化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器的研制及其對谷物中嘔吐毒素的快速檢測

黃偉，何慧禹，魯鵬，陳翊平

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070

嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）是粉紅鐮刀菌、谷禾鐮刀菌等鐮刀菌群產(chǎn)生的一種單端孢霉烯族類代謝產(chǎn)物，屬于劇毒或中等毒物［1-2］，廣泛存在于小麥、大米、玉米等谷物中，在世界范圍內(nèi)污染程度較高，其進(jìn)入人體后可能引起腹瀉、嘔吐、神經(jīng)紊亂、腎臟衰竭等一系列癥狀，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致死亡［3-4］。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》中規(guī)定嘔吐毒素在食品中最大殘留限量（MR?）為1 000 μg/kg［5］，而歐盟要求更為嚴(yán)格，歐盟委員會(huì)條例（EC）429/2008 中規(guī)定DON 在谷物原料中的MR?為750 μg/kg［6］。因此，為保障我國糧食安全以及符合國際貿(mào)易規(guī)則的要求，減少或避免DON 的危害，開發(fā)針對谷物中DON 的高效、靈敏的現(xiàn)場快速檢測方法具有重要意義。

目前，針對谷物中DON 的檢測方法主要有大型儀器分析法［7］和免疫分析法［8］。大型儀器分析方法如高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HP?C-MS/MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC/MS）等具有高效、靈敏、精確等優(yōu)勢，但是其設(shè)備昂貴、樣品前處理復(fù)雜、需要專業(yè)的技術(shù)操作人員，難以滿足現(xiàn)場即時(shí)檢測的需求［9］。傳統(tǒng)的免疫分析法如酶聯(lián)免疫吸附法（E?ISA）具有成本低、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)［10］，廣泛應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域中危害因子的檢測，但其仍存在操作繁瑣、耗時(shí)較長、穩(wěn)定性和精確性差等問題［11］。

近年來，由免疫識(shí)別元件（抗原/抗體）與信號(hào)轉(zhuǎn)換單元（如電、光、聲、熱等）組成的免疫傳感器成為谷物中DON 高效檢測的有力工具［12］。根據(jù)換能器工作原理的不同可以分為光學(xué)免疫傳感器［13］、壓電免疫傳感器［14］和磁免疫傳感器［15］等。在這些免疫傳感器中，化學(xué)發(fā)光免疫傳感器作為光學(xué)衍生發(fā)展的一種傳感手段，兼具生物識(shí)別反應(yīng)的高特異性和化學(xué)發(fā)光的高靈敏度，在食品安全、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［16］。光纖具有優(yōu)異的導(dǎo)光性能，且易與生物識(shí)別分子偶聯(lián)，是理想的化學(xué)發(fā)光生物傳感器固相載體之一［17］。此外，光纖體積小、質(zhì)量輕，易于實(shí)現(xiàn)儀器的小型化和自動(dòng)化［18］。因此，化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器對于谷物中DON 的特異性較強(qiáng)，且具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)，在現(xiàn)場即時(shí)檢測方面有著良好的應(yīng)用前景?；诖?，本研究根據(jù)免疫反應(yīng)-化學(xué)發(fā)光的光纖傳感系統(tǒng)設(shè)計(jì)了一種便攜式、集成化的化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測裝置，旨在為谷物中DON 的高靈敏現(xiàn)場快速檢測提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

嘔吐毒素（DON）、鼠源嘔吐毒素抗體（DONAb，3 mg/m?）、嘔吐毒素完全抗原（DON-BSA，3.5 mg/m?）購自山東藍(lán)都生物科技有限公司。HRP 標(biāo)山羊抗小鼠IgG（1 mg/m?）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。吐溫-20、甲苯、戊二醛（GA）、牛血清白蛋白（BSA）、氫氟酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)48%）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。?umigen SPARC??化學(xué)發(fā)光試劑盒購自廣州市進(jìn)德生物科技有限公司。

磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）和磷酸鹽吐溫緩沖溶液（PBST 含0.05%吐溫-20）均用美國Millipore 公司的離子交換裝置產(chǎn)生的去離子水制備。使用的其他普通化學(xué)品和試劑均為分析級(jí)，購自中國國藥集團(tuán)。大米、小麥、玉米樣品由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供。

石英光纖（SFS400/440/700T Superguide UVVis）購自上海聞奕光電科技有限公司，數(shù)值孔徑（NA）為0.22，光纖纖芯直徑400 μm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

光子計(jì)數(shù)探測器（CH326）、光子計(jì)數(shù)單元（CH297-01）及其軟件模塊購自北京濱松光子技術(shù)有限公司。傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS5）購自美國賽默飛公司；掃描電子顯微鏡（FIB-910）購自德國蔡司公司；原子力顯微鏡（Alphacen 300）購自瑞士納瑟公司；酶聯(lián)免疫光譜分析儀（AQT90 F?ES）購自丹麥雷度公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀（Vanquish Core）購自美國賽默飛公司。

1.3 檢測原理

由化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器原理圖（圖1）可見，光纖纖芯通過硅烷化試劑（APTES）和戊二醛（GA）與一定濃度嘔吐毒素完全抗原（DON-BSA）進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，制備得到可用于免疫反應(yīng)檢測的光纖探針。將光纖傳感區(qū)域浸入含有樣品和鼠源DON 抗體（DON-Ab）的混合溶液中，當(dāng)樣品中含有目標(biāo)物DON 時(shí)，光纖上固定的DON-BSA 與溶液中DON 競爭性地結(jié)合DON-Ab，DON濃度越大，固定在光纖上的DON-Ab 濃度越小，加入HRP 酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG 后，光纖上捕獲的HRP 酶越少，其與觸發(fā)劑接觸后，HRP 酶催化發(fā)光底物吖啶酯從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生一個(gè)較弱的化學(xué)發(fā)光信號(hào)；相反，當(dāng)樣品中沒有目標(biāo)物時(shí)，抗體僅與化學(xué)發(fā)光光纖傳感器上固定的DON-BSA形成免疫復(fù)合物，加入HRP 酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG 后，光纖上捕獲的HRP 酶濃度較大，加入過氧化脲觸發(fā)劑后，產(chǎn)生一個(gè)較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，其強(qiáng)度與目標(biāo)物DON 濃度呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)而通過計(jì)算化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的差值（ΔC?）可以間接實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的定量分析。

1.4 化學(xué)發(fā)光光纖探針的制備和免疫檢測方法

1）化學(xué)發(fā)光光纖探針的制備。首先將光纖切成6 cm 的小段，用小刀刮去前端約為0.5 cm 的亞克力保護(hù)殼。然后將光纖浸入24%氫氟酸中30 min，以去除光纖表面包層。用0.1 mol/?NaOH 中和氫氟酸，并用超純水洗凈后氮?dú)獯蹈伞⒐饫w浸泡在0.1 mol/?NaOH 中30 min 以活化纖芯表面硅羥基。隨后，處理過的光纖芯分別使用水和甲苯洗滌3次并浸入含APTES 的甲苯溶液（體積分?jǐn)?shù)1%）中引入氨基。氮?dú)獯蹈珊髮⒐饫w芯浸入體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛水溶液孵育2 h，洗凈后將光纖插入5 μg/m?的DON-BSA 中4 ℃避光孵育過夜，使用PBST 洗滌3次。用5%BSA 封閉未結(jié)合的位點(diǎn)，用PBST 洗滌3次后，保存于4 ℃。此時(shí)化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器已制備完成，放置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2）DON檢測過程。將制備好的光纖探針插入含有50 μ?鼠源DON 抗體（10 μg/m?）和等體積不同濃度DON 溶液的離心管中進(jìn)行免疫反應(yīng)，37 ℃孵育1 h，并用PBST 洗滌3 次。然后，將免疫反應(yīng)后的光纖探針反應(yīng)區(qū)插入1 μg/m?HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 中，37 ℃免疫反應(yīng)30 min 后，用PBST 洗滌3 次。最后將光纖免疫反應(yīng)區(qū)域與20 μ?化學(xué)發(fā)光底物吖啶酯（10 mg/m?）和20 μ?觸發(fā)劑（含0.1 mmol/?過氧化脲的Tris-HCl 緩沖溶液）等體積混合溶液接觸，通過光子計(jì)數(shù)器在避光條件下記錄化學(xué)發(fā)光信號(hào)。

1.5 化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器檢測裝置的研制

化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器檢測裝置由顯示器、光纖固定器、試劑盤、旋轉(zhuǎn)升降臺(tái)、檢測器、數(shù)據(jù)采集模塊、電源7 個(gè)部分組成，所有元件集成在一個(gè)32 cm×15 cm×25 cm 黑色亞克力板搭建而成的避光盒中。如圖2所示，檢測器和數(shù)據(jù)采集模塊安裝在黑色盒子的頂部用于收集處理光纖傳遞的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，平臺(tái)內(nèi)置離心管架的升降平臺(tái)由開關(guān)控制，固定在端口上的光纖通過升降平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)與離心管中的反應(yīng)試劑接觸。產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)由光子計(jì)數(shù)探測器（CH326，購自北京濱松光子計(jì)數(shù)股份有限公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，并通過光子計(jì)數(shù)單元（CH297-01）及其配套“光子計(jì)數(shù)軟件.exe”進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，最終結(jié)果會(huì)在頂部的屏幕中顯示。所研制的檢測裝置質(zhì)量約3 kg。

1.6 光纖探針的表征手段

為了驗(yàn)證生物識(shí)別分子在光纖纖芯上的標(biāo)記效果以及光纖探針的表面形貌，本研究采用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）、能量色散光譜儀（EDS）對完全抗原修飾的光纖探針進(jìn)行表征。使用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對光纖表面的特定官能團(tuán)和化學(xué)鍵進(jìn)行分析，檢測光譜波譜為500～4 000 cm-1；通過能量色散光譜儀（EDS）對光纖探針修飾前后的元素進(jìn)行考察，檢測元素為C、N、O、Si、P 和S；采用原子力顯微鏡（AFM）對光纖表面微觀構(gòu)造進(jìn)行直觀分析，比例尺為400 nm。

1.7 性能評(píng)價(jià)

以DON 濃度為橫坐標(biāo)、化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的差值（ΔC?）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)R2由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合得出，其中ΔC?=C?空白-C?DON，C?為3 次平行試驗(yàn)的平均值（n=3）。根據(jù)3δ/S（δ為樣品空白響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為校正曲線的斜率）求得方法的檢出限（?OD）。

1.8 特異性和抗干擾性能測試

使用嘔吐毒素（DON）、黃曲霉毒素（AFB1）、赭曲霉毒素（OTA）、玉米赤霉素烯酮（ZEN）對生物傳感器特異性進(jìn)行評(píng)估。所有真菌毒素均為1 μg/m?，其他反應(yīng)條件相同，根據(jù)測得的化學(xué)發(fā)光差值ΔC?來評(píng)價(jià)該傳感器對DON的特異性。

使用含有黃曲霉毒素（AFB1）、赭曲霉毒素（OTA）、玉米赤霉素烯酮（ZEN）的DON 溶液評(píng)估該傳感器的抗干擾能力。試驗(yàn)溶液分別為DON 和AFB1 溶液，DON 和OTA 溶液，DON 和ZEN 溶液，DON和谷蛋白混合溶液，DON和葡萄糖混合溶液，對照組為不含干擾抗原的DON溶液，所有真菌毒素均為1 μg/m?，谷蛋白為100 μg/m?，葡萄糖為1 mg/m?。其他反應(yīng)條件相同，根據(jù)測得的化學(xué)發(fā)光差值ΔC?來評(píng)價(jià)該傳感器的抗干擾能力。

1.9 光纖探針的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

首先，按照本文“1.3 1）”所述方法，制備15 支光纖探針，并將其浸泡在PBS 溶液中，4 ℃下避光保存30 d，每隔5 d檢測1次化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，每次測試3組，每組1 根，根據(jù)化學(xué)發(fā)光信號(hào)差值ΔC?判斷光纖探針的穩(wěn)定性。

1.10 實(shí)際樣品的檢測方法

分別稱量10.0 g 小麥、大米和玉米樣品，充分研磨過孔徑180 μm 的篩子后置于錐形瓶中，向其中加入200 m?乙腈-水（體積比1∶9）混合溶液，在搖床上室溫混勻20 min。將混合液過濾并取10 m?濾液用PBS 稀釋至50 m?。將預(yù)先保存在4°C 的免疫親和柱恢復(fù)到室溫，取25 m?上述樣液移至玻璃注射器筒中，將空氣泵與注射器另一端相連調(diào)節(jié)下滴速度，控制液體以1～2 滴/s 的速度流出，直至有空氣進(jìn)入柱內(nèi)。棄置剩余液體后，向免疫親和柱中加入2 m?甲醇洗脫，將洗脫液收集于離心管中用于測試分析。

在小麥、大米和玉米樣品提取液中加入不同質(zhì)量濃度（0.1、5、50、250 和1 000 ng/m?）的DON 標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本文“1.3 3）”所述的方法進(jìn)行目標(biāo)物檢測。同時(shí)，所有樣品均按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.111—2016《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》中HP?C-MS 方法進(jìn)行測定（n=3）。

1.11 數(shù)據(jù)采集及分析

本研究的數(shù)據(jù)采集主要使用光子計(jì)數(shù)探測器（CH326），該探測器通過光纖介質(zhì)傳導(dǎo)收集免疫反應(yīng)產(chǎn)生的光子信號(hào)，隨即傳輸至光子計(jì)數(shù)單元（CH297-01）內(nèi)統(tǒng)計(jì)發(fā)光時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的光子數(shù)，經(jīng)光信號(hào)-電信號(hào)轉(zhuǎn)換后經(jīng)顯示屏讀出化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度C?，最終數(shù)據(jù)收集后采用Origin 2019 軟件作圖，并對化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的檢測性能進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光纖探針的結(jié)構(gòu)表征

由紅外光譜圖（圖3A）可知，未修飾的光纖在3 440 cm-1和1 260 cm-1處分別出現(xiàn)硅醇彎曲振動(dòng)吸收峰和硅氧基反對稱伸縮峰，這與光纖的二氧化硅纖芯材質(zhì)相符。而對于DON-BSA 修飾的光纖，在1 640 cm-1和1 540 cm-1處出現(xiàn)的酰胺Ⅰ帶的C=O伸縮振動(dòng)峰和酰胺Ⅱ帶的N-H伸縮振動(dòng)峰能夠與BSA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)完全對應(yīng)。此外，根據(jù)光纖表面的能量色散光譜圖（圖3B）分析結(jié)果，光纖修飾前主要由C、O 和Si 元素組成，而修飾DON-BSA 的EDS 分析圖中可以明顯看出N、P 和S 等蛋白質(zhì)基礎(chǔ)元素的出現(xiàn)。為進(jìn)一步證明光纖探針的成功制備，采用原子力顯微鏡（AFM）對光纖探針表面的DONBSA 進(jìn)行觀察，可以明顯看出經(jīng)過修飾后的光纖表面（圖3C，D）粗糙且出現(xiàn)了很多直徑約為30 nm的白色顆粒突起附著在光纖表面，與圖3A、B 的表征結(jié)果一致，說明DON-BSA 成功固定在光纖表面，所制備的光纖探針可用于后續(xù)DON的快速檢測。

2.2 光纖探針的穩(wěn)定性

光纖探針的穩(wěn)定性對于評(píng)價(jià)該傳感器的使用成本和檢測效果至關(guān)重要。如圖4結(jié)果顯示，相較于最初的響應(yīng)值，第30 天的化學(xué)發(fā)光響應(yīng)值降低了大約4 000，但剩余響應(yīng)值仍在11 000以上，仍可以保持在一個(gè)較高的響應(yīng)水平。因此，在檢測過程中依然可以實(shí)現(xiàn)DON 的準(zhǔn)確定量檢測。這說明光纖上固定的DON-BSA 在4 ℃的PBS 緩沖溶液中至少可以穩(wěn)定保存30 d，該結(jié)果有力證明了有效的共價(jià)固定策略可實(shí)現(xiàn)DON-BSA與光纖的緊密結(jié)合。

2.3 化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器的條件優(yōu)化

為了保證化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器達(dá)到最佳的檢測效果，需要對試驗(yàn)中可能影響結(jié)果的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在光纖探針構(gòu)建過程中，涉及探針表面DONBSA 的濃度優(yōu)化，如圖5A 所示，當(dāng)DON-BSA 質(zhì)量濃度為5 μg/m?時(shí)有最大化學(xué)發(fā)光值，之后DONBSA 濃度增加但化學(xué)發(fā)光值反而有所下降，這說明DON-BSA 濃度過高出現(xiàn)了空間位阻效應(yīng)抑制了后續(xù)免疫反應(yīng)的進(jìn)行。因此，DON-BSA 為5 μg/m?時(shí)具有最大固定效率。此外，在免疫反應(yīng)過程中，考察了溶液中DON-Ab 的濃度，如圖5B 所示，DON-Ab質(zhì)量濃度從3 μg/m?逐漸升高到10 μg/m?時(shí)，化學(xué)發(fā)光值也隨之升高，但DON-Ab 濃度繼續(xù)升高，化學(xué)發(fā)光值逐漸降低，推測是是由于光纖表面的完全抗原結(jié)合位點(diǎn)有限導(dǎo)致競爭反應(yīng)效率下降，因此，將10 μg/m?的DON-Ab 確定為最佳質(zhì)量濃度。免疫反應(yīng)時(shí)間也是重要參數(shù)之一，如圖5C所示，60 min時(shí)明顯看出化學(xué)發(fā)光值達(dá)到最大且不再隨時(shí)間的延長而增長，表明此時(shí)免疫反應(yīng)已經(jīng)完成，確定免疫反應(yīng)最佳時(shí)間為60 min。

2.4 化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器的特異性和抗干擾性

考慮到實(shí)際檢測過程中谷物樣品中真菌毒素的多樣性，化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器對DON 的特異性檢測是十分必要的。因此，引入了幾種常見的真菌毒素AFB1、OTA、ZEN 進(jìn)行特異性反應(yīng)，所有真菌毒素質(zhì)量濃度均為1 μg/m?。從圖6A 可以看出，化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器僅對DON 有明顯的化學(xué)發(fā)光信號(hào)響應(yīng)值，而對于其他真菌毒素的信號(hào)響應(yīng)可以忽略不計(jì)，這表明該傳感器的信號(hào)ΔC?由特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)生，可特異性識(shí)別DON。誤差棒表示3次測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

為進(jìn)一步證明ΔC?信號(hào)是由化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器對DON 的特異性識(shí)別產(chǎn)生，并且確保復(fù)雜環(huán)境對特異性檢測的干擾極小，抗干擾實(shí)驗(yàn)將常見的真菌毒素（AFB1、OTA、ZEN）以及谷蛋白和葡萄糖分別作為干擾物與DON 溶液進(jìn)行混合，如圖6B 所示，3 種混合溶液AFB1 和DON、OTA 和DON、ZEN和DON 與無干擾物的DON 溶液的ΔC?值基本保持一致，且谷物基質(zhì)成分也對檢測的干擾影響極小，證明了化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器的抗干擾性較好。

2.5 化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器的靈敏度測試

在最優(yōu)條件下，通過化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器對檢測DON 的靈敏度進(jìn)行了分析。根據(jù)競爭免疫原理，DON 濃度與ΔC?呈正相關(guān)。圖7A 中結(jié)果顯示與預(yù)期保持一致，隨著DON質(zhì)量濃度從10 pg/m?增加到10 μg/m?，ΔC?明顯增強(qiáng)，并且在0.1～1 200 ng/m?范圍內(nèi)線性響應(yīng)關(guān)系良好。如圖7B 所示，線性方程為y=2697.72x-3641（其中x表示樣品中目標(biāo)物濃度，y表示化學(xué)發(fā)光信號(hào)的差值），R2=0.997，檢出限為62.7 pg/m?，遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017 中的要求（1 000 μg/kg)，可滿足DON 在各種基質(zhì)中的檢測需要?；瘜W(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器的高靈敏度可能與3 個(gè)因素相關(guān)：（1）化學(xué)發(fā)光底物的高靈敏度，低背景值；（2）較合理的完全抗原固定濃度保證了充足的結(jié)合位點(diǎn)，降低了空間阻抗效應(yīng)；（3）光纖載體具有優(yōu)異的光傳導(dǎo)性，實(shí)現(xiàn)微環(huán)境內(nèi)免疫反應(yīng)到化學(xué)發(fā)光信號(hào)的快速轉(zhuǎn)化。

表1 為化學(xué)發(fā)光免疫傳感器法與其他文獻(xiàn)中報(bào)道的DON 快速檢測方法的試驗(yàn)結(jié)果對比。由表1可見，與其他現(xiàn)場快速檢測方法相比，化學(xué)發(fā)光免疫傳感器法適用于DON 的高靈敏檢測。但與其他非現(xiàn)場快速檢測方法相比，筆者所在實(shí)驗(yàn)室研制的化學(xué)發(fā)光免疫傳感器平臺(tái)具有體積更小、質(zhì)量更輕等優(yōu)勢，并且獨(dú)特的插拔式構(gòu)造簡化了檢測流程，更有利于非專業(yè)人員的現(xiàn)場快速檢測。此外，化學(xué)發(fā)光免疫傳感器由于設(shè)備簡單，還極大降低了分析成本，整個(gè)分析平臺(tái)成本僅為2 000 元，單個(gè)樣品的檢測成本為3 元，更有利于該傳感器在現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。

表1 化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器與參考文獻(xiàn)中嘔吐毒素檢測方法的對比Table 1 Comparison of chemiluminescent fiber optic immunosensors and DON detection methods in reference

2.6 化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器與ELISA法的比對

E?ISA 法是一種廣泛應(yīng)用于谷物中DON 檢測的商業(yè)化方法，因此，采用E?ISA 法與化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器進(jìn)行方法比對。如圖8A 所示，E?ISA 檢測DON 在目標(biāo)物質(zhì)量濃度1～100 ng/m?內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.4057x-1.17（其中x表示樣品中目標(biāo)物質(zhì)量濃度，y表示吸光度），R2=0.976，檢出限為2.13 ng/m?。由圖8B 可見，相較于E?ISA法，化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器的靈敏度提高了30倍，線性范圍拓寬了3個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)由于光纖免疫傳感器尺寸小的特點(diǎn)，更適合現(xiàn)場快速檢測的需要。

2.7 谷物樣品中嘔吐毒素的檢測及回收率測試

3 種谷物樣品（小麥、玉米、大米）的加標(biāo)回收結(jié)果和RSD 測試結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，不同加標(biāo)濃度下同批次制備的化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器對谷物樣品中DON 檢測的回收率均在81.00%～107.33%，RSD 均低于8.69%。表明該方法應(yīng)用于谷物樣品中嘔吐毒素的檢測具有較好的穩(wěn)定性和較強(qiáng)的抗干擾能力，幾乎不受樣品中復(fù)雜基質(zhì)干擾。此外，我們將測試的結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HP?C-MS）測試結(jié)果進(jìn)行對比驗(yàn)證，如表2所示，顯示二者的檢測結(jié)果具有較好的吻合性。但是化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器的成本遠(yuǎn)低于HP?C-MS，且檢測過程操作簡單、檢測設(shè)備集成便攜，因此，其更適合應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測。

表2 加標(biāo)谷物中檢測嘔吐毒素的回收率Table 2 Recovery of DON in spiked grains

3 討論

本研究通過生物識(shí)別分子與光纖的固定化方法，采用共價(jià)結(jié)合策略實(shí)現(xiàn)了嘔吐毒素完全抗原（DON-BSA）與光纖的穩(wěn)定結(jié)合，研制了完全抗原功能化的光纖探針。以化學(xué)發(fā)光免疫分析為基礎(chǔ)，使用固定完全抗原的光纖作為檢測元件，以吖啶酯為化學(xué)發(fā)光底物，建立了一種DON 現(xiàn)場快速檢測的化學(xué)發(fā)光光纖免疫傳感器，并通過一系列表征證明了固定方法的可行性，成功將其應(yīng)用于谷物中DON的定量檢測。與傳統(tǒng)E?ISA 方法相比，該免疫傳感器具有靈敏度高（62.7 pg/m?）、線性范圍廣（0.1～1 200 ng/m?）、檢測效率高等優(yōu)點(diǎn)，為基于酶的免疫傳感分析策略提供了新的思路。

不同于常規(guī)免疫傳感器，這種新型免疫傳感器根據(jù)高靈敏和便攜式兩個(gè)特點(diǎn)將化學(xué)發(fā)光與光纖有效結(jié)合，集成化學(xué)發(fā)光和光纖傳導(dǎo)等諸多優(yōu)勢，如：（1）信號(hào)讀出方法采用化學(xué)發(fā)光，其特點(diǎn)在于痕量水平的反應(yīng)即可獲得高靈敏的信號(hào)；（2）光纖內(nèi)芯作為生物識(shí)別分子的固定化載體，具有優(yōu)異的導(dǎo)光性能和抗干擾能力；此外，光纖小巧的尺寸和儀器接口緊密結(jié)合的優(yōu)勢也很適合便攜式檢測，以此為基礎(chǔ)搭建了一臺(tái)體積小、成本低、操作簡單的化學(xué)發(fā)光光纖傳感平臺(tái)，較適合應(yīng)用于現(xiàn)場即時(shí)檢測。

目前本方法和檢測設(shè)備還存在一些缺陷，如光纖探針的商業(yè)化制備、設(shè)備無法同時(shí)對多根光纖探針同時(shí)進(jìn)行檢測等。在未來工作中，我們將在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步創(chuàng)新，將這些新方法和新儀器朝向電器化、小型化、自動(dòng)化的方向進(jìn)一步發(fā)展，集生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)于一體，推動(dòng)現(xiàn)場快速檢測技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境檢測等方向的更多實(shí)用型研究。