維生素D調(diào)節(jié)IFN-γ/IL-10分泌和抑制miR-326/miR-96表達(dá)改善EAE小鼠神經(jīng)功能①

葉勵(lì)超 黃玉婷（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，泉州 362000）

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是常用于研究人類多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的動(dòng)物模型，其特征為CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的、體液免疫及補(bǔ)體共同參與、針對(duì)髓鞘自身抗原的炎癥反應(yīng)，病理特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘、小血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，以單核細(xì)胞為主［1］。

維生素D（Vitamin D，VD）參與人體鈣、磷代謝和穩(wěn)態(tài)維持，是自身無法合成的微量有機(jī)物質(zhì)。人體通過暴露于陽光下、膳食攝入和服用藥物等途徑補(bǔ)充VD。近年VD被用于治療多種免疫系統(tǒng)疾病，并取得了一定臨床效果［2］。流行病學(xué)研究表明，MS發(fā)病率與日光照射時(shí)間顯著相關(guān)［3］。早期生活時(shí)體內(nèi)VD含量減少與MS患病風(fēng)險(xiǎn)可能存在某種關(guān)聯(lián)。有研究報(bào)道，MS患者VD水平較正常人明顯降低，提示人體VD缺乏或含量不足可能增加MS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［4-6］。在動(dòng)物模型中，補(bǔ)充VD可顯著減輕EAE神經(jīng)功能缺失癥狀，但VD發(fā)揮保護(hù)作用的病理生理機(jī)制尚不明確［7］。

microRNAs（miRNAs）在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病和癌癥中發(fā)揮重要作用。miR-326通過調(diào)控抗原特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞調(diào)控免疫系統(tǒng)功能并影響自身免疫性疾病進(jìn)展［8-9］。臨床上MS患者在復(fù)發(fā)期和緩解期miR-326和miR-96均呈異常表達(dá)，說明miR-326和miR-96參與MS病理 形 成［10-11］。但VD是 否 通 過 調(diào) 節(jié)miR-326和miR-96進(jìn)而影響MS進(jìn)程尚未闡明。

因此，本研究通過建立EAE小鼠模型，評(píng)估VD對(duì)EAE小鼠細(xì)胞因子水平和miR-326和miR-96表達(dá)的影響，為MS的可能發(fā)病機(jī)制及防治提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠48只6周齡SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠，體質(zhì)量20～25 g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀器MOG35-55（上海翊圣生物）；完全弗氏佐劑、百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）、DEPC（美國Sigma）；VD、多聚甲醛（上海生工）；無VD純化型飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司）；水合氯醛（上海Aladdin）；小鼠25-羥基維生素D3、小鼠IFN-γ、小鼠IL-10 ELISA試劑盒（北京麗科）；PCR引物、RT試劑、熒光定量PCR試劑、SYBR GreenⅠ（Western Biotechnology）；TRIzol（碧云天）；凝膠掃描系統(tǒng)（GDS8000，UVP，LLC）。

1.2 方法

1.2.1 EAE小鼠模型建立參考文獻(xiàn)［12］，小鼠于22℃、55%濕度、12 h光/12 h暗循環(huán)飼養(yǎng)，自由飲食飲水。將MOG35-55采用PBS稀釋至終濃度為0.5 mg/ml，與相同體積完全弗氏佐劑充分混合，制備0.25 mg/ml MOG35-55溶液，通過三通管將乳劑抽打?yàn)橥耆桶疇顟B(tài)。每只小鼠給予200μg MOG35-55處理。第1次免疫當(dāng)日（第0天）和第2天（48 h）分別在小鼠背部中線兩側(cè)4個(gè)穴位皮下注射MOG35-55（每點(diǎn)0.2 ml或500 ng）。PTX按500 ng PTX/0.2 ml PBS比例配制成PBS緩沖液，腹腔注射500 ng（或0.2 ml）PTX，構(gòu)建EAE模型。

1.2.2 VD干預(yù)和分組將小鼠隨機(jī)分為VD干預(yù)組（VD組）和非VD干預(yù)組（NOVD組），每組24只。VD組小鼠喂食VD（200 U/d，5μg/d），隔天服用，連續(xù)30 d。在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定200 U/d為維持VD作用的最小劑量，VD組小鼠允許自由獲得缺乏VD的食物。NOVD組小鼠30 d內(nèi)僅食用無VD純化型飼料。兩種飲食均在EAE誘導(dǎo)前1 d（-1 d）給予，之前接受正常飼料。將VD組和NOVD組小鼠隨機(jī)分為4個(gè)亞組：EAE誘導(dǎo)前組（-1 d）和EAE誘導(dǎo)后第10天組、第16天組、第30天組，每組6只。每天對(duì)小鼠進(jìn)行監(jiān)測，觀察疼痛癥狀、行為，并記錄食欲和活動(dòng)水平。

1.2.3 神經(jīng)功能評(píng)估采用Benson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別于EAE誘導(dǎo)后第10、16和30天評(píng)估小鼠神經(jīng)功能。0分：無臨床癥狀；1分：尾巴軟綿綿或搖搖擺擺的步態(tài)；2分：搖搖擺擺伴尾軟（共濟(jì)失調(diào)）；2.5分：共濟(jì)失調(diào)伴部分肢體癱瘓；3分：一側(cè)肢體完全癱瘓；3.5分：一側(cè)肢體完全癱瘓，另一側(cè)肢體部分癱瘓；4分：四肢完全癱瘓；4.5分：垂死動(dòng)物；5分：瀕臨死亡或死亡。

1.2.4 ELISA小鼠腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg），取眼球采血，靜置2 h，4℃下3 000 r/min離心20 min，隨后分離上層血清用于ELISA試驗(yàn)。每只小鼠取血清500μl，采用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測血清IFN-γ、IL-10和25-羥基維生素D3含量。

1.2.5 RT-qPCR檢測采用放射免疫沉淀法從小鼠脊髓中提取總RNA，根據(jù)說明用cDNA合成試劑盒合成cDNA，SYBR GreenⅠPCR試劑盒檢測miR-326和miR-96表達(dá)，引物序列見表1。以外部線蟲miRNA（cell-miR-39）為內(nèi)參。提取總RNA前將cell-miR-39以10 fmol/μl加 入 小 鼠 脊 髓 組 織 勻 漿中，PCR儀擴(kuò)增，凝膠掃描系統(tǒng)處理，2-ΔΔCt法分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分 析，數(shù)據(jù)以±s表 示，組間 比較采用ANOVA和Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VD減輕EAE小鼠神經(jīng)損傷神經(jīng)功能評(píng)估過程中，NOVD組與VD組神經(jīng)功能評(píng)分總體趨勢相似，分?jǐn)?shù)先升高后降低。兩組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分均在EAE誘導(dǎo)后第16天達(dá)到最高值，癥狀最為嚴(yán)重。免疫后10 d和16 d，VD組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分均明顯低于NOVD組（P＜0.05）。免疫后30 d，NOVD組小鼠神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分也高于VD組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

圖1 VD對(duì)EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響Fig.1 Effects of VD on neurological scores of EAE mice

圖2 VD對(duì)EAE小鼠25-羥基維生素D3含量的影響Fig.2 Effects of VD on secretion of 25-hydroxyvitamin D3 in EAE mice

2.2 VD增強(qiáng)EAE小鼠25-羥基維生素D3分泌在造模前1 d與造模后第10天，VD組與NOVD組小鼠血清25-羥基維生素D3水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。EAE誘導(dǎo)后第16天和第30天，NOVD組小鼠25-羥基維生素D3水平保持不變（P＞0.05），VD組顯著升高（P＜0.000 1），且明顯高于NOVD組（P＜0.000 1，圖2）。

2.3 VD抑制EAE小鼠IFN-γ分泌、增加IL-10分泌EAE誘導(dǎo)前1天，VD組和NOVD組小鼠IFN-γ、IL-10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），EAE誘導(dǎo)后第10、16和30天，兩組IFN-γ、IL-10水平均顯著升高（P＜0.05），但VD組IFN-γ明顯低于NOVD組（P＜0.000 1），IL-10水平明顯高于NOVD組（P＜0.000 1），建模后第16天，IFN-γ達(dá)到最高水平，IL-10達(dá)到最低水平（圖3）。

2.4 VD下 調(diào)EAE小 鼠miR-326和miR-96表 達(dá)VD組小鼠在EAE誘導(dǎo)后第10、16和30天，miR-326表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與NOVD組相比顯著降低（P＜0.01，圖4A）。NOVD組小鼠EAE誘導(dǎo)后第10、16和30天，miR-96表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但VD組較NOVD組顯著降低（P＜0.001，圖4B）。

圖3 VD對(duì)EAE小鼠IFN-γ和IL-10含量的影響Fig.3 Effects of VD on secretion of IFN-γand IL-10 in EAE mice

圖4 VD對(duì)EAE小鼠miR-326和miR-96表達(dá)的影響Fig.4 Effects of VD on expressions of miR-326 and miR-96 in EAE mice

3 討論

MS是一種慢性自身免疫紊亂性疾病，主要損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦白質(zhì)和脊髓，具有多病灶、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。疾病常導(dǎo)致患者遺留感覺、運(yùn)動(dòng)等神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，嚴(yán)重威脅個(gè)人、家庭和社會(huì)健康。EAE動(dòng)物模型的臨床特點(diǎn)、免疫應(yīng)答和病理變化與人類MS高度一致，因此常用于MS研究，但MS發(fā)病的具體機(jī)制尚未闡明。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，MS和EAE的免疫學(xué)機(jī)制均為T細(xì)胞和B細(xì)胞靶向髓鞘特異抗原導(dǎo)致的炎癥性脫髓鞘反應(yīng)。

研究報(bào)道，增加陽光照射和VD攝入可提高人體活性VD濃度，日照時(shí)間少、VD含量低可能是MS的重要危險(xiǎn)因素［3-5］。補(bǔ)充VD能部分減輕MS患者炎癥脫髓鞘［13］。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)VD治療具有保護(hù)EAE、減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷作用，其可能機(jī)制如下：mTOR是一個(gè)重要的真核細(xì)胞信號(hào)，可影響細(xì)胞因子表達(dá)，VD通過抑制多效性細(xì)胞mTOR通路參與免疫抑制［14-15］；自噬在保護(hù)神經(jīng)元功能中扮演關(guān)鍵角色，VD具有調(diào)節(jié)自噬、減輕神經(jīng)元損傷作用［16］；通過誘導(dǎo)Nrf2/血紅素加氧酶1/一氧化碳軸預(yù)防EAE［17］。本研究顯示，VD治療組EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低，表明VD可能減輕EAE炎癥性脫髓鞘損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。EAE誘導(dǎo)后的第16天和第30天，小鼠血清25-羥基維生素D3水平顯著升高，提示作為VD的一種活性形式，25-羥基維生素D3參與EAE炎癥過程，能夠有效減輕臨床癥狀，與既往研究結(jié)論一致［18］。表明補(bǔ)充VD治療對(duì)EAE小鼠有保護(hù)作用，可能間接激活25-羥基維生素D3產(chǎn)生。但有學(xué)者認(rèn)為25-羥基維生素D3在EAE自身免疫應(yīng)答中不起關(guān)鍵作用，因?yàn)槿狈D受體的EAE小鼠也部分受到VD保護(hù)［19］。本研究在EAE誘導(dǎo)后第10天，VD組和NOVD組血清25-羥基維生素D3水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測體內(nèi)25-羥基維生素D3分泌存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，有待深入研究。

CD4+T細(xì)胞可介導(dǎo)MS炎癥脫髓鞘過程，輔助性T（Th）細(xì)胞進(jìn)一步分化為不同亞群，包括Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子協(xié)調(diào)不同免疫效應(yīng)。由Th1細(xì)胞分泌的炎癥因子，如IFN-γ、TNF、IL-12等深入?yún)⑴cMS發(fā)生和進(jìn)展，Th2細(xì)胞分泌的炎癥因子，如IL-10，TGF-β等可以有效減輕MS炎癥和緩解疾病；Th17細(xì)胞分泌IL-17、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子，促發(fā)MS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和組織損傷［20］。細(xì)胞因子IFN-γ參與自身免疫病理生理過程，是導(dǎo)致MS和EAE發(fā)病的主要炎癥遞質(zhì)，IFN-γ水平升高可誘發(fā)和加重疾病。EAE小鼠在禁食后IFN-γ分泌減少，神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度明顯降低［21］。本研究VD組小鼠IFN-γ水平明顯低于NOVD組，提示VD可抑制IFN-γ分泌，從而間接緩解EAE癥狀。細(xì)胞因子IL-10能減輕EAE炎癥反應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞表型極化，由M1型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型，從而改善EAE相關(guān)神經(jīng)功能，其特征為IL-10表達(dá)增加［22］。本研究顯示，VD在EAE誘導(dǎo)后第10、16和30天促進(jìn)IL-10分泌，減輕EAE小鼠神經(jīng)損傷。但在EAE造模后第16天，IL-10水平未見顯著差異（VD組僅輕微升高），可能與EAE小鼠該天神經(jīng)功能評(píng)分達(dá)到峰值、癥狀最嚴(yán)重有關(guān)。

miRNA參與機(jī)體炎癥反應(yīng)與免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)，通過影響T細(xì)胞和B細(xì)胞功能調(diào)控自身免疫性疾病進(jìn)展。miR-326是Th17細(xì)胞相關(guān)miRNA，在MS復(fù)發(fā)和緩解期顯著過表達(dá)［10］；miR-96可增強(qiáng)Th17細(xì)胞致病性，復(fù)發(fā)緩解型MS患者血漿miR-96表達(dá)增強(qiáng)［23］。VD干預(yù)是否會(huì)影響EAE小鼠模型miR-326和miR-96表達(dá)尚不清楚。本研究測定了這兩種miRNAs表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VD干預(yù)的EAE小鼠miR-326和miR-96表達(dá)明顯減少，提示VD可能通過抑制miR-326和miR-96表達(dá)從而調(diào)節(jié)自身免疫與炎癥反應(yīng)，改善EAE小鼠神經(jīng)功能。此前一項(xiàng)研究表明，VD受體被預(yù)測為miR-326的直接靶點(diǎn)，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究［24］。

總之，本研究證實(shí)VD能促進(jìn)小鼠體內(nèi)25-羥基維生素D3形成，VD可能通過減少IFN-γ生成、促進(jìn)IL-10分泌、下調(diào)miR-326和miR-96表達(dá)改善EAE小鼠神經(jīng)功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持VD對(duì)EAE小鼠發(fā)揮保護(hù)作用的事實(shí)，從而為EAE提供了一種潛在治療方法。本研究存在一定局限性，如各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量較少；未進(jìn)一步闡明miR-326和miR-96對(duì)T細(xì)胞和Th17細(xì)胞反應(yīng)的影響，如Th17/Treg平衡，需要更多實(shí)驗(yàn)探究miR-326和miR-96在EAE中的作用，未研究VD對(duì)VD受體表達(dá)的調(diào)控作用。