù)碼顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)；Image J 1.8.0圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)。

2 方法

2.1 高脂乳劑配制取80 g豬油、40 g膽固醇置500 mL燒杯中，加熱融化后加入8 g膽酸鈉和4 g丙基硫氧嘧啶，充分?jǐn)噭?，加?0 mL吐溫-80、120 mL 丙二醇及適量的蒸餾水，充分?jǐn)噭蚝蠹诱麴s水定容至400 mL并充分混勻，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用時(shí)加熱融化。

2.2 大鼠分組、模型制備及藥物干預(yù)隨機(jī)從70只6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠中選取10只為正常組，其余60只大鼠按參考文獻(xiàn)所述方法制備肝熱痰瘀證高血壓大鼠模型[6-7]，具體如下：采用環(huán)孢菌素A皮下注射加附子和高脂乳劑灌胃制備肝熱痰瘀證高血壓大鼠模型。測(cè)量大鼠基礎(chǔ)血壓后，以 5 mL·kg-1體積皮下注射25 mg·kg-1環(huán)孢菌素A后，以10 mL·kg-1體積灌胃給予高脂乳劑，最后以10 mL·kg-1體積灌胃給予2 g·kg-1附子溶液(黑順片配方顆粒溶液)，每日各1次，每種給藥間隔 1 h，連續(xù)給藥14 d。當(dāng)大鼠尾部平均收縮壓(systolic blood pressure，SBP)與基礎(chǔ)血壓差值≥20 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，且高于115 mm Hg者，即可判定為高血壓疾病模型建立成功[9]。當(dāng)大鼠出現(xiàn)毛色晦暗、泛黃，易激惹，精神狀態(tài)不佳，飲食減少，口中痰涎增多，嘴唇、舌質(zhì)紫暗，大便秘結(jié)等中的4項(xiàng)及以上者，即可判定為肝熱痰瘀證[10]。取造模成功的大鼠50只，隨機(jī)分為模型組、卡托普利組及腦清通顆粒低、中、高劑量組，每組10只。造模成功的第2天開始給予相應(yīng)藥物灌胃，腦清通顆粒低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予1.3 g·kg-1、2.6 g·kg-1、5.2 g·kg-1的腦清通顆粒溶液，卡托普利組大鼠灌胃給予10 mg·kg-1的卡托普利溶液，正常組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，給藥體積 10 mL·kg-1，每日1次，連續(xù)給藥21 d。

2.3 大鼠動(dòng)脈壓測(cè)定造模前3 d用大鼠血壓測(cè)量系統(tǒng)對(duì)大鼠進(jìn)行血壓測(cè)量適應(yīng)性訓(xùn)練，以消除大鼠應(yīng)激造成的血壓升高。于造模前、造模第7天、造模第14天、給藥第7天、給藥第14天和給藥第21天測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈壓，每只大鼠每次測(cè)量3次，取平均值，記錄平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)。

2.4 HE染色大鼠末次給藥后禁食不禁水12 h，用2%戊巴比妥鈉以40 mg·kg-1劑量腹腔注射麻醉大鼠。打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血后，打開胸腔，剝離剪取胸主動(dòng)脈，用生理鹽水沖洗，剪取1 cm用4%多聚甲醛固定，石蠟切片，脫蠟至水(依次將切片放入二甲苯Ⅰ 20 min，二甲苯Ⅱ 20 min后采用梯度乙醇洗脫，最后用蒸餾水清洗)，HE染色，樹脂封片，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察血管內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化。

2.5 血清AngⅡ、ET-1、eNOS、NO含量的檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作步驟，檢測(cè)大鼠血清中AngⅡ、ET-1、eNOS、NO的含量。

2.6 免疫組化檢測(cè)eNOS蛋白表達(dá)水平將石蠟切片脫蠟至水后進(jìn)行抗原修復(fù)以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的作用，加一抗(稀釋比例為1400)4 ℃孵育過(guò)夜后，再加入與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記二抗(稀釋比例為1200)，室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染3 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性膠封片。在400倍光學(xué)顯微鏡下取5個(gè)視野，應(yīng)用Image J軟件測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物的積分光密度值和陽(yáng)性面積值，計(jì)算二者比值即為平均光密度值(mean optical density，MOD)，以此評(píng)估eNOS蛋白表達(dá)水平。

2.7 Western Blot檢測(cè)胸主動(dòng)脈組織中eNOS蛋白表達(dá)水平剪取胸主動(dòng)脈約60 mg置于勻漿管中，加入10倍體積RIPA裂解液，置于均質(zhì)勻漿機(jī)中勻漿，勻漿后冰浴30 min，每隔5 min震蕩一次確保組織完全裂解。12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。制作10%分離膠與5%濃縮膠，蛋白上樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜30 min，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(稀釋比例為11 000)，4 ℃孵育過(guò)夜；取出條帶，TBST洗滌3次，加入二抗(稀釋比例為15 000)室溫孵育30 min，TBST洗滌3次。按照ECL試劑盒說(shuō)明書配制發(fā)光液，將條帶顯色。用PhotoShop整理去色，Alpha Innotech軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。以β-actin為內(nèi)參，使用Image J軟件進(jìn)行灰度值檢測(cè)及分析。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較正常組大鼠精神良好，毛色白凈、有光澤，舌質(zhì)淡紅，口中無(wú)痰涎，飲食及兩便正常；模型組大鼠精神萎靡、易激怒，毛色晦暗、泛黃，舌質(zhì)紫暗，口中多痰涎，飲食明顯減少，大便秘結(jié)；給予腦清通顆粒干預(yù)后，大鼠的精神狀態(tài)、毛色及舌質(zhì)均有所好轉(zhuǎn)，口中痰涎減少，飲食及大便逐漸恢復(fù)正常。

3.2 各組大鼠MAP的比較造模前，各組大鼠MAP無(wú)明顯差異；造模后，與正常組比較，模型組大鼠MAP極顯著性升高(P<0.01)；給藥干預(yù)后，與模型組比較，腦清通顆粒低劑量組大鼠在給藥14 d后MAP極顯著性下降(P<0.01)；腦清通顆粒中、高劑量組大鼠在給藥7 d后MAP極顯著性下降(P<0.01)。結(jié)果表明，腦清通顆?？山档透螣崽叼鲎C高血壓大鼠的動(dòng)脈血壓。見(jiàn)表1。

表1 腦清通顆粒對(duì)大鼠MAP的影響

3.3 腦清通顆粒對(duì)肝熱痰瘀證高血壓大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)膜的影響HE染色顯示，正常組大鼠血管內(nèi)膜較光滑，結(jié)構(gòu)較完整，未見(jiàn)明顯損傷，平滑肌細(xì)胞排列較整齊；而模型組大鼠血管內(nèi)膜粗糙，結(jié)構(gòu)不完整，有明顯脫落現(xiàn)象，平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少；腦清通顆粒各劑量組大鼠血管內(nèi)膜損傷均得到不同程度改善，表明腦清通顆粒對(duì)血管內(nèi)膜有保護(hù)作用。見(jiàn)圖1。

注：A：正常組；B：模型組；C：卡托普利組；D：腦清通顆粒低劑量組；E：腦清通顆粒中劑量組；F：腦清通顆粒高劑量組圖1 各組血管內(nèi)膜形態(tài)組織學(xué)比較(HE染色，×400)

3.4 腦清通顆粒對(duì)肝熱痰瘀證高血壓大鼠血清 ET-1、AngⅡ、NO及eNOS水平的影響與正常組比較，模型組大鼠ET-1和AngⅡ水平極顯著性升高(P<0.01)，NO和eNOS水平極顯著性降低(P<0.01)；與模型組比較，腦清通顆粒各治療組 ET-1 和AngⅡ水平極顯著性降低(P<0.01)，NO水平極顯著性升高(P<0.01)；腦清通顆粒低劑量組eNOS水平顯著性升高(P<0.05)，腦清通顆粒中、高劑量組eNOS水平極顯著性升高(P<0.01)。結(jié)果表明，腦清通顆粒可降低肝熱痰瘀證高血壓大鼠血清中 ET-1 和AngⅡ水平，升高NO和eNOS水平。見(jiàn)表2。

表2 腦清通顆粒對(duì)肝熱痰瘀證高血壓大鼠血清ET-1、AngⅡ、NO及eNOS水平的影響

3.5 免疫組化法檢測(cè)腦清通顆粒對(duì)肝熱痰瘀證高血壓大鼠胸主動(dòng)脈eNOS的影響與正常組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈中eNOS蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，腦清通顆粒各治療組大鼠胸主動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明，腦清通顆?？商岣吒螣崽叼鲎C高血壓大鼠胸主動(dòng)脈eNOS的蛋白表達(dá)水平。見(jiàn)圖2、表3。

注：A：正常組；B：模型組；C：卡托普利組；D：腦清通顆粒低劑量組；E：腦清通顆粒中劑量組；F：腦清通顆粒高劑量組圖2 各組eNOS的蛋白表達(dá)比較(免疫組化染色，×400)

表3 免疫組化法檢測(cè)腦清通顆粒對(duì)肝熱痰瘀證大鼠胸主動(dòng)脈eNOS的影響 值)

3.6 Western Blot法檢測(cè)腦清通顆粒對(duì)肝熱痰瘀證高血壓大鼠胸主動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)的影響與正常組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)水平極顯著性降低(P<0.01)；與模型組比較，腦清通顆粒各治療組大鼠胸主動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)水平極顯著性升高(P<0.01)。結(jié)果表明，腦清通顆?？商岣吒螣崽叼鲎C高血壓大鼠胸主動(dòng)脈eNOS的水平。見(jiàn)圖3、表4。

注：A：正常組；B：模型組；C：卡托普利組；D：腦清通顆粒低劑量組；E：腦清通顆粒中劑量組；F：腦清通顆粒高劑量組圖3 各組eNOS蛋白表達(dá)條帶圖

表4 Western Blot檢測(cè)各組eNOS的蛋白表達(dá)水平

4 討論

高血壓病歸屬于中醫(yī)“眩暈”“頭痛”等范疇[11-12]，病機(jī)證型繁多，尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[13]。各醫(yī)家對(duì)高血壓病認(rèn)識(shí)各有不同，治法各異[14-16]?！端貑?wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》曰：“人年四十，而陰氣自半也?！比酥林欣夏暌钻幪?，陰虛也易致瘀，加上營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入普遍過(guò)多，體力勞動(dòng)、運(yùn)動(dòng)等消耗性活動(dòng)過(guò)少，脾失健運(yùn)，痰濁內(nèi)生，日久肝熱血瘀痰濁互結(jié)為患，臨床主要表現(xiàn)為頭痛、眩暈、血壓高、心煩急躁、大便秘結(jié)、舌質(zhì)暗紅、舌下可見(jiàn)瘀點(diǎn)及瘀絲等。張學(xué)文教授認(rèn)為多數(shù)高血壓病患者過(guò)食肥甘厚味，恣酒無(wú)度，多靜少動(dòng)，勞心而不勞體，加之工作或?qū)W習(xí)壓力大，肝氣易郁滯，日久易化熱，肝熱煉液為痰，痰阻則血難行，血瘀則痰難化，痰滯日久必致血瘀，血瘀內(nèi)阻，久必生痰，從而表現(xiàn)為肝熱痰瘀證高血壓病[17-19]。對(duì)于肝熱痰瘀證高血壓病，張教授常用具有清肝活血、滌痰通絡(luò)作用的腦清通顆粒治療，肝平熱清，痰去絡(luò)通，血行暢順，血壓乃降。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)環(huán)孢菌素A皮下注射加附子和高脂乳劑灌胃制備肝熱痰瘀證高血壓大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模14天后大鼠血壓明顯升高，精神狀態(tài)差，易激惹，毛色晦暗、泛黃，飲食減少，口中痰涎增多，唇舌紫暗，大便秘結(jié)，表明肝熱痰瘀證高血壓模型制備成功。藥物治療21 d后，各治療組一般狀態(tài)基本恢復(fù)正常，血壓明顯降低，說(shuō)明腦清通顆粒能降低肝熱痰瘀證高血壓大鼠血壓，使肝熱血瘀證大鼠癥狀基本恢復(fù)正常。HE染色結(jié)果顯示，經(jīng)腦清通顆粒治療后，損傷的血管內(nèi)膜得到了明顯改善，提示腦清通顆粒對(duì)血管內(nèi)膜有保護(hù)作用。

高血壓的發(fā)病機(jī)制與eNOS的活性密切相關(guān)，eNOS通過(guò)催化左旋精氨酸生成NO[20-21]。NO是由內(nèi)皮細(xì)胞釋放的最強(qiáng)血管舒張因子，可舒張動(dòng)脈血管，降低血壓[22-23]。ET-1是內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管收縮因子，與NO相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)控血管的收縮舒張[24-25]。血管緊張素II(angiotensinⅡ，AngⅡ)是血管收縮因子，是RAAS系統(tǒng)的重要組成部分，可引起外周血管收縮和醛固酮分泌，導(dǎo)致血壓升高[26-27]。ET-1、AngⅡ、NO三者關(guān)系密切，相互影響，ET-1促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞釋放AngⅡ，而AngⅡ又可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌ET-1；NO抑制ET-1的釋放，從而間接抑制AngⅡ的釋放[28]，相反，ET-1 的釋放增多，又反過(guò)來(lái)影響NO的釋放。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腦清通顆粒能降低肝熱痰瘀證高血壓大鼠血清ET-1和AngⅡ含量，提高血清NO和eNOS的含量，提高主動(dòng)脈血管eNOS的蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明腦清通顆?？梢种聘螣崽叼鲎C高血壓大鼠血液中血管收縮因子的釋放，促進(jìn)血管舒張因子的釋放，從而引起血壓降低。

綜上所述，腦清通顆粒能夠保護(hù)肝熱痰瘀證高血壓模型大鼠血管內(nèi)膜，舒張血管，降低血壓，其機(jī)制可能與抑制血管收縮因子ET-1和AngⅡ的釋放，促進(jìn)血管舒張因子的釋放，激活eNOS/NO信號(hào)通路有關(guān)。