模擬冷鏈流通中溫度波動對養(yǎng)殖金鯧魚魚肉品質(zhì)及微生物多樣性的影響

司徒慧媛， 李玉梅， 高加龍,2,*， 章超樺,2， 秦小明,2，曹文紅,2， 林海生,2， 鄭惠娜,2

(1.廣東海洋大學 食品科技學院/廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室/廣東省海洋生物制品工程實驗室/水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室， 廣東 湛江 524088；2.大連工業(yè)大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心， 遼寧 大連 116034)

金鯧魚學名為卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)，硬骨魚綱鱸形目鲹科鯧鲹屬[1]，產(chǎn)地主要為廣東、廣西和浙江等省，是我國三大海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類之一?！吨袊鴿O業(yè)統(tǒng)計年鑒》數(shù)據(jù)顯示，2020年我國金鯧魚養(yǎng)殖產(chǎn)量約10.2萬t，占全國海水養(yǎng)殖魚類總產(chǎn)量的5.8%[2]。金鯧魚肉質(zhì)細膩，滋味鮮美，具有較好的食用價值和營養(yǎng)價值。保持流通過程中金鯧魚漁獲后的鮮度和品質(zhì)對其內(nèi)陸城市消費市場的開發(fā)十分關鍵[3]；因此，需要在運輸過程中使用冷鏈運輸體系，并維持整個冷鏈流通過程中溫度的穩(wěn)定[4]。水產(chǎn)品表面附著大量微生物并含有較多內(nèi)源酶，容易導致鮮度品質(zhì)劣化甚至腐敗變質(zhì)。因此研究運輸和銷售過程的溫度控制以及冷鏈物流過程中魚體的品質(zhì)變化和微生物群落演替規(guī)律對水產(chǎn)品的保鮮加工具有重要的意義。

流通中溫度頻繁波動易導致魚品質(zhì)劣變速度加快。黃文博等[5]研究發(fā)現(xiàn)，冷藏物流中的溫度頻繁波動導致美國紅魚(Sciaenopsocellatus)的菌落總數(shù)、pH值、揮發(fā)性鹽基氮(TVB- N)值、K值等指標的顯著變化；藍蔚青等[6]證明流通期間劇烈的溫度波動對大目金槍魚(Thunnusobesus)品質(zhì)造成明顯影響；于淑池等[7]研究了0 ℃下貯藏金鯧魚的菌落總數(shù)、TVB- N值和特定腐敗菌。但流通過程中溫度波動對金鯧魚品質(zhì)和微生物的影響鮮有報道。目前在食品微生物多樣性及變化規(guī)律分析中廣泛應用高通量測序技術，具有測序通量大，能全面且精確測量樣品中的微生物類型及其真實比例等優(yōu)點[8]。已有學者將該技術運用在大西洋鱈魚(Gadusmorhua)[9]、南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)[10]等水產(chǎn)品的微生物群落組成分析中。

本研究模擬了金鯧魚漁獲至消費環(huán)節(jié)的整個流通過程，分析了溫度波動下鮮度指標的變化，并通過傳統(tǒng)培養(yǎng)、Illumina Miseq測序平臺與PICRUSt功能預測工具研究微生物群落結構組成和代謝功能的差異，探究金鯧魚冷鏈流通過程中溫度波動對魚肉品質(zhì)和微生物多樣性的影響，以期為金鯧魚保鮮技術和冷鏈物流的建設提供參考依據(jù)。

圖1 模擬金鯧魚的冷鏈流通過程Fig.1 Process of simulated cold chain circulation of Trachinotus oratus

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活養(yǎng)殖金鯧魚，湛江市霞山區(qū)水產(chǎn)品批發(fā)市場，質(zhì)量為(720.00±37.42) g，體長為(33.00±1.22) cm，樣品捕撈后加冰1 h內(nèi)運至實驗室；2-硫代巴比妥酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；ATP關聯(lián)物標準品，美國Sigma公司；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術股份有限公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒，美國Life公司；細菌基因組DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.Soil DNA Kit)，美國Omega公司。

1.2 儀器與設備

FE28型pH計，梅特勒- 托利多儀器(上海)有限公司；Thermo Varioskan Flash型全波長多功能酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；Vapodest- 450型全自動凱氏定氮儀，德國格哈特分析儀器有限公司；Waters e2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；Miseq型高通量測序儀，美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1冷鏈流通模擬實驗設計

GB/T 28577—2021《冷鏈物流分類與基本要求》[11]和《水產(chǎn)食品學》[12]中規(guī)定：水產(chǎn)品漁獲后需放入加冰的泡沫箱中保溫，送往原料處理場的過程中所處溫度為0～2 ℃，到達原料處理場后經(jīng)冷藏車運輸[(2.0±0.5) ℃]，超市冷藏陳列柜銷售[(2.0±0.5) ℃]，最后到達家庭冰箱(4 ℃)。依此設計了金鯧魚冷鏈物流過程。金鯧魚漁獲后經(jīng)過處理待運，穩(wěn)定處于2 ℃(0～24 h)后分別經(jīng)過理想冷鏈過程與斷鏈過程。CL組為理想冷鏈過程：運輸及銷售溫度穩(wěn)定處于2 ℃，家庭暫存穩(wěn)定處于4 ℃；BC組為斷鏈過程：運輸、銷售和家庭運輸過程中設置多個溫度變化，分別為2、4、10、25 ℃，以模擬流通過程中存在的溫度變化[11]。

具體流通過程如圖1，將魚肉分別置于對應溫度裝置下貯藏0、24、48、96、120 h后進行高通量測序分析以及相關指標的測定。模擬冷鏈流通過程總共8個取樣點，即貯藏待運組(SS- 0、SS- 24)，冷鏈組(CL- 48、CL- 96、CL- 120)，斷鏈組(BC- 48、BC- 96、BC- 120)。

1.3.2樣品處理

將新鮮的金鯧魚宰殺后取背部肌肉，經(jīng)蒸餾水淋洗，使用無菌紗布擦拭樣品表面水分后分裝入封口袋(約100 g/袋)，分別放在不同的模擬流通環(huán)境中貯藏。不同時間取樣進行高通量分析和菌落總數(shù)、嗜冷菌數(shù)、pH值、TVB- N值、硫代巴比妥酸(TBA)值、K值等指標的測定，每組至少3個重復。

1.3.3鮮度品質(zhì)指標測定

1.3.3.1 微生物指標測定

菌落總數(shù)、嗜冷菌數(shù)測定參考GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[13]。選擇合適稀釋度，平行測定3次，并設定空白對照。菌落總數(shù)需在(30±1) ℃下培養(yǎng)(72±3) h，嗜冷菌需在(7±1) ℃下培養(yǎng)(240±3) h。

1.3.3.2 pH值測定

稱取絞碎、混合均勻的2.00 g魚肉于離心管中，再加入20 mL蒸餾水混合均勻后靜置30 min，以8 000 r/min離心10 min后，取上清液測定pH值[14]。

1.3.3.3 TVB- N值測定

參考GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[15]中的半微量凱氏定氮法，采用全自動凱氏定氮儀進行檢測，結果以mg/100g表示。

1.3.3.4 TBA值測定

參考GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》[16]進行測定。

1.3.3.5 K值測定

參考SC/T 3048—2014《魚類鮮度指標K值的測定高效液相色譜法》[17]提取樣品中的ATP關聯(lián)物后使用高相液相色譜儀進行檢測。HPLC條件：5C18- MS- II型色譜柱(4.60 mm×250 mm,5 μm)，檢測波長為 254 nm，柱溫為35 ℃，進樣量20 μL；流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀與0.02 mol/L磷酸氫二鉀溶液體積比1∶1，使用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，流速為1.0 mL/min。等度洗脫程序：0～35 min，外標法定量。按式(1)計算K值。

(1)

1.3.4高通量測序

1.3.4.1 總DNA提取與PCR的擴增

使用液氮將魚肉磨成粉末狀，采用DNA提取試劑盒提取樣品DNA，使用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對提取的基因組DNA精確定量。PCR擴增所需引物采用V3- V4區(qū)通用引物，為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。PCR擴增完成后通過質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。

1.3.4.2 PCR產(chǎn)物純化回收與測序

通過AMPure XP磁珠純化擴增產(chǎn)物，對每個PCR擴增產(chǎn)物的DNA含量進行熒光檢測，通過生物芯片分析測定系統(tǒng)進行文庫測序片段范圍和濃度的分析檢測，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.4.3 高通量測序數(shù)據(jù)處理及分析

將測序后得到的原始序列按照overlap關系進行拼接，然后再按照原始序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，舍棄一些較低質(zhì)量的DNA序列，再聚類成操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)。根據(jù)聚類分析實驗結果，針對OTU進行多樣性指數(shù)綜合分析以及對不同組別測序深度的測定，并采用單樣品的多樣性指數(shù)分析方法(Alpha多樣性)研究樣品中微生物的多樣性。基于分類學信息，統(tǒng)計分析不同分類水平的生物種群結構，在此基礎上進行功能預測[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel、Prism 9.3、SPSS Statistics 20.0進行整理分析與繪圖，運用Tukey- HSD進行顯著性分析與多重比較(P<0.05為差異顯著)，同時針對鮮度指標與微生物指標進行Pearson相關性分析，結果采用平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 冷鏈流通期間金鯧魚魚肉品質(zhì)變化分析

2.1.1菌落總數(shù)與嗜冷菌的變化

微生物的活動是導致水產(chǎn)品腐敗的主要因素之一，菌落總數(shù)被廣泛應用于判斷水產(chǎn)品鮮度。一般認為菌落總數(shù)小于104CFU/g為一級鮮度，104～106CFU/g為二級鮮度，菌落總數(shù)大于106CFU/g表明魚體已發(fā)生腐敗[18]，而流通過程中的低溫環(huán)境則為嗜冷菌提供了有利的生長條件。

模擬流通過程中金鯧魚樣品菌落總數(shù)與嗜冷菌的變化如圖2。在貯藏前期樣品初始菌落總數(shù)與初始嗜冷菌數(shù)量均差異不明顯(P>0.05)，初始的樣品菌落總數(shù)為(2.81±0.03) lg CFU/g。在貯藏后期，CL組由于環(huán)境溫度穩(wěn)定，在流通期間菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)增長緩慢。而BC組經(jīng)歷溫度變化后，貯藏96 h后BC組樣品的菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)均顯著高于CL組(P<0.05)；120 h后BC組的菌落總數(shù)達(6.63±0.03) lg CFU/g，已超出限量指標。在整個流通過程中嗜冷菌數(shù)與菌落總數(shù)的變化趨勢基本一致，其增長速率始終高于菌落總數(shù)，這說明溫度波動營造了更適合嗜冷菌的生長環(huán)境，加速了微生物的生長繁殖最終導致魚肉腐敗。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖2 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù) 的變化Fig.2 Changes of total colony count and psychrophilic bacteria in Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

2.1.2pH值的變化

模擬冷鏈流通過程中金鯧魚魚肉pH值的變化見圖3。新鮮金鯧魚魚肉的初始pH值為6.61±0.01，貯藏前期pH值下降，而后在理想冷鏈過程與斷鏈過程中呈上升的趨勢。在貯藏初期(0～24 h)，肌肉組織中由糖酵解反應而產(chǎn)生大量乳酸使pH值呈下降趨勢。隨后自溶階段，樣品pH值逐漸上升，歸因于魚肉中的蛋白質(zhì)與部分含氮物質(zhì)被分解，生成氨基酸、氨、三甲胺等堿性物質(zhì)[5]。BC組pH值上升趨勢大于CL組，且在48 h時的pH值顯著高于CL組(P<0.05)，說明溫度波動促進了蛋白質(zhì)和部分含氮物質(zhì)的分解。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖3 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚pH值的變化Fig.3 Changes of pH value of Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

2.1.3TVB-N值的變化

內(nèi)源酶和微生物的作用，可使水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)含氮化合物降解并形成揮發(fā)性的鹽基氮，因此TVB- N值常作為判斷水產(chǎn)品腐敗程度的重要化學指標之一[19]。SC/T 3103—2010《鮮凍鯧魚》中規(guī)定魚肉的TVB- N值小于18 mg/100g為一級品，大于30 mg/100g為不合格品[20]。模擬冷鏈流通過程中金鯧魚魚肉TVB- N值的變化見圖4。樣品TVB- N值隨著流通時間延長呈上升趨勢，在貯藏初期(0～24 h)，SS組的TVB- N值上升緩慢(P>0.05)；在貯藏后期(96～120 h)，BC組樣品的TVB- N值顯著升高，均高于同一流通時間節(jié)點的CL組樣品(P<0.05)。在流通120 h后BC組樣品TVB- N值已由鮮魚初始的(7.95±0.49) mg/100g上升至(20.57±0.98) mg/100g，超過了一級品的標準范圍，而CL組仍屬于一級鮮度?？梢?，溫度波動與TVB- N值的持續(xù)上升密切相關，這與徐曉蓉等[21]的馬鮫魚冷鏈流通過程中品質(zhì)變化研究結果相似。此外，樣品TVB- N值上升趨勢與菌落總數(shù)變化趨勢一致，說明微生物生長繁殖可能加快了魚肉中蛋白質(zhì)氧化分解和胺類化合物的產(chǎn)生，造成魚肉品質(zhì)下降。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖4 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚TVB- N值的變化Fig.4 Changes of TVB- N value of Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

2.1.4K值的變化

K值能反映魚體死后ATP降解反應進行的程度，是衡量魚類新鮮度的重要指標。一般認為即殺的魚K值在10%以下，在20%以下為一級品，20%～40%為二級鮮度，60%～80%為初期腐敗魚[21]。模擬冷鏈流通過程中金鯧魚魚肉K值的變化見圖5。本研究中新鮮金鯧魚肉的K值為(10.85±0.19)%，隨著時間的延長流通期間K值呈上升趨勢；且每個流通時間節(jié)點BC組的K值均顯著高于CL組(P<0.05)，流通120 h后BC組樣品的K值已達到(61.05±1.32)%，成為初期腐敗魚。結果表明：溫度的頻繁波動提高了ATP的降解速度并造成K值的增長速率加快[19]，對金鯧魚的鮮度造成了顯著影響。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖5 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚K值的變化Fig.5 Changes of K value of Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

2.1.5TBA值的變化

TBA值一般用來反映水產(chǎn)品中脂肪氧化的程度，TBA值越高代表樣品脂肪氧化程度越大，標志著魚肉品質(zhì)劣變速度越快[22]。模擬冷鏈流通過程中金鯧魚魚肉TBA值的變化見圖6。在流通過程中各組樣品TBA值總體均呈上升趨勢，CL組的上升速率較BC組緩慢，流通120 h后BC- 120組樣品的TBA值已由流通前(0.02±0.01) mg/kg上升至(0.38±0.02) mg/kg，且顯著高于CL- 120組(P<0.05)，其原因可能是溫度波動導致魚肉中肌細胞結構受損和肌纖維完整性降低，加快魚肉中脂肪的氧化速率。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖6 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚TBA值的變化Fig.6 Changes of TBA value of Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

2.2 金鯧魚各品質(zhì)指標相關性分析

CL組和BC組的金鯧魚各品質(zhì)指標的Pearson相關系數(shù)分析見表1。BC組中TBA值與K值呈不顯著正相關(P>0.05)。其余微生物指標和鮮度指標均呈顯著正相關(P<0.05)，說明微生物代謝產(chǎn)物的積累會引起金鯧魚的品質(zhì)變化，而貯藏時間和溫度波動會影響微生物的增長速率，從而影響劣變速度。因此這些指標均可作為金鯧魚流通期間的鮮度綜合評定指標。

表1 模擬冷鏈流通期間金鯧魚品質(zhì)指標相關性分析

2.3 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚微生物演替變化

2.3.1微生物群落多樣性與結構差異分析

經(jīng)高通量測序平臺獲得原始序列后，對各樣本數(shù)據(jù)進行質(zhì)控過濾得到有效數(shù)據(jù)，然后進行統(tǒng)計分析優(yōu)化，結果見表2。各時期樣品原始序列數(shù)范圍為68 004～87 483條，樣品優(yōu)化有效序列范圍為63 174～80 204條，平均長度范圍為408.4～416.9 bp，本次測序每個樣品的有效序列百分比均達50%以上，已滿足了微生物多樣性分析的要求[9]。由表2可知，樣品測序覆蓋率均大于0.99，可用于細菌多樣性分析，相對于SS組而言，CL組和BC組中ACE、Chao、Shannon指數(shù)普遍降低，而Simpson指數(shù)普遍升高，表明低溫對部分微生物的生長產(chǎn)生抑制作用，更適于耐冷優(yōu)勢菌生長。與其他樣品相比，BC- 48組的微生物多樣性和豐富度下降明顯，各菌種分布均勻度增加，可能是因為斷鏈流通48 h后金鯧魚已開始腐敗變質(zhì)，營養(yǎng)環(huán)境發(fā)生了改變，導致優(yōu)勢腐敗菌占據(jù)優(yōu)勢，從而抑制了其他細菌的繁殖生長，并形成了新的群落結構[23]。而樣品BC- 120組的微生物多樣性和豐富度上升，可能是由于代謝產(chǎn)物的累積導致微生物群落結構發(fā)生了轉(zhuǎn)變[24]。另外CL組中各個時間點的ACE、Chao、Shannon指數(shù)均高于BC組(除CL- 120組的ACE指數(shù)外)，而Simpson指數(shù)正好相反，表明CL組樣品中的微生物多樣性比BC組更加豐富。結果表明：溫度波動導致細菌群落的豐富性和多樣性減少，使CL組與BC組樣品間細菌菌群結構差異明顯。這與肖蕾[25]對大目金槍魚的研究結果相似，證明水產(chǎn)品中的微生物多樣性變化受溫度波動的影響明顯。

表2 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚樣品序列信息和Alpha多樣性指數(shù)

2.3.2微生物群落結構組成分析

經(jīng)RDP classifier軟件對樣品序列物種注釋，本研究在門、屬分類學水平具體分析了冷鏈流通期間魚肉的微生物群落結構組成。模擬冷鏈流通期間魚肉的微生物菌相主要由變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)組成，除這些主要菌門外，還存在一些豐度較低的放線菌門(Actinobacteria)、浮桿菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)等，選取豐度前10的菌種繪制成門水平的菌落結構分布圖[圖8(a)]。在門水平上，SS組(SS- 0、SS- 24)中擬桿菌門由31.01%快速下降至10.36%，后續(xù)波動較小并保持在一定范圍內(nèi)，說明擬桿菌門不是樣品腐敗的主要原因。而SS- 24組與CL組(CL- 48、CL- 96)比較發(fā)現(xiàn)，它們的菌相組成相似，表明在冷鏈過程中溫度維持在2 ℃左右時細菌的種類與相對豐度變化較小；而與BC組(BC- 48、BC- 96)相比，BC- 48組的變形菌門迅速增至74.52%，BC- 96組的優(yōu)勢菌除了變形菌門(57.01%)還有厚壁菌門(30.43%)。當后期流通溫度變?yōu)? ℃(到達家庭冰箱)時，菌相再次發(fā)生變化，變形菌門和綠彎菌門成為主要優(yōu)勢菌，但CL組與BC組存在數(shù)量差異。結果表明：環(huán)境溫度與菌相組成相關，變形菌門在金鯧魚腐敗過程中發(fā)揮著重要作用。

圖8 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚的微生物群落結構差異Fig.8 Differences of microbial community structure of Trachinotus ovatus during simulated cold chain circulation

模擬冷鏈流通期間魚肉的微生物菌相在屬水平主要包括苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、八疊球菌屬(Sporosarcina)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、長繩菌屬(Longilinea)、普雷沃菌屬(Prevotella)，除這些主要菌屬外，還存在鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、大豆根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)等，選取豐度前10的菌種繪制成屬水平的菌落結構分類圖[圖8(b)]。在屬水平上，各樣品在冷鏈流通期間微生物多樣性與豐度存在區(qū)別。新鮮金鯧魚樣品以苯基桿菌屬、普雷沃菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和乳桿菌屬為主；隨著貯藏時間的延長部分微生物的繁殖呈現(xiàn)不同變化趨勢，在冷藏中后期CL組主要以苯基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、長繩菌屬、unclassified_Anaerolineaceae為主；而由于溫度波動導致BC組與CL組存在一定區(qū)別，BC組主要以苯基桿菌屬、八疊球菌屬、長繩菌屬和unclassified_Anaerolineaceae為主。屬水平分析結果與門水平一致，特別是屬水平的結果證明溫度波動使細菌種類與菌數(shù)發(fā)生變化。

在整個冷鏈流通過程中苯基桿菌屬(Phenylobacterium)始終占據(jù)優(yōu)勢，相對豐度為16.07%～83.51%。在冷藏中期BC- 48組中相對豐度達到最大值83.51%，CL- 48組中占74.54%，冷藏后期雖有一定程度下降，但BC組的占比仍高于CL組，說明冷鏈流通過程中的溫度波動提高了該菌屬的增長速率。苯基桿菌屬是被Lingens等[26]在1985年首次鑒定出，近年來該菌屬的相關新菌種于湖水[27]、農(nóng)藥制造廠的污泥[28]等生境中不斷被分離出，支持了苯基桿菌屬在自然界分布廣泛、生命力頑強的觀點，但鮮見有報道其在水產(chǎn)品腐敗中的作用，具體腐敗作用有待進一步研究。

在新鮮魚肉樣品(SS- 0)中普雷沃菌屬(Prevotella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)占比最高，相對豐度比例分別為45.20%、13.30%和12.27%。普雷沃菌屬、乳桿菌屬在冷藏120 h后相對豐度均小于1%，說明普雷沃菌屬、乳桿菌屬并非金鯧魚冷鏈流通過程中的優(yōu)勢菌。而鞘氨醇單胞菌屬廣泛存在于各種水體中，是海洋中的優(yōu)勢菌群，具有極強生命力并可以適應不斷變化的環(huán)境[29]。剛捕撈的金鯧魚魚體表面會帶有這類菌群，低溫在一定程度上可抑制其生長，但經(jīng)過沒有溫度波動的理想冷鏈過程(0～96 h)后，CL- 96組鞘氨醇單胞菌屬相對豐度可達到34.46%，成為CL組流通中期的次要優(yōu)勢菌。相反在BC- 96組中八疊球菌屬(Sporosarcina)占比較高(30.75%)，成為BC組流通中期的次要優(yōu)勢菌。已有相關研究證明：八疊球菌屬是與食源性病原體蠟狀芽孢桿菌有密切關系的菌株，Tsuda等[30]從阿拉斯加鱈魚、梭子魚和白花魚的魚糜中分離出了八疊球菌屬，并發(fā)現(xiàn)其在10 ℃下的生長能力比28 ℃下更強。

隨著流通時間的延長，長繩菌屬在CL- 120、BC- 120組相對豐度分別升至20.20%和26.86%，unclassified_Anaerolineaceae相對豐度占比大于10%，已知其為厭氧繩菌綱(Anaerolineae)，在流通末期的相對豐度分別升至37.66%和45.43%，與長繩菌屬變化規(guī)律一致，但未能鑒定到具體菌屬，因此有待進一步研究。長繩菌屬和unclassified_Anaerolineaceae兩者均為綠彎菌門(Chloroflexi)，可從河口、海水、海底沉積物、污染河流和活性淤泥中鑒定出[31]，因此可認為長繩菌屬和unclassified_Anaerolineaceae為流通末期的次要優(yōu)勢菌。

本研究檢測到冷鏈流通前期SS組的優(yōu)勢菌群是苯基桿菌屬，由于溫度波動的存在導致貯藏后期流通過程主要優(yōu)勢屬種有所不同，CL組的優(yōu)勢菌群是苯基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和長繩菌屬，BC組的優(yōu)勢菌群是苯基桿菌屬、八疊球菌屬和長繩菌屬。同時結果表明：部分優(yōu)勢微生物對冷鮮金鯧魚品質(zhì)變化有著至關重要的影響。但這與于淑池等[24]通過傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)結合16S rDNA序列分析腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)是冷藏卵形鯧鲹的優(yōu)勢腐敗菌的研究結果不一致，其原因一方面可能是物種棲息地不同導致初始菌相不同，另一方面可能是由于高通量測序技術較傳統(tǒng)分離檢驗技術更為快捷全面，能夠直接對待測樣本中全部基因組序列進行檢測，從而能夠檢查出以前無法培養(yǎng)的比較新型的腐敗菌。

2.4 細菌群落功能預測分析

在不同貯藏時間菌群的多樣性和分布特征分析的基礎上，利用細菌群落功能預測工具PICRUSt對金鯧魚細菌群落分布進行了功能特征預測。依據(jù)KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫進行分析對比，新陳代謝通路是各類微生物獲得營養(yǎng)后進行個體生長發(fā)育繁殖的主要代謝作用途徑，同時也是直接影響各類食品品質(zhì)和風味的主要代謝途徑[32]。與新陳代謝相關的通路主要是各種碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝、核苷酸代謝、輔酶因子及各種維生素代謝等，其中碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝這三大新陳代謝與腐敗氧化有著較為緊密的聯(lián)系，圖9是與三大新陳代謝作用相關的基因的相對豐度分布特征分析。

在代謝功能基因聚類上，根據(jù)不同的貯藏時間和環(huán)境溫度波動這2個因素，金鯧魚樣品細菌代謝相關基因可聚成4類。隨著魚肉貯藏時間的延長，由于細菌的形成而產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，代謝基因相對豐度總體呈先上升后下降趨勢。魚肉經(jīng)過24 h冷藏后，溫度波動導致冷藏中期的代謝相關基因存在差別，但整體上在BC- 48、BC- 96組中代謝相關基因相對豐度持續(xù)上升，而CL- 48、CL- 96組中的代謝相關基因相對豐度則隨之降低；而在冷藏后期代謝相關通路發(fā)生轉(zhuǎn)變，但代謝相關基因豐度隨之降低，而BC- 120組代謝相關基因豐度高于CL- 120組，這可能是由于在冷藏后期細菌多樣性下降，群落結構趨于簡單，導致代謝相關菌減少而引起相關基因相對豐度的降低，這與張夢思等[33]發(fā)現(xiàn)日本鯖與黃魚在冷藏中后期代謝相關基因相對豐度降低的研究結果相似。

圖9 模擬冷鏈流通過程中金鯧魚碳水化合物、脂類、氨基酸代謝分類功能預測Fig.9 Prediction of carbohydrate, lipid, and amino acid metabolism classification function during simulated cold chain circulation of Trachinotus ovatus

在整個貯藏過程中，氨基酸代謝在基因通路豐度上占據(jù)明顯優(yōu)勢，以色氨酸、苯丙氨酸代謝以及賴氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解為主；在碳水化合物代謝基因通路中，主要以丙酸代謝和丁酸代謝為主；而脂質(zhì)代謝通路中主要以脂肪酸降解為主。BC組的各個代謝相關基因豐度都超過了CL組，因此BC組較CL組的腐敗速度快，說明由于溫度波動而使得BC組中能夠進行蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類等物質(zhì)新陳代謝的微生物數(shù)量比CL組更為豐富，在相關微生物的作用下產(chǎn)生的醛、酮和酸等物質(zhì)使魚體產(chǎn)生強烈腥臭味并引起品質(zhì)降低。

3 結 論

本研究分析了金鯧魚在冷鏈與斷鏈流通中品質(zhì)變化的相關性及其微生物群落演替規(guī)律。隨著流通時間的延長，BC組樣品的品質(zhì)顯著下降(P<0.05)，證明溫度波動的存在與各指標的變化密切相關，Pearson相關系數(shù)分析表明，菌落總數(shù)、嗜冷菌數(shù)、TVB- N值、pH值、K值均呈極顯著(P<0.01)相關性，可作為評判金鯧魚品質(zhì)變化情況的有效指標。同時基于高通量分析金鯧魚微生物群落變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了細菌群落的豐富性和多樣性會隨貯藏時間的延長而降低，菌相分析判斷苯基桿菌屬是金鯧魚整個冷鏈流通期間的主要優(yōu)勢菌，其中CL組的次要優(yōu)勢菌是鞘氨醇單胞菌屬、長繩菌屬和unclassified_Anaerolineaceae；BC組的次要腐敗菌是八疊球菌屬、長繩菌屬和unclassified_Anaerolineaceae。通過細菌群落功能預測，從代謝水平上進一步解釋了溫度波動導致BC組中微生物新陳代謝的增強，引起更快速地腐敗現(xiàn)象。本研究表明：冷鮮水產(chǎn)品的腐敗速率不但與優(yōu)勢微生物相關，還和運輸方式有著十分重要的關系，為了達到抑制微生物生長繁殖的目的，需全面調(diào)控冷鏈流通期間的各影響因素以保證商品質(zhì)量，研究旨在為水產(chǎn)品運輸消費過程中的儲藏保鮮提供理論依據(jù)。