microRNA-103通過調(diào)節(jié)自噬參與調(diào)控妊娠期糖尿病機(jī)制的臨床研究

郭美妹

妊娠期糖尿病是一種妊娠期獨(dú)有的疾病，也是產(chǎn)科的一種常見并發(fā)癥，指孕婦首次出現(xiàn)不同程度的糖代謝異?；蚱咸烟遣荒褪躘1]。該病具有較高的發(fā)病率，近幾年隨著孕婦年齡、生活方式、飲食習(xí)慣等的變化，導(dǎo)致其發(fā)病率出現(xiàn)了逐漸升高的發(fā)展趨勢[2]。妊娠期糖尿病的危害性大，會導(dǎo)致孕婦出現(xiàn)代謝功能紊亂，引發(fā)子癇前期、產(chǎn)后出血、產(chǎn)褥感染等并發(fā)癥，也會影響胎兒發(fā)育及新生兒的健康生長，可出現(xiàn)過期產(chǎn)兒、胎兒宮內(nèi)窘迫、巨大兒、新生兒窒息、新生兒低血糖等不良后果[3-5]。而該病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能和糖代謝異常、胰島素功能障礙、遺傳、炎癥反應(yīng)、環(huán)境等因素有關(guān)，且通常是多種因素共同作用的結(jié)果[6-7]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期糖尿病患者有諸多具有重要功能的基因表達(dá)出現(xiàn)異常變化，但其核酸序列并未出現(xiàn)變化，而是通過表現(xiàn)遺傳學(xué)機(jī)制參與了疾病的發(fā)生與發(fā)展[8]。microRNA 是當(dāng)前分子生物學(xué)與生物信息學(xué)的熱門領(lǐng)域，因其具有廣泛參與生物學(xué)過程的特征，使其在內(nèi)分泌代謝領(lǐng)域中獲得了長足的進(jìn)展[9]。有報道指出，microRNA 在妊娠期糖尿病的病理生理變化過程中起到了非常重要的作用，但其作用機(jī)制尚未闡明[10]。自噬是一種對細(xì)胞成分降解再利用的過程，在細(xì)胞生存中發(fā)揮著非常重要的作用[11]。正常狀況下，自噬可對細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)作用，但自噬過度會導(dǎo)致細(xì)胞損傷[12]。microRNA-103參與調(diào)節(jié)自噬的研究在近期引起了廣泛關(guān)注，其是否通過調(diào)節(jié)自噬參與了調(diào)控妊娠期糖尿病機(jī)制的研究尚未見報道。為此，本研究為了進(jìn)一步探討microRNA-103 通過調(diào)節(jié)自噬參與調(diào)控妊娠期糖尿病的作用機(jī)制，對比分析了妊娠期糖尿病患者與正常孕婦胎盤組織的microRNA-103 表達(dá)水平及自噬情況，旨在為妊娠期糖尿病尋找新的基因靶向治療方法提供線索，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年8 月-2021 年8 月于莆田學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的30 例妊娠期糖尿病孕婦納入研究組，另選取同時期住院分娩的30 例健康孕婦納入對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡20～42 歲；（2）經(jīng)實(shí)驗室檢查、影像學(xué)檢查等證實(shí)為宮內(nèi)妊娠；（3）研究組孕婦經(jīng)葡萄糖耐量試驗證實(shí)為糖代謝異常，滿足文獻(xiàn)[13]《妊娠合并糖尿病診治指南（2014）》中的相關(guān)妊娠期糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（4）定期產(chǎn)檢并在本院住院足月分娩。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）資料不完整；（2）合并高血壓；（3）合并其他代謝性疾病，如營養(yǎng)不良、肥胖等；（4）其他內(nèi)分泌疾病，如甲狀腺功能異常等；（5）主要臟器疾病；（6）嚴(yán)重慢性病或傳染性疾病；（7）全身免疫性疾病；（8）曾接受不孕治療，包括體外受精或?qū)m內(nèi)人工授精等；（9）精神疾病、神志不清、認(rèn)知功能障礙、溝通障礙；（10）惡性腫瘤。該研究已經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，自愿參加研究，并經(jīng)家屬同意，簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本取材與處理 產(chǎn)婦分娩后立刻在其胎盤母體面小葉處剪取小塊組織，分為四份，聚丁二酸丁二醇酯緩沖液洗凈，置于2 mL 的凍存管內(nèi)，于-80 ℃下儲存，以10%甲醛固定。

1.2.2 主要試劑與儀器 Trizol 試劑，源于美國Invitrogen 公司；microRNA 分離試劑盒，源于Ambion 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，源于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；microRNA-103 引物，源于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒，源于美國PE-Cetus 公司；蛋白抗體，源于Milipore 公司；Tecnai G2 12 透射電鏡（荷蘭FEI 公司）。

1.2.3 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 運(yùn)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法測定microRNA-103 表達(dá)水平，嚴(yán)格按照Trizol 試劑盒說明書操作。運(yùn)用Trizol 法提取胎盤組織的總RNA，運(yùn)用QuantiMir反轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄為小RNA 的cDNA（25 ℃，30 min；42 ℃，30 min；85 ℃，10 min）。cDNA 運(yùn)用SYBR Seclect Master Mix 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測microRNA-103 表達(dá)，以GAPDH 為內(nèi)參。microRNA-103 的特異性引物為：上 游5’-CGAGCTCCTCTGAAGCAAAT-3’，下 游5’-AACCTAGCAATGGCACAGAAA-3’。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系（20 μL）：cDNA 模板2 μL、上下游引物（25 mmol/L）各1 μL、SYBR Seclect Master Mix 10 μL、ddH2O 0.6 μL；95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃34 s；循環(huán)40 個。各個樣本均設(shè)定3 個復(fù)孔，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。為了確保擴(kuò)增效率的一致性，microRNA-103 的相對表達(dá)量以2-ΔΔCT進(jìn)行計算。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法 運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法檢測胎盤組織微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3Ⅱ（LC3-Ⅱ）、自噬相關(guān)蛋白5（Atg5）蛋白表達(dá)水平。取待測組織蛋白樣本20 μg，添加緩沖液，沸水煮5 min，取出后馬上置于冰上5 min，完成蛋白樣本變性；變性后樣本馬上上樣或放于-80 ℃下保存。制備12%（wt/vol）的SDS 聚丙烯酰胺凝膠；連接垂直電泳裝置。蛋白樣本上樣，在SDS 聚丙烯酰胺凝膠中穩(wěn)壓（80～110 V）電泳1.5～2.0 h；停止電泳，撤掉電泳裝置，取下凝膠，讓其和聚偏二氟乙烯膜貼合，轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)膜夾層裝置，放在轉(zhuǎn)膜槽上。根據(jù)測定蛋白分子量計算轉(zhuǎn)膜時間，在電泳200 mA、4 ℃下將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。停止轉(zhuǎn)膜后，將膜放于Western 洗滌緩沖液中洗膜2 次，10 min/次，再用含5%脫脂奶粉的Western 洗滌緩沖液于室溫下封閉1～2 h。停止封閉后將膜放在Western 洗滌緩沖液中洗膜3 次，5 min/次。加入稀釋度1∶400 的相應(yīng)一抗抗體，4 ℃過夜，加入AP 標(biāo)記的相應(yīng)二抗抗體IgG（1∶5 000），室溫下孵育2 h。停止一抗孵育后，拿出聚偏二氟乙烯膜，放在Western 洗滌緩沖液中，室溫下洗膜6 次，10 min/次。添加針對一抗的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，室溫下放在搖床孵育，輕輕晃動2 h。停止孵育后，以Western 洗滌緩沖液于室溫下洗膜3 次，10 min/次。將孵育好的聚偏二氟乙烯膜置于現(xiàn)配的ECL 工作液中，室溫下溫育2～5 min，于暗室內(nèi)曝光。運(yùn)用Image J 軟件對蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的灰度值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 電鏡檢測 應(yīng)用電鏡檢測組織自噬小體。將胎盤組織用聚丁二酸丁二醇酯緩沖液沖洗，用2%戊二醛（聚丁二酸丁二醇酯配制）固定胎盤組織2 h，之后進(jìn)行傳統(tǒng)透射顯微鏡準(zhǔn)備，應(yīng)用Tecnai G2 12透射電鏡進(jìn)行檢測。

1.3 觀察指標(biāo)（1）比較研究組與對照組胎盤組織microRNA-103、LC3-Ⅱ與Atg5 蛋白的表達(dá)水平。（2）比較研究組與對照組胎盤組織中的自噬小體數(shù)量。（3）運(yùn)用Pearson 相關(guān)性分析法分析觀察組LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白與microRNA-103 的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 21.0 軟件，計量資料用（）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析運(yùn)用Pearson 相關(guān)性分析法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 研究組孕婦年齡20～42 歲，平均（29.37±5.98）歲；孕周37～41 周，平均（38.12±1.06）周；體重指數(shù)20～31 kg/m2，平均（26.52±2.30）kg/m2；產(chǎn)次0～3 次，平均（1.43±0.52）次；單胎28 例，多胎2 例；合并糖尿病家族史6 例。對照組孕婦年齡20～42 歲，平均（29.34±6.00）歲；孕周37～41 周，平均（38.10±1.09）周；體重指數(shù)20～31 kg/m2，平均（26.55±2.28）kg/m2；產(chǎn)次0～3 次，平均（1.45±0.50）次；單胎28 例，多胎2 例；合并糖尿病家族史5 例。兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 兩組胎盤組織microRNA-103、LC3-Ⅱ與Atg5 蛋白的表達(dá)水平比較 研究組胎盤組織中的microRNA-103、LC3-Ⅱ與Atg5 蛋白的表達(dá)水平均高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組胎盤組織microRNA-103、LC3-Ⅱ與Atg5蛋白的表達(dá)水平比較（）

表1 兩組胎盤組織microRNA-103、LC3-Ⅱ與Atg5蛋白的表達(dá)水平比較（）

2.3 兩組胎盤組織中的自噬小體數(shù)量比較 研究組胎盤組織中的自噬小體數(shù)量為（83.27±6.30）個，多于對照組的（24.84±1.68）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=49.084，P＜0.05）。

2.4 觀察組LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白與microRNA-103的相關(guān)性 觀察組LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白與microRNA-103 均呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 觀察組LC3-Ⅱ蛋白、Atg5蛋白與microRNA-103的相關(guān)性分析

3 討論

妊娠期間，胎盤會產(chǎn)生胎兒所需的各類激素，而激素分泌的同時也會影響母體胰島素的全身脂解能力及降糖能力，所以會導(dǎo)致妊娠期糖尿病發(fā)生風(fēng)險的升高[14]。隨著孕周增加，孕婦機(jī)體中的抗胰島素樣物質(zhì)會不斷增多，對胰島素的敏感度隨之降低，血糖水平則進(jìn)一步升高，糖代謝異常因而加重，會形成惡性循環(huán)[15]。妊娠期糖尿病對母嬰健康會產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時可危及母嬰生命安全，應(yīng)引起高度重視，及早診治[16]。

microRNA 是一種由19～23 個核苷酸形成的微小非編碼RNA，普遍存在于真核生物細(xì)胞中，是最大的基因家族之一[17]。microRNA 長約20～25 個核苷酸，對基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，可通過和靶基因的mRNA3’UTR 配對，直接剪掉靶mRNAs或抑制靶mRNA 的翻譯，繼而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為的作用[18]。已有的研究報道指出，microRNA和諸多疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在癌癥中，幾乎所有癌癥的發(fā)生與發(fā)展過程均能檢測到microRNA 的異常表達(dá)[19]。另有研究報道指出，多種microRNA 在妊娠期糖尿病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[20]。microRNA-103 在肥胖型小鼠體內(nèi)呈高表達(dá)狀態(tài)，且沉默表達(dá)microRNA-103 可改善肥胖型小鼠的葡萄糖穩(wěn)態(tài)，提高胰島素的敏感度。本研究結(jié)果顯示，研究組胎盤組織microRNA-103的表達(dá)水平高于對照組，提示妊娠期糖尿病胎盤組織中microRNA-103 的表達(dá)上調(diào)。

自噬是細(xì)胞正常的生命現(xiàn)象，在細(xì)胞生存中發(fā)揮著重要作用。近幾年有研究發(fā)現(xiàn)，自噬貫穿于妊娠的整個過程，并參與了滋養(yǎng)細(xì)胞的分化、繁衍、侵襲，且維持著胎盤的正常功能與發(fā)育[21]。但細(xì)胞過度自噬會引起病理妊娠，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，如胎兒生長受限、早產(chǎn)等。LC3-Ⅱ與Atg5 是和自噬相關(guān)的兩種蛋白，能夠反映自噬活動。本研究結(jié)果顯示，研究組胎盤組織中LC3-Ⅱ與Atg5 蛋白的表達(dá)水平與自噬小體數(shù)量均高于對照組，提示研究組胎盤組織的自噬能力增強(qiáng)。相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，LC3-Ⅱ蛋白、Atg5 蛋白與microRNA-103 均呈正相關(guān)，提示microRNA-103 表達(dá)水平與自噬小體形成之間有密切的關(guān)聯(lián)。因此，microRNA-103 在妊娠期糖尿病中可通過調(diào)節(jié)自噬參與疾病的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，microRNA-103 在妊娠期糖尿病胎盤組織中的表達(dá)水平上調(diào)，自噬增強(qiáng)，可通過調(diào)節(jié)自噬參與該病的致病過程。