鎘水相暴露在鯽體內(nèi)的累積分布及水流流速對(duì)鎘的清除效果

衛(wèi)丹秋，黃濤濤，殷嬌嬌，張學(xué)振，2

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，武漢 430070；2.環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070

重金屬元素包括必需金屬和非必需金屬，其中鎘、鉛、汞等非必需金屬在低濃度時(shí)也具有較強(qiáng)的毒性，是對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)危害最大的污染源之一［1］。鎘是一類(lèi)非典型的過(guò)渡重金屬，它的各種形式如氧化鎘、碳化鎘、硫酸鎘等均可對(duì)環(huán)境造成不同程度的污染［2］。

水環(huán)境中的鎘可通過(guò)生物富集和生物放大作用在魚(yú)體內(nèi)不斷累積［2］，魚(yú)類(lèi)吸收鎘主要通過(guò)鰓與水體中的鎘直接接觸，鰓中的氯細(xì)胞會(huì)吸收鎘離子，而后由于鰓具有巨大的表面積以及鰓部血液障礙較弱，使得鎘能夠通過(guò)血液循環(huán)作用轉(zhuǎn)移至體內(nèi)各個(gè)組織中［3］；或通過(guò)攝食作用在胃腸道內(nèi)吸收［4-5］。另一方面，魚(yú)類(lèi)也會(huì)通過(guò)自身的凈化作用，例如排泄、分泌等途徑向水環(huán)境中釋放鎘，使魚(yú)體內(nèi)鎘的累積和清除始終處于相對(duì)平衡的狀態(tài)，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［6］。適宜的水流刺激可提高魚(yú)類(lèi)的代謝速率、免疫力、生長(zhǎng)速度、攝食率等［7-8］，但關(guān)于流水對(duì)魚(yú)體內(nèi)重金屬清除的研究較少。筆者選取我國(guó)常見(jiàn)的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)鯽（Carassius auratus）為研究對(duì)象，通過(guò)暴露試驗(yàn)研究鎘在鯽體內(nèi)的累積分布規(guī)律，并研究不同水流流速對(duì)鯽體內(nèi)鎘的清除效果，同時(shí)對(duì)鯽可食用部分進(jìn)行膳食非致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以期為了解重金屬鎘在魚(yú)體內(nèi)的累積情況提供理論依據(jù)，給魚(yú)體內(nèi)重金屬鎘富集的問(wèn)題提供經(jīng)濟(jì)、安全、快速的解決方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究所用鯽購(gòu)自湖北省武漢市白沙洲水產(chǎn)市場(chǎng)，在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室的500 ?聚乙烯塑料桶中暫養(yǎng)14 d，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖環(huán)境：水溫（21.2±1.0）℃、溶解氧＞6.0 mg/?、pH（7.1±0.2），暫養(yǎng)期間對(duì)試驗(yàn)魚(yú)投喂商業(yè)飼料（鯽、暫養(yǎng)水體、商業(yè)飼料中均不含鎘）。暫養(yǎng)完成后從中選取180尾體質(zhì)量（150.0±5.0）g、體長(zhǎng)（20.0±1.5）cm 規(guī)格相近的鯽，隨機(jī)轉(zhuǎn)移至18個(gè)養(yǎng)殖缸中，每組3個(gè)平行，每缸10 尾魚(yú)。參照文獻(xiàn)［9］，設(shè)置鎘暴露6 個(gè)質(zhì)量濃度（0.000、1.000、2.800、7.840、21.952、61.465 mg/?），分別在24、48、72、96 h 記錄試驗(yàn)魚(yú)的死亡個(gè)體數(shù)，以確定鎘對(duì)鯽的半致死濃度及安全濃度。

取經(jīng)馴養(yǎng)的體質(zhì)量為（150.0±5.0）g 的鯽240 尾隨機(jī)分為4 組，分別暴露于鎘質(zhì)量濃度0.000、0.764、1.528、3.054 mg/?的水體中，每組3 個(gè)平行，每缸20尾魚(yú)，在鎘暴露0、4、7、14 d 時(shí)取樣研究鎘在鯽各組織中的累積分布規(guī)律。同時(shí)將另240 尾鯽放置于鎘質(zhì)量濃度為1.528 mg/?的水體中暴露96 h 后，轉(zhuǎn)移至不同流速（0.0、0.1、0.2、0.4 m/s）的無(wú)鎘清水中繼續(xù)養(yǎng)殖，每組3 個(gè)平行，每缸20 尾魚(yú)，在流水清除1、4、7、14 d時(shí)取樣并測(cè)定各組織中鎘含量，研究不同水流流速對(duì)于鯽體內(nèi)鎘的清除效果。

1.2 儀器設(shè)備

本試驗(yàn)所用流水裝置為自行設(shè)計(jì)的環(huán)形循環(huán)水流裝置，如圖1所示。

1.3 水體及鯽組織中鎘濃度測(cè)定

1）水體中鎘濃度測(cè)定。使用滴管直接吸取適量水樣于15 m?塑料離心管中，搖勻，采用美國(guó)珀金埃爾默公司的電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測(cè)定。

2）組織中鎘濃度測(cè)定。將鯽放入含MS-222（100 mg/?）的水中進(jìn)行麻醉，使用手術(shù)剪從鯽的泄殖孔插入并剪至下頜處，打開(kāi)體腔，分離肝、腎、腸、膽，去除皮膚后取背部、腹部肌肉，剪取頭部?jī)蓚?cè)鰓絲，以及去除鰓后的整體頭部。取上述各組織適量于15 m?塑料離心管中，加入適量硝酸浸泡12 h，待樣本完全溶解后轉(zhuǎn)入石英管，加入1.0 m?硝酸，將其放入石墨消解儀，經(jīng)低溫消解至溶液清亮，取出冷卻后加入三蒸水，定容至10 m?搖勻，靜置過(guò)夜后采用ICP-MS進(jìn)行測(cè)定。

1.4 鎘96 h的LC50及安全濃度測(cè)定

參考文獻(xiàn)［10］，計(jì)算平均死亡率和試驗(yàn)濃度對(duì)數(shù)，采用GraphPad Prism 8 軟件的log（agonist）vs.normalized response-variable slope 分析方法進(jìn)行回歸分析，最終求出96 h 半致死濃度（?C50）以及95%置信區(qū)間。安全濃度的計(jì)算公式如下：

1.5 鎘的生物累積系數(shù)和清除率

生物累積系數(shù)（bioaccumulation factor，BAF）通常用于指示重金屬在魚(yú)體內(nèi)的累積情況［11］，計(jì)算公式如下：

其中，Ct為時(shí)間t時(shí)對(duì)應(yīng)的組織中重金屬含量，mg/kg；Ccon為對(duì)照組組織中的重金屬含量，mg/kg；Cwater為暴露溶液中的重金屬含量，mg/kg。

清除率（depuration rate，K）表示為清除一段時(shí)間后的重金屬含量相對(duì)于暴露試驗(yàn)后的重金屬濃度減少的百分比，計(jì)算公式如下：

其中，Cexp為暴露后組織中重金屬含量，mg/kg；Cdep為清除后組織中重金屬含量，mg/kg。

1.6 可食用部分風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

目標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)（target hazard quotient，THQ）被用于評(píng)估重金屬對(duì)魚(yú)類(lèi)的非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)THQ≥1 時(shí)，認(rèn)為該重金屬對(duì)人體存在潛在的非致癌風(fēng)險(xiǎn)［12-13］，計(jì)算公式如下：

其中，F(xiàn)（food ingestion rate）為魚(yú)肉日均攝入量，根據(jù)2016 年中國(guó)居民膳食指南，我國(guó)居民人均每天水產(chǎn)品攝入量為40～75 g，取平均值57.5 g/d［14］；C為魚(yú)肉中所測(cè)重金屬的含量，mg/kg；R（oral reference dose）為重金屬的參考劑量，mg/（kg·d），Cd 的R值為0.001［15］；B（body weight）為人體質(zhì)量，kg（成人按60 kg，兒童按30 kg計(jì)算）。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019、SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理及分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（Mean±SD，n=3）表示，采用單因素方差分析（One-way Anova analysis）及最小顯著差數(shù)法（least significant difference，?SD）多重比較對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05作為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘96 h的LC50及安全濃度

隨著鎘暴露濃度的升高，鯽呈現(xiàn)出緊張不安，劇烈游泳，上下竄動(dòng)，甚至撞擊桶壁等行為。鯽在高濃度組暴露數(shù)小時(shí)后喪失游泳能力，體表出現(xiàn)白色絮狀物，鰓處有大量黏液，鰓絲粘連且呈暗紅色，肌肉失去彈性，解剖后發(fā)現(xiàn)其肝臟顏色變深。試驗(yàn)期間記錄其死亡數(shù)并計(jì)算平均死亡率、?C50及安全質(zhì)量濃度（表1、圖2），計(jì)算得安全質(zhì)量濃度為1.528 mg/?。

表1 鎘對(duì)鯽暴露24、48、72、96 h的安全濃度Table 1 The safe concentration of cadmium for crucian carp at 24，48，72 and 96 h

2.2 暴露試驗(yàn)后鯽各組織中鎘濃度

在含不同質(zhì)量濃度（0.000、0.764、1.528、3.054 mg/?）鎘的水體中暴露4、7、14 d 后，鯽各組織（肝、腎、鰓、腸、膽、背肌、腹肌、魚(yú)頭）中鎘含量如圖3 所示。在暴露4 d 時(shí)，1.528 mg/?處理組中，鯽肝、膽、鰓、魚(yú)頭組織中鎘濃度顯著高于對(duì)照組；3.054 mg/?組中除了背肌和腹肌，其他組織中鎘含量均顯著增加。暴露7 d 后，除腎、背肌、腹肌外，其余組織中鎘含量在1.528 mg/?組和3.054 mg/?組均顯著升高。暴露14 d 后，0.764 mg/?組的鯽肝、膽、鰓和魚(yú)頭與1.528 mg/?組的鯽肝、腎、腸、膽、鰓、背肌和魚(yú)頭以及3.054 mg/?組的所有組織的鎘含量與對(duì)照組相比均顯著升高。

不同暴露時(shí)間及不同暴露濃度下鯽對(duì)鎘的生物累積系數(shù)如表2 所示。暴露4 d 后，鎘主要富集在魚(yú)頭、肝、鰓、腸等組織中；暴露7 d 后，鎘的主要富集部位為魚(yú)頭、肝、鰓等組織，并隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，不同組織間的累積系數(shù)相差較大；暴露14 d 后，鎘仍是主要富集在魚(yú)頭、肝、腸、腎等組織中。

表2 鎘暴露4、7、14 d時(shí)鯽各組織中鎘的生物累積系數(shù)Table 2 Bioaccumulation factors in tissues of crucian carp at 4、7、14 days of cadmium exposure

2.3 清除試驗(yàn)后各組織中鎘濃度

在不同流速（0.0、0.1、0.2、0.4 m/s）的水體中進(jìn)行清除試驗(yàn)1、4、7、14 d 后，鯽各組織（肝、腎、鰓、腸、膽、血清、背肌、腹肌、魚(yú)頭）中鎘含量如圖4 所示，各個(gè)清除階段的清除率如表3 所示。流水清除1 d 后，除腎、膽、魚(yú)頭外，其余組織中的鎘含量與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。清除4 d 后，不同流速下腸、膽、鰓、魚(yú)頭組織中的鎘含量顯著低于對(duì)照組，而肝和腹肌中的鎘含量卻有不同程度的增加。清除7 d 后鯽膽和鰓中鎘含量在不同流速條件下與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。清除14 d 后在肌肉組織中已檢測(cè)不出鎘含量，而在肝臟中，0.4 m/s組中鎘含量卻顯著高于對(duì)照組。

2.4 可食用部分風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

在含不同質(zhì)量濃度鎘的水體中暴露14 d 后，將可食用部分（背肌、腹肌、魚(yú)頭）進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，根據(jù)體質(zhì)量及魚(yú)肉攝入量的不同分為成人組和兒童組，結(jié)果如圖5 所示。在剛開(kāi)始暴露4 d 時(shí)，魚(yú)頭中已存在食用風(fēng)險(xiǎn)，隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，背肌、腹肌、魚(yú)頭的食用風(fēng)險(xiǎn)也逐步上升，且兒童的THQ 均大于成人，表明兒童食用鎘污染的鯽可能存在更大風(fēng)險(xiǎn)。

在不同流速的水體中清除14 d 后，鯽可食用部分的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果如圖6 所示。清除達(dá)到第4 天時(shí)，對(duì)于成人而言，鯽背肌、腹肌中的THQ＜1，達(dá)到了食用標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)于兒童而言，鯽背肌、腹肌則是在清除7 d后達(dá)到食用標(biāo)準(zhǔn)。相比于肌肉組織，魚(yú)頭組織在流水清除14 d 后THQ 仍大于1，依然存在較大食用風(fēng)險(xiǎn)。

3 討論

3.1 鎘在鯽體內(nèi)的累積規(guī)律

魚(yú)類(lèi)吸收鎘或通過(guò)鰓與水體中的鎘直接接觸［3］，或通過(guò)攝食吸收［4］。在短時(shí)間內(nèi)，影響?hù)~(yú)體內(nèi)鎘富集主要因素是水體中的鎘濃度，隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，魚(yú)體中鎘含量也隨之增加，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間效應(yīng)，且鎘在魚(yú)體中的生物蓄積具有組織特異性［16］。在本試驗(yàn)中，鎘在鯽頭部、肝、腸、鰓和腎組織中大量富集，其含量遠(yuǎn)大于背肌與腹肌，表明肌肉的重金屬累積能力較弱，其原因可能是由于肌肉的血液循環(huán)以及新陳代謝活性低于其他組織［17］。其中魚(yú)頭和肝臟組織中鎘累積量最高，肝臟是合成各種蛋白質(zhì)和與重金屬有高親和力分子的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是重要的解毒器官［18］，因此重金屬鎘極易在肝臟中富集［19-20］。重金屬在魚(yú)體頭部累積較高在其他研究中也有報(bào)道，例如鯽在含重金屬鉻水體中暴露后，鉻離子在頭部累積最多［21］，但魚(yú)頭中重金屬累積量較高的原因尚不可知，需要做進(jìn)一步的研究。其他內(nèi)臟器官，如腸和腎對(duì)鎘的富集能力也較強(qiáng)，魚(yú)體內(nèi)重金屬蓄積的主要途徑之一是通過(guò)食物攝入［22］，因此主要的消化吸收器官腸道會(huì)不斷地累積重金屬鎘，隨后鎘從腸道運(yùn)輸?shù)窖?，在血液中與紅細(xì)胞、血漿金屬硫蛋白和白蛋白結(jié)合［22］，通過(guò)血液循環(huán)作用，重新分布到魚(yú)體的其他組織中，例如排泄器官腎臟等。

鎘作為一種毒性重金屬，對(duì)人體的肝臟、腎臟等都有嚴(yán)重的危害作用［23］，而人體內(nèi)90%的鎘來(lái)源于食物［24］，魚(yú)類(lèi)作為人類(lèi)重要的蛋白來(lái)源，攝入受污染的魚(yú)類(lèi)勢(shì)必會(huì)危及人體健康。本研究對(duì)鯽可食用部位（魚(yú)頭、背肌、腹?。┻M(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果顯示，魚(yú)頭部位的鎘含量嚴(yán)重超出標(biāo)準(zhǔn)限值，且THQ 值遠(yuǎn)大于1，具有較高的潛在食用風(fēng)險(xiǎn)；背肌、腹肌組織中的鎘含量雖在標(biāo)準(zhǔn)限值之內(nèi)，但高質(zhì)量濃度鎘暴露組（3.054 mg/?）在暴露14 d 后的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)仍大于1，同樣存在潛在食用風(fēng)險(xiǎn)，且相較于成人，兒童具有更大的食用風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)只對(duì)鎘污染后的鯽可食用部分做了非致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需在之后作進(jìn)一步的分析。

3.2 不同流速流水對(duì)鯽體內(nèi)鎘的清除效果

魚(yú)類(lèi)通過(guò)自身排出重金屬的途徑主要有排泄、膽汁分泌、體表黏液分泌、解毒機(jī)制及其他生理過(guò)程。一般來(lái)說(shuō)，魚(yú)體內(nèi)鎘的累積和清除始終處于相對(duì)平衡的狀態(tài)［25-26］，當(dāng)吸收速率高于清除速率時(shí)，鎘的凈累積量增加，反之則鎘的凈累積量減少［27］。在本試驗(yàn)中，鎘在鯽肝、腎組織中排出較慢，清除率遠(yuǎn)低于其他組織，類(lèi)似的結(jié)果也出現(xiàn)在其他的研究中［28-29］，例如將受到鎘污染的日本鰻鱺放入干凈清水中，凈化14 d 后并未消除肝臟、腎臟組織中積累的鎘［30］，其可能的原因是凈化期間鎘在魚(yú)體內(nèi)組織間進(jìn)行了重新分配，重金屬離子與含半胱氨酸殘基的蛋白（金屬硫蛋白）上的巰基結(jié)合，形成螯合物，優(yōu)先蓄積到肝臟和腎臟中［31］，此外，魚(yú)類(lèi)通過(guò)各種結(jié)合作用易化鎘的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，與組織間結(jié)合力較弱會(huì)被迅速排放，反之則排放較慢［29］，鯽肝臟和腎臟中的配體結(jié)合能力較強(qiáng)也可能是鎘清除較慢的原因之一。鎘在鯽的其他組織中的含量，如腸、膽、鰓、肌肉、魚(yú)頭中相較于對(duì)照組而言有顯著的降低，說(shuō)明在流水的作用下鎘的清除效果明顯。

魚(yú)類(lèi)在較低水速下可利用的溶氧水平較低［32］，而較高的流速則會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)造成應(yīng)激。有研究表明，適宜的水流刺激可提高魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)速度、攝食率和免疫力［33-35］。本試驗(yàn)中，在清除14 d 后，腸、鰓、魚(yú)頭中鎘的清除率都在水流流速為0.2 m/s 時(shí)達(dá)到最大，分別為95.35%、83.17%、91.68%；背肌與腹肌中鎘的清除率在流速為0.1 m/s 時(shí)達(dá)到最大值100%，說(shuō)明鯽處于0.1～0.2 m/s 的流速條件下對(duì)于體內(nèi)鎘的清除效果最為明顯。

流水清除試驗(yàn)后，對(duì)鯽的可食用部分（魚(yú)頭、背肌、腹?。┰俅芜M(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果顯示各處理組中背肌和腹肌的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)均小于1，證明經(jīng)過(guò)流水清除之后的鯽肌肉部分不存在潛在的食用風(fēng)險(xiǎn)，然而直至清除試驗(yàn)結(jié)束，魚(yú)頭部分的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)仍大于1，說(shuō)明魚(yú)頭仍然存在食用風(fēng)險(xiǎn)。