溜曲霉M3b產(chǎn)殼聚糖酶的固體發(fā)酵工藝優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)

姚炎，李菁菁，張雨萌，趙南鵬，丁德征，蘇淑慧，付星

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/國家蛋品加工技術(shù)研究中心，武漢 430070；2.湖北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，武漢430070

殼聚糖酶（chitosanase，EC 3.2.1.132）是一類催化殼聚糖中氨基葡萄糖間的β-1，4-糖苷鍵斷裂，并水解釋放殼寡糖的糖苷水解酶［1］。殼聚糖酶水解而形成的殼寡糖具有良好的水溶性、易于被生物體吸收利用等優(yōu)點(diǎn)［2］，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、生物醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域。殼聚糖酶來源廣泛，近年來已從細(xì)菌、真菌等微生物中篩選到具有潛在應(yīng)用能力的殼聚糖酶發(fā)酵菌株［3］。與細(xì)菌來源的殼聚糖酶相比，真菌殼聚糖酶具有高效性和相容性，生產(chǎn)成本更低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。在生產(chǎn)中，菌株發(fā)酵產(chǎn)酶可分為液體發(fā)酵和固體發(fā)酵，固體發(fā)酵可以使用廉價(jià)的農(nóng)業(yè)殘留物，如麥麩、豆粕、蝦副產(chǎn)品為培養(yǎng)基質(zhì)，從而減少工業(yè)廢水排放，降低生產(chǎn)成本。此外，固體發(fā)酵體系含水量低，不含自由水，更利于水分活度要求低的真菌生長。目前，對(duì)殼聚糖酶來源的真菌菌株固體發(fā)酵研究報(bào)道較少，多數(shù)集中在液體發(fā)酵上，并且真菌菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力普遍較低。針對(duì)高效產(chǎn)殼聚糖酶原始真菌菌株少、殼聚糖酶普遍活力低、純酶價(jià)格昂貴等問題，有必要挖掘產(chǎn)酶活力高、穩(wěn)定性強(qiáng)的真菌菌株，并強(qiáng)化其固體發(fā)酵條件。

溜曲霉與米曲霉有近緣關(guān)系，常用來處理農(nóng)業(yè)纖維類廢棄物，開發(fā)生物蛋白資源，具有較好的生物利用度和安全性。到目前為止，尚未見到溜曲霉產(chǎn)殼聚糖酶的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究從多地土壤中分離出產(chǎn)殼聚糖酶活力較高的溜曲霉，采用固體發(fā)酵手段以提高殼聚糖酶的產(chǎn)量和活力。隨后，對(duì)殼聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，進(jìn)一步驗(yàn)證殼聚糖酶的穩(wěn)定性，以期為殼聚糖酶工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微生物篩選自浙江、河南、湖北、海南、山東等省份的土壤；殼聚糖購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母浸粉購于安琪酵母股份有限公司；豆粕、麩皮購于武漢農(nóng)貿(mào)市場；蛋白質(zhì)Marker試劑盒購于Solarbio（中國北京）。

1.2 培養(yǎng)基

1）富集培養(yǎng)基。A 液：膠體殼聚糖1%、pH 5.5～6.0；B 液：KH2PO40.2%、酵母粉0.2%、無水MgSO40.1%、NaCl 1%、（NH4）2SO41%。

2）液體發(fā)酵培養(yǎng)基。A 液：膠體殼聚糖溶液1%、pH 5.5～6.0；B 液：KH2PO40.22%、Na2HPO40.1%、KCl 0.15%、MgSO4·7H2O 0.15%、CaCl20.02%、NH4Cl 0.5%、酵母浸粉0.3%。

3）初篩培養(yǎng)基。在液體發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%瓊脂。

4）固體發(fā)酵培養(yǎng)基。在液體發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加：麩皮0.8%、豆粕0.8%；A液10 m?、B液20 m?。

1.3 菌株的分離篩選

稱取土壤樣品10 g，加90 m?無菌生理鹽水，攪拌土壤懸浮液。吸取上層清液5 m?至50 m?富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d。富集液進(jìn)行10-1～10-7梯度稀釋，分別取3 個(gè)連續(xù)梯度稀釋液0.1 m?至初篩培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)3～5 d。觀察是否有透明圈產(chǎn)生，記錄測(cè)量透明圈直徑（D）以及菌落直徑（d）大小，計(jì)算D/d值。將產(chǎn)生透明圈的菌株進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，菌株接入50 m?液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min、37 ℃培養(yǎng)3 d。取發(fā)酵液在4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，用DNS 法測(cè)定上清液中殼聚糖酶的活力，將殼聚糖酶活力較高的菌株保存并鑒定。

1.4 固態(tài)發(fā)酵粗酶液的制備

取滅菌好的固體發(fā)酵培養(yǎng)基，加入10 m?滅菌營養(yǎng)液、20 m?1%膠體殼聚糖和3 m?液體發(fā)酵液，37 ℃培養(yǎng)4 d。取培養(yǎng)好的固體曲，加入120 m?0.2 mo?/?醋酸緩沖液（pH 5.6），粉碎，4 ℃低速攪拌2 h。經(jīng)多層紗布過濾，濾液于4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，收集上層清液為粗酶液，4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.5 菌株形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定

肉眼觀察菌株的菌落形態(tài)、顏色等。采用插片法培養(yǎng)真菌，乳酸石炭酸棉藍(lán)染料染色15 min 制片，顯微鏡下觀察，進(jìn)行初步鑒定。菌株送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行18S rDNA 序列測(cè)序，結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行菌株鑒定。

1.6 殼聚糖酶活力及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

根據(jù)張馨月等［4］的方法，從粗酶液中取出部分稀釋，4 ℃下10 000 r/min 離心10 min。取上層清液0.15 m?，加入含0.45 m?1%膠體殼聚糖及0.4 m?醋酸緩沖液（pH 5.6）的試管中（試管提前50 ℃水浴保溫20 min），振蕩均勻，50 ℃水浴30 min，加入0.75 m?的DNS 終止反應(yīng)，沸水浴5 min 顯色。用冰水冷卻至室溫，12 000 r/min 離心10 min，取上清液1 m?，加入微量比色皿，測(cè)定540 nm 下OD 值。以等量煮沸滅活的酶液作空白對(duì)照。根據(jù)氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出還原糖的量，換算殼聚糖酶的酶活力（酶活性）。

酶活力單位定義：在上述條件下，每毫升粗酶液每分鐘產(chǎn)生1 μmo?還原糖（以氨基葡萄糖計(jì)算）所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）。相對(duì)酶活力是以同組試驗(yàn)的最高酶活力為100%，其他酶活力與最高酶活力的比值［5］。剩余酶活力是經(jīng)過一定處理后的酶活力與原來的酶活力的比值。

按照Brad-ford 法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.7 產(chǎn)殼聚糖酶的固體發(fā)酵工藝的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

除了豆粕和麩皮、酵母浸粉，分別采用不同碳源：1%膠體殼聚糖+1%葡萄糖、1%膠體殼聚糖+1%蔗糖、1%膠體殼聚糖+1%淀粉、1%膠體殼聚糖、1%粉末殼聚糖、1%膠體幾丁質(zhì)、1%粉末幾丁質(zhì)、1%葡萄糖、1%蔗糖、1%淀粉，考察碳源對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

在最佳碳源下分別添加相同質(zhì)量的不同氮源（NH4Cl、（NH4）2SO4、NaNO3、蛋白胨和牛肉膏），不同比例的麩皮和豆粕（14∶2、12∶4、10∶6、8∶8、6∶10、4∶12、2∶14），不同接種量的液體發(fā)酵液（1、2、3、4、5 m?），按照不同發(fā)酵時(shí)間（3、4、5、6、7 d），設(shè)置不同起始pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0），不同溫度（27、32、37、42、47 ℃），分別研究各因素對(duì)菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響，以確定各單因素的最佳參數(shù)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取固體發(fā)酵的溫度、時(shí)間、起始pH，設(shè)計(jì)三因素三水平的?9（33）正交試驗(yàn)。

1.8 殼聚糖酶的純化

將發(fā)酵浸提的粗酶液緩慢攪拌加入干燥的硫酸銨固體粉末，達(dá)到80%的飽和度，冰水浴30 min，4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，收集沉淀［6］。用0.2 mol/?、pH 5.6 的HAc-NaAc 緩沖液溶解，透析過夜。上載到Q SFF 離子交換柱，采用20 mmol/?pH 7.2磷酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫液，測(cè)定酶活力。

1.9 SDS-PAGE電泳、酶譜和生物質(zhì)譜分析

采用12%分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDSPAGE 電泳，考馬斯亮藍(lán)G-250 染色觀察目標(biāo)蛋白質(zhì)，并使用蛋白質(zhì)Marked 試劑盒（Solarbio，中國北京）分析該殼聚糖酶的分子質(zhì)量。酶譜分析參照本實(shí)驗(yàn)室之前的研究［4］，在電泳分離膠中加入100 mg/?乙二醇?xì)ぞ厶沁M(jìn)行酶譜分析。將分離膠放置在紫外燈下觀察，殼聚糖酶活性帶顯示為藍(lán)色暗帶。

蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 后采用電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-Q-TOF2）鑒定蛋白質(zhì)肽段序列［7］，通過Peptide sequencing 軟件分析得到3 個(gè)肽段序列，將肽段序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析。

1.10 殼聚糖酶AtChito40的酶活力測(cè)定

采用乙酸-乙酸鈉（pH 3.0～6.0）、NaH2PO4-Na2HPO4（pH 6.0～7.5）、Tris-HCl（pH 7.5～9.0）、甘氨酸-氫氧化鈉（pH 9.0～10.0）緩沖液體系（50 mmol/?）溶解底物，將純酶液適當(dāng)稀釋，測(cè)定殼聚糖酶活力，以殼聚糖酶活力最大值為100%，確定最適反應(yīng)pH。考察酶的pH 穩(wěn)定性，將殼聚糖酶在pH 3.0～10.0 處理30 min，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定剩余酶活力。在最適pH下，不同溫度（30～90 ℃）測(cè)定酶活力，以最大殼聚糖酶活力值為100%，分別計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活［8］。將殼聚糖酶液置于不同溫度（30～90 ℃）水浴保溫30 min，放入冰水浴中冷卻30 min。按上述方法在最適溫度和最適pH條件下測(cè)定剩余酶活力［9］。

1.11 殼聚糖酶AtChito40水解殼聚糖試驗(yàn)

殼聚糖酶與1%膠體殼聚糖在50 ℃下攪拌8 h進(jìn)行水解反應(yīng)，不同時(shí)間點(diǎn)取樣，煮沸20 min 后滅活，12 000 r/min 離心10 min，取上層清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾。采用用薄層層析法（T?C）分析殼聚糖酶液的降解產(chǎn)物［10］。展開劑配方為正丁醇∶冰醋酸∶水∶氨水=10∶5∶5∶1（體積比），顯色劑配方為硫酸∶甲醇=1∶9（體積比）。

1.12 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)所有樣品均重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值，采用Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Origin 2018 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選

通過富集培養(yǎng)，利用膠體殼聚糖作為唯一碳源篩選和分離產(chǎn)殼聚糖酶的菌株，分別測(cè)量透明圈和菌落的直徑，計(jì)算兩者的比值，初步判定菌株降解能力大小，測(cè)定結(jié)果見表1，可見菌株M3b比值最大，且產(chǎn)殼聚糖酶能力較強(qiáng)，初始酶活力達(dá)到11.60 U/m?，產(chǎn)酶穩(wěn)定。因此，選取菌株M3b進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 產(chǎn)殼聚糖酶菌株的生物降解能力Table 1 Biodegradation of the chitosanase-producing strains

2.2 菌株M3b的鑒定

菌株M3b 菌落形態(tài)和透明圈大小如圖1A 所示，可見菌落結(jié)構(gòu)較疏松，中部呈絮狀，菌落中心呈暗黃綠色。由圖1B 油鏡鏡檢結(jié)果可知，分生孢子頭呈球形，分生孢子梗大多有隔，頂囊近球形至燒瓶形，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，?；凶慵?xì)胞，分生孢子較大，多為近球形和卵圓形。有單層?；扇樗崾克崦匏{(lán)染成淺藍(lán)色，因此，將菌株M3b歸為曲霉屬。

菌株M3b 測(cè)序結(jié)果顯示18S rDNA 序列長度為1 298 bp，通過GenBank 數(shù)據(jù)庫的序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）。相似度比較結(jié)果顯示，菌株M3b與溜曲霉（Aspergillus tamarii）的同源關(guān)系最近，相似度最高（99%）。因此，確定菌株M3b為溜曲霉。

2.3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

由圖3A 可知，添加膠體殼聚糖和葡萄糖溜曲霉菌株M3b 產(chǎn)殼聚糖酶活力最高為10.3 U/m?，其次是添加膠體殼聚糖（9.29 U/m?）、膠體殼聚糖和蔗糖（9.30 U/m?）、膠體殼聚糖和淀粉（9.32 U/m?），而添加淀粉、葡萄糖、蔗糖時(shí)，菌株M3b產(chǎn)酶活力最低。

如圖3B所示，當(dāng)添加（NH4）2SO4為氮源時(shí)，菌株M3b 所產(chǎn)酶活力最高，為11.99 U/m?。其他依次為NH4Cl（10.77 U/m?）、NaNO3（7.97 U/m?）。

在最佳碳氮源的基礎(chǔ)上，改變麩皮豆粕的質(zhì)量比，結(jié)果如圖3C 所示，麩皮與豆粕的質(zhì)量比為6∶10，菌株M3b產(chǎn)酶活力最高為13.56 U/m?。

接種不同量的液體發(fā)酵液培養(yǎng)發(fā)酵，結(jié)果如圖3D 所示，當(dāng)接種液體發(fā)酵液的量為3 m?時(shí)，溜曲霉菌株M3b產(chǎn)殼聚糖酶活力最高，為13.68 U/m?。

由圖3E 可見，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH 為7.0 時(shí)，溜曲霉M3b 所產(chǎn)酶活力最高為17.48 U/m?。當(dāng)液體培養(yǎng)基B 液初始pH 在6.0～8.0時(shí)，溜曲霉M3b受pH影響不大，都保持在較高產(chǎn)殼聚糖酶水平，分別達(dá)到最高值的92.3%和76.9%。當(dāng)液體培養(yǎng)基B 液初始pH 低于3.0 時(shí)，溜曲霉M3b 所產(chǎn)殼聚糖酶的活力迅速降低，一般真菌菌株最適合生長的pH 值在5.0～8.0。因此，以pH 7.0為最佳初始pH。

如圖3F 所示，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)溫度為32 ℃時(shí)，菌株M3b 所產(chǎn)殼聚糖酶的酶活力最高為19.88 U/m?，是初始固體發(fā)酵培養(yǎng)的215.2%。當(dāng)溫度為27 ℃和37 ℃時(shí)，菌株仍保持較高的產(chǎn)酶能力，分別為最高值的89.5%和87.9%，當(dāng)溫度高于47 ℃時(shí)，菌株M3b產(chǎn)酶量明顯下降。在一定范圍內(nèi)，生物生長的速率以及化學(xué)反應(yīng)速率在細(xì)胞中都隨著溫度的升高而加快。超出一定的范圍，生物機(jī)體的重要組成部分，如蛋白質(zhì)、核酸等，會(huì)發(fā)生不可逆的破壞。

固體發(fā)酵時(shí)間對(duì)溜曲霉M3b 產(chǎn)殼聚糖酶的影響見圖4，可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵到第6 天時(shí)，菌株M3b 產(chǎn)酶活力最高為16.0 U/m?。發(fā)酵第1 天固體培養(yǎng)基中沒有明顯的菌落生長，第2天可以觀察到白色菌絲，第3天后出現(xiàn)黃棕色孢子，第6、7 天后，菌株開始呈現(xiàn)褐色，由于營養(yǎng)消耗以及菌株代謝產(chǎn)物積累，測(cè)定的殼聚糖酶活力和蛋白含量開始下降。

正交試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時(shí)間對(duì)于酶活力的影響最大，其次是發(fā)酵溫度、起始pH。最優(yōu)組合為發(fā)酵溫度32 ℃、起始pH 7.0、發(fā)酵時(shí)間6 d，此條件下進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)酶活力達(dá)到20.56 U/m?，是初始固體發(fā)酵培養(yǎng)的221.3%。

2.4 殼聚糖酶AtChito40的純化

固體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)緩沖液浸提的粗酶液，經(jīng)硫酸銨沉淀、QSFF 陰離子交換層析純化后得到電泳單一帶。圖5 顯示酶譜中僅出現(xiàn)1 條暗帶，說明該菌株產(chǎn)生的殼聚糖酶只有1 種，對(duì)應(yīng)蛋白的分子質(zhì)量為40 ku。通過SDS-PAGE 電泳圖和酶譜分析，發(fā)現(xiàn)該殼聚糖酶達(dá)到電泳級(jí)純度，并將蛋白命名為AtChito40。

蛋白純化結(jié)果（表2）顯示，該殼聚糖酶酶活回收率為27.5%，純化倍數(shù)為10.7倍。

表2 溜曲霉M3b殼聚糖酶的純化結(jié)果Table 2 Purification of chitosanase from Aspergillus tamarii M3b

2.5 殼聚糖酶AtChito40質(zhì)譜鑒定

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中3 個(gè)肽段分別都存在同源性為100%的殼聚糖酶肽段。肽段MDVDCDG 與Aspergillus nidulansFGSC A4（gi 259480859）、Aspergillus niger（gi 966763517）及Penicillium digitatumPd1（gi 953382223）殼聚糖酶對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基肽段序列同源性為100%。而肽段EVTGEASW?MAR與Aspergillus nidulansFGSC A4（gi 259480859）、Aspergillus fumigatusAf293（gi 146223521）以及Microcystis aeruginosa（gi 754187083）來源的殼聚糖酶肽段序列同源性為100%。肽段EVTGEASW?MAR 則與Penicillium oxalicum114-2（gi 146323521）、Aspergillus nidulansFGSC A4（gi 259480859）和Aspergillus fumigatusAf293（gi 146323521）等來源的殼聚糖酶氨基酸殘基肽段序列同源性達(dá)100%。結(jié)合以上的純化過程和結(jié)果，可以證明該蛋白為殼聚糖酶。值得注意的是，質(zhì)譜顯示的其他眾多片段在數(shù)據(jù)庫中與其他蛋白質(zhì)序列比對(duì)的同源性較低，表明AtChito40可能較為新穎。

2.6 pH 和溫度對(duì)殼聚糖酶AtChito40 活性和穩(wěn)定性的影響

菌株M3b 產(chǎn)殼聚糖酶的最適溫度結(jié)果見圖6A，最適溫度為60 ℃，但該酶在60 ℃保溫30 min，剩余酶活力只有50%左右，在該條件下穩(wěn)定性很差。該酶在50 ℃以下具有很好的穩(wěn)定性，剩余酶活力在98%以上，在55 ℃條件下保溫30 min，仍有66.3%的酶活力。

如圖6B 所示，菌株M3b 產(chǎn)殼聚糖酶的最適pH為5.5。當(dāng)pH 在5.5～6.0時(shí)，殼聚糖酶保持較高的酶活力，pH 在4.0～6.0 的范圍內(nèi)，保持70%的酶活力，在6.0～7.5 的范圍內(nèi)，保持50%的酶活力，菌株M3b殼聚糖酶在較廣的pH 范圍內(nèi)（3.0～9.0）保持相對(duì)穩(wěn)定。

2.7 殼聚糖酶AtChito40 水解特性及產(chǎn)物

以膠體殼聚糖為底物，測(cè)定了殼聚糖酶AtChito40 的水解產(chǎn)物及特性。如圖7 所示，殼聚糖酶將殼聚糖裂解成以（GlcN）2、（GlcN）3、（GlcN）4為主要產(chǎn)物的GlcN 低聚物的混合物，其分子質(zhì)量在300～1 200 u［11］。在前2 h 水解初始階段，酶將殼聚糖裂解為聚合度大于3 的低聚糖，2 h 后（GlcN）2的含量逐漸增加，但沒有單體生成，表明殼聚糖酶AtChito40 不會(huì)降解（GlcN）2。

3 討論

殼聚糖酶是高效、特異降解殼聚糖的酶，利用酶法降解殼聚糖的研究還處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，僅少數(shù)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，高產(chǎn)殼聚糖酶菌株的缺乏是制約殼寡糖規(guī)模化生產(chǎn)的瓶頸。本研究成功篩選出1株產(chǎn)殼聚糖酶活力較高的溜曲霉菌株M3b，從單因素試驗(yàn)結(jié)果可見，溜曲霉菌株M3b 殼聚糖酶的產(chǎn)生需要?dú)ぞ厶钦T導(dǎo)并且粉末殼聚糖對(duì)菌株M3b 產(chǎn)殼聚糖酶的誘導(dǎo)作用低于膠體殼聚糖；在以殼聚糖為碳源的基礎(chǔ)上添加少量葡萄糖要優(yōu)于以膠體殼聚糖為唯一碳源，可能與葡萄糖利于菌株M3b 的生長代謝有關(guān)；同時(shí)幾丁質(zhì)也有一定的誘導(dǎo)能力；僅添加淀粉、葡萄糖或者蔗糖，菌株M3b不產(chǎn)殼聚糖酶。這與馮志彬等［12］研究的結(jié)果一致，酶生物合成的調(diào)節(jié)類型有底物誘導(dǎo)、分解后產(chǎn)生代謝物的阻遏和反饋?zhàn)瓒?，在大多?shù)真菌中殼聚糖酶的合成調(diào)節(jié)是碳源誘導(dǎo)型。同時(shí)發(fā)現(xiàn)溜曲霉M3b 利用無機(jī)氮源比有機(jī)氮源更利于產(chǎn)酶，其中硫酸銨為最佳氮源。采用固體發(fā)酵方法，充分利用豆粕、麩皮為固體培養(yǎng)基原材料，一方面綠色環(huán)保，可減少農(nóng)業(yè)廢棄物對(duì)環(huán)境的不良影響，降低生產(chǎn)成本；另一方面，提高了菌株M3b產(chǎn)殼聚糖的能力，麩皮可以增加固體發(fā)酵基質(zhì)的膨松透氣性，增加與氧氣的接觸，提高固體基質(zhì)的利用率，利于散熱，促進(jìn)菌株生長，增加產(chǎn)酶量［13］。此外，接種量也是影響溜曲霉產(chǎn)殼聚糖酶的重要因素，當(dāng)接種量太低，菌的濃度低，生長緩慢，酶活力低；接種量太高，造成固體發(fā)酵基質(zhì)含水量高，自由水含量高，培養(yǎng)瓶底部堆積，減少固體基質(zhì)內(nèi)氣體含量和氣體交換，影響散熱，不利于菌株的生長。一般固體發(fā)酵初始含水量在30%～70%。

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)固體發(fā)酵的溫度、時(shí)間、起始pH 進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，最優(yōu)組合為發(fā)酵溫度32 ℃、起始pH 7.0、發(fā)酵時(shí)間6 d，在此條件下M3b 產(chǎn)殼聚糖酶水平達(dá)到20.56 U/m?。這與采用固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶鹿皮曲霉（8.26 U/m?）［14］、木霉屬菌株T.harzianum（1.40 U/m?）、T.koningii（1.20 U/m?）、T.viride（1.02 U/m?）和T.olyporum（0.61 U/m?）［15］相比，表明溜曲霉M3b 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶活力更高且具有優(yōu)勢(shì)。

不同菌株產(chǎn)殼聚糖酶的最適溫度不同。本研究中菌株M3b產(chǎn)殼聚糖酶的最適溫度為60 ℃。一般來說，真菌殼聚糖酶的最適溫度在50～55 ℃，F(xiàn)usarium solani最適溫度為40 ℃，Penicilliumi slandicum最適溫度為45 ℃，Aspergillus oryzaeIAM2660 最適溫度為50 ℃［16］。自然界中大部分殼聚糖酶不耐熱。因此，溜曲霉殼聚糖酶相對(duì)于其他真菌殼聚糖酶更適合工業(yè)生產(chǎn)。菌株M3b 產(chǎn)殼聚糖酶的最適pH 為5.5，這與之前報(bào)道的托球菌屬JG［17］和曲霉QD-2［18］產(chǎn)殼聚糖酶在pH 5.6 時(shí)酶活力最高相一致。海洋真菌MF-08 最適pH 5.2，但pH 在4.0～6.0 才相對(duì)穩(wěn)定［5］。Aspergillussp.CJ22-326產(chǎn)生的殼聚糖酶的最適pH 4.0，pH 在3.5～7.5 的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定［19］。一般情況下，真菌較細(xì)菌的穩(wěn)定范圍小，而溜曲霉產(chǎn)真菌殼聚糖酶在較廣的pH 范圍（3.0～9.0）保持相對(duì)穩(wěn)定，寬泛的酸堿適應(yīng)范圍使其具備優(yōu)異的工業(yè)化發(fā)酵優(yōu)勢(shì)。殼聚糖酶AtChito40 水解殼聚糖最后得到產(chǎn)物的聚合度≥2，最小酶解產(chǎn)物為殼二糖。這與類芽孢桿菌TKU047［20］產(chǎn)殼聚糖酶的水解產(chǎn)物在反應(yīng)初期僅產(chǎn)生聚合度大于2 的殼寡糖但沒有氨基葡萄糖（GlcN）的結(jié)果一致，表明殼聚糖酶AtChito40是一種內(nèi)切酶，能更加有效地降解殼聚糖。