Notch/Hes1-PI3K/AKT/mTORC1信號軸調(diào)控銀屑病樣皮炎小鼠白細胞介素17A表達的研究①

李新新 王燕芹 邢瀟勻 馬 蕾（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，濱州 256603）

IL-17A導(dǎo)致的免疫紊亂和炎癥效應(yīng)是銀屑病的重要致病因素，輔助性T細胞17（Th17）是其主要來源細胞［1-2］。Notch信號通路在T淋巴細胞分化中起關(guān)鍵作用，在小鼠和人促Th17分化的細胞因子環(huán)境中均有Notch信號通路的活化［3］。課題組前期研究亦表明，Notch/發(fā)狀分裂相關(guān)增強子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）信號通路能夠調(diào)控銀屑病患者及銀屑病樣皮炎小鼠Th17的分化和功能［4-5］。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（also known as PKB，protein kinase B，AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路在銀屑病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，且該信號通路能夠正向調(diào)控Th17的分化［6-8］。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）是PI3K/AKT/mTOR信號通路上游的負向調(diào)控因子，急性T淋巴細胞白血病研究顯示，Notch信號通路靶基因Hes1能夠負向調(diào)控PTEN［9-10］。本研究以銀屑病樣皮炎小鼠為研究對象，利用γ分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號通路，以探討Notch/Hes1-PI3K/AKT/mTOR復(fù)合物1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號軸對IL-17A表達和分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠來源及飼養(yǎng)24只雄性健康無特定病原（SPF）級BALB/c小鼠（濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物合格證號：1107261911003852），6周齡，體質(zhì)量（18±2）g，飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院SPF動物房，動物實驗許可證號：SYXK（魯）20180022，室溫（23±1）℃，照度15～20 Lux，光照時間為每天7：00～19：00，晝夜明暗交替時間12 h/12 h，標(biāo)準(zhǔn)滅菌飼料和高壓蒸汽滅菌水飼養(yǎng)，自由取食，實驗過程遵循減少、替代、優(yōu)化的3R原則。

1.1.2 主要試劑與儀器5%咪喹莫特乳膏（英國3M Health Care Limited公司）；DAPT（純度99%，美國Selleck公司）；Trizol RNA提取試劑、引物的設(shè)計及合成［生工生物工程（上海）股份有限公司］；PrimeScriptTMRT試劑盒、TB Green?PreMix Ex TaqTMⅡ試劑盒（日本TaKaRa公司）；CFX96 TouchTMReal-Time PCR檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；RIPA組織/細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；兔抗鼠多克隆抗體Hes1、PTEN、磷酸化（p）-AKT絲氨酸473位 點（Ser473）、p-mTOR絲 氨 酸2448位 點（Ser2448）、IL-17A和GAPDH（美國Affinity Biosciences公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（美國Jackson ImmunoResearch公司）；增強型ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)檢測儀（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理將24只小鼠按隨機數(shù)字法分為對照組、模型組和干預(yù)組，每組8只。按參考文獻［11-12］采用5%咪喹莫特乳膏（62.5 mg/d）外涂小鼠背部制備銀屑病樣皮炎動物模型，對照組小鼠涂抹等劑量白凡士林；在外涂咪喹莫特乳膏后立即給干預(yù)組小鼠腹腔注射DAPT工作液［10 mg/（kg·d），將10 mg DAPT溶解于1 ml二甲基亞砜（DMSO），配制成儲存液（10 mg/ml），置于-20℃冰箱儲存，用時以玉米油溶解DAPT儲存液，配制成工作液（0.2 mg/ml）］，對照組及模型組小鼠腹腔注射等劑量玉米油與DMSO混合液［11］。以上處理每天固定時間進行1次，連續(xù)6次，末次處理24 h后麻醉并處死小鼠，取皮損組織行實時熒光定量PCR（RT-PCR）和Western blot檢測。本研究經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會討論批準(zhǔn)（編號：20190104-15）。

1.2.2 皮膚組織病理學(xué)檢查剪取背部0.5 cm×0.5 cm的皮膚組織，4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色后于顯微鏡下觀察。Image-Pro Plus 6.0軟件測量表皮厚度。

1.2.3 RT-PCR檢測小鼠皮膚組織中Hes1、PTEN、AKT、mTORC1及IL-17A mRNA的 表 達采 用Trizol RNA提取試劑抽提小鼠皮膚組織中總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度儀測定其純度，吸光度比值（A260/A280）在1.8～2.0為合格樣本。采用PrimeScriptTMRT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照，采用TB Green?PreMix Ex TaqTMⅡ試 劑 盒 在CFX96 TouchTMReal-Time PCR檢測系統(tǒng)上行RT-PCR檢測。PCR反應(yīng)體系共25μl：cDNA模板2μl（＜100 ng），0.4μmol/L正、反向引物各1μl，TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ（2×）12.5μl，滅菌水8.5μl。引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 min，95℃變性5 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。根據(jù)2-ΔΔCt公式計算Hes1、PTEN、AKT、mTORC1、IL-17A mRNA的相對表達量，其中ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，ΔΔCt=實驗樣本ΔCt值-校準(zhǔn)樣本ΔCt值。

1.2.4 Western blot檢測小鼠皮膚組織中Hes1、PTEN、p-AKT、p-mTOR和IL-17A蛋白表達量從液氮中取出凍存的小鼠皮膚標(biāo)本，用眼科剪將組織剪成細小的碎片并用組織勻漿器勻漿，采用RIPA裂解液于冰上提取皮膚組織蛋白，蛋白濃度均在50～2 000μg/ml范圍內(nèi)。取50μg總蛋白變性后，根據(jù)SDS-PAGE凝膠試劑盒恒壓電泳，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉2 h，TBST溶液洗膜3次后滴加一抗，分別為兔抗鼠多克隆抗體Hes1、PTEN、p-AKT、p-mTOR、IL-17A和GAPDH，稀釋比例均為1∶500，4℃過夜；TBST緩沖液洗膜4次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h；TBST洗膜4次，每次10 min。按增強型ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書顯色，在自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)下自動成像。實驗重復(fù)3次。應(yīng)用Image J軟件分析目的蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用Shapiro-Wilk檢驗法進行正態(tài)性檢驗。若Levene檢驗顯示方差齊，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD-t法；若方差不齊，數(shù)據(jù)以中位數(shù)M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩兩多重比較采用Dunn-bonferroni檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 皮損形態(tài)改變對照組小鼠皮膚始終無紅斑、鱗屑及浸潤增厚改變；模型組小鼠皮膚出現(xiàn)明顯紅斑、鱗屑及浸潤增厚；干預(yù)組小鼠皮膚紅斑、鱗屑及浸潤增厚現(xiàn)象較模型組明顯減輕，見圖1。皮損嚴(yán)重程度評分比較見圖2，對照組評分始終為0；模型組評分第2天開始持續(xù)提高，至第6天達到最高值；干預(yù)組前4天評分與模型組變化趨勢一致，第5天與第4天評分基本持平，第6天評分有下降趨勢，且與模型組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖l三組實驗小鼠背部皮膚表現(xiàn)Fig.1 Skin changes on back of three groups of experimental mice

圖2 三組實驗小鼠背部皮損嚴(yán)重程度評分Fig.2 Severity scores of back lesions in three groups of experimental mice

2.2 組織病理改變對照組小鼠皮膚菲薄，表皮層僅由1～2層細胞構(gòu)成；模型組小鼠表皮層明顯增厚，可見角化過度及角化不全，角化不全中有中性粒細胞聚集，形成Munro微膿腫，表皮突向下延伸，真皮炎癥細胞大量浸潤，真皮淺層可見血管擴張；干預(yù)組小鼠表皮增厚及真皮炎癥細胞浸潤程度較模型組均明顯減輕，見圖3。

比較三組實驗鼠表皮層厚度，對照組、模型組和干預(yù)組分別為（14.37±0.54）μm、（105.72±7.46）μm和（40.57±6.23）μm，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=560.543，P＜0.01）；進一步三組間兩兩比較（模型組比對照組、模型組比干預(yù)組、干預(yù)組比對照組）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為32.51、23.19、9.32，P均＜0.01）。

2.3 三組小鼠皮膚組織中Hes1、PTEN、mTORC1、AKT及IL-17A mRNA的表達如表2所示，三組小鼠皮膚組織中Hes1、PTEN、AKT、mTORC1及IL-17A mRNA表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。模型組PTEN mRNA表達水平顯著低于對照組（t=6.67，P＜0.001），而Hes1、AKT、mTORC1及IL-17A mRNA表達水平顯著高于對照組，t/Z值分別為15.25、5.57、3.39、14.63，P值 分 別 為＜0.001、＜0.001、0.003、＜0.001。經(jīng)DAPT干預(yù)處理后，干預(yù)組PTEN mRNA表達水平顯著高于模型組，t=6.51，P＜0.001，而Hes1、AKT、mTORC1及IL-17A mRNA表達水平均顯著低于模型組，t/Z值分別為8.75、4.13、2.65、9.38，P值分別為＜0.001、＜0.001、0.015、0.024。干預(yù)組Hes1、PTEN、AKT、mTORC1及IL-17A mRNA的表達與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，t/Z值分別為6.50、1.60、1.44、0.75、5.25，P值分別為0.198、0.875、0.165、0.464、0.413。

圖3 三組實驗小鼠皮膚組織病理組織學(xué)變化（HE，×200）Fig.3 Histopathological changes of skin tissue in three groups of experimental mice（HE，×200）

2.4 三組小鼠皮膚組織中Hes1、PTEN、p-AKT、p-mTOR及IL-17A蛋白表達如圖4、表3所示，三組小鼠皮膚組織中Hes1、PTEN、p-AKT、p-mTOR及IL-17A蛋白表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。模型組PTEN蛋白表達顯著低于對照組，t=4.45，P=0.031，而Hes1、p-AKT、p-mTOR及IL-17A蛋白表達顯著高于對照組，t/Z值分別為10.63、14.25、3.83、3.86，P值 分 別 為0.008、＜0.001、0.001、＜0.001。經(jīng)DAPT干預(yù)處理后，干預(yù)組PTEN蛋白表達顯著高于模型組，t=2.31，P＜0.001，而Hes1、p-AKT、p-mTOR及IL-17A蛋白表達顯著低于模型組，t/Z值分別為10.38、9.75、2.64、3.50，P值分別為0.010、0.017、0.015、＜0.001。干預(yù)組Hes1、p-AKT、p-mTOR及IL-17A蛋白表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，t/Z分別為0.25、4.50、1.19、0.36，P值分別為1.000、0.609、0.248、0.290，但干預(yù)組PTEN蛋白表達顯著低于對照組，t=2.14，P=0.031。

圖4 三組小鼠皮膚組織中Hes1、PTEN、p-AKT、p-mTOR及IL-17A蛋白印跡圖Fig.4 Western blot of Hes1，PTEN，p-AKT，p-mTOR and IL-17A in skin tissue in three groups of experimental mice

表2 三組小鼠皮膚組織中Hes1、PTEN、AKT、mTORC1及IL-17A mRNA表達水平［中位數(shù)M（P25，P75）或±s，n=8］Tab.2 Expression levels of Hes1，PTEN，AKT，mTORC1 and IL-17A mRNA in skin tissue in three groups of experimental mice［Median M（P25，P75）or xˉ±s，n=8］

表2 三組小鼠皮膚組織中Hes1、PTEN、AKT、mTORC1及IL-17A mRNA表達水平［中位數(shù)M（P25，P75）或±s，n=8］Tab.2 Expression levels of Hes1，PTEN，AKT，mTORC1 and IL-17A mRNA in skin tissue in three groups of experimental mice［Median M（P25，P75）or xˉ±s，n=8］

Note：1）Kruskal-Wallis H testχ2 value；2）One-Way ANOVA F test value.

Groups Control Model Intervention F/χ2 P Hes1 1.44（0.27，2.99）11.09（9.55，18.16）5.16（3.98，5.35）18.741）＜0.001 PTEN 1.04±0.32 0.25±0.14 1.02±0.21 28.962）＜0.001 AKT 1.59±1.01 5.72±2.02 2.66±1.23 16.742）＜0.001 mTORC1 1.16±0.49 3.11±1.81 1.59±0.67 6.362）0.007 IL-17A 1.20（0.57，3.43）37.24（23.02，92.63）8.59（3.55，11.23）17.561）0.000 1

表3 三組小鼠皮膚組織中Hes1、PTEN、p-AKT、p-mTOR及IL-17A蛋白表達水平［中位數(shù)M（P25，P75）或±s，n=8］Tab.3 Expression levels of Hes1，PTEN，p-AKT，p-mTOR and IL-17A protein in skin tissue in three groups of experimental mice［Median M（P25，P75）or xˉ±s，n=8］

表3 三組小鼠皮膚組織中Hes1、PTEN、p-AKT、p-mTOR及IL-17A蛋白表達水平［中位數(shù)M（P25，P75）或±s，n=8］Tab.3 Expression levels of Hes1，PTEN，p-AKT，p-mTOR and IL-17A protein in skin tissue in three groups of experimental mice［Median M（P25，P75）or xˉ±s，n=8］

Note：1）Kruskal-Wallis H testχ2 value；2）One-Way ANOVA F value.

Groups Control Model Intervention F/χ2 P Hes1 0.19（0.18，0.21）0.34（0.27，0.42）0.18（0.15，0.22）11.771）0.003 PTEN 0.91±0.28 0.39±0.21 0.66±0.20 9.922）0.001 p-AKT（Ser473）0.23（0.13，0.26）0.82（0.66，0.88）0.29（0.25，0.35）16.981）＜0.001 p-TOR（Ser2448）0.31±0.21 0.72±0.24 0.43±0.20 7.692）0.003 IL-17A 0.20±0.05 0.72±0.18 0.29±0.13 34.262）＜0.001

3 討論

銀屑病是一種由T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，Th17及其產(chǎn)生的效應(yīng)性細胞因子IL-17在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。IL-17A是IL-17家族最具代表性的細胞因子。在皮膚組織中，IL-17A可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生TNF-α、血管內(nèi)皮生長因子、IL-8、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和趨化因子CXCL10等細胞因子，促進角質(zhì)形成細胞增殖，抑制角質(zhì)形成細胞分化，破壞皮膚屏障，誘導(dǎo)多種前炎癥細胞因子和趨化因子的表達分泌，啟動并加重皮膚炎癥反應(yīng)［13-14］。本研究結(jié)果顯示，銀屑病樣皮炎小鼠皮損中IL-17A的mRNA和蛋白表達均明顯增高，進一步證實了IL-17A在銀屑病發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

Notch/Hes1信號通路參與細胞分化、增殖、凋亡和上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種生命活動過程［3］。在哺乳動物中，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由4類異二聚體形式的Notch受體、5類Ⅰ型跨膜蛋白的Notch配體和DNA結(jié)合蛋白CSL等組成。Notch配體與受體相互作用，在Notch受體分子的S2和S3兩個位點發(fā)生連續(xù)切割，S3被包含早老素的γ分泌酶復(fù)合物切割后，釋放出具有核定位信號的Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（notch intracellular domain，NICD），并移位至細胞核，與C啟動子結(jié)合因子1（CBF-1）、核轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族MAML結(jié)合形成CBF-NICD-MAML三元復(fù)合物，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如Hes1［15］。γ分泌酶抑制劑通過作用于早老素分子而阻斷γ分泌酶的作用，減少NICD產(chǎn)生，由于NICD啟動作用的缺失或減弱，下游信號分子處于靜止或下調(diào)狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，γ分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號后，銀屑病樣皮炎小鼠皮損嚴(yán)重程度明顯改善，PASI評分降低，表皮厚度及真皮炎癥細胞浸潤程度較模型組均明顯減輕，證實Notch信號通路參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展［4，11］。在銀屑病樣皮炎小鼠皮損組織中，Notch信號通路靶基因Hes1及IL-17A的mRNA和蛋白表達均明顯增加，DAPT阻斷Notch信號通路后，Hes1表達明顯下降，同時IL-17A mRNA和蛋白表達亦顯著降低，進一步表明Notch/Hes1信號通路對IL-17A表達和分泌具有調(diào)控作用［5］。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化、運動和生存的經(jīng)典信號途徑。在銀屑病相關(guān)研究中，抑制或減弱PI3K/AKT/mTOR信號通路能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的銀屑病細胞模型增殖，改善銀屑病樣皮炎小鼠皮損的嚴(yán)重程度及銀屑病人類皮膚模型的銀屑病樣表現(xiàn)［16-17］。PI3K/AKT/mTORC1信號途徑在Th17分化過程中發(fā)揮重要作用［6-8］。mTORC1能同時促進下游核糖體S6蛋白激酶1/2（S6K1/2）表達，并通過S6K1/2兩條信號途徑正向調(diào)控Th17的分化；敲除mTORC1上游的調(diào)控蛋白Raptor可阻止mTORC1的生物學(xué)效應(yīng)，使初始CD4+T細胞無法分化成Th17［7］。PTEN是PI3K上游的重要負向調(diào)控因子，PTEN通過將細胞膜上的磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）去磷酸化生成磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2），阻止PIP3將AKT招募到細胞膜上，進而拮抗PI3K介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。關(guān)于急性T淋巴細胞白血病的研究顯示，Notch信號通路靶基因Hes1結(jié)合于PTEN啟動子，能夠負向調(diào)控PTEN，進而促進PI3K/AKT信號通路的活化，而抑制Notch/Hes1可上調(diào)正常和病變T細胞中PTEN表達，降低AKT的磷酸化水平［9-10］。課題組前期研究結(jié)果表明，銀屑病患者外周血單個核細胞及銀屑病樣皮炎小鼠脾臟CD4+T淋巴細胞中高表達Notch/Hes1信號分子，γ分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch/Hes1信號通路可劑量依賴性地降低銀屑病患者外周血單個核細胞及銀屑病樣皮炎小鼠脾臟CD4+T淋巴細胞Th17的比例及IL-17A的表達［4-5］。銀屑病皮損中，p-mTOR已被證實主要與mTORC1的活性相關(guān)［18］。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠銀屑病樣皮損組織中PTEN表達顯著低于對照組，p-mTOR表達顯著增加；DAPT阻斷Notch信號后，干預(yù)組小鼠PTEN表達明顯高于模型組，p-mTOR表達則顯著降低。推測在銀屑病的疾病環(huán)境下，Notch/Hes1信號通路可能通過負向調(diào)控PTEN，經(jīng)PI3K/AKT/mTORC1信號途徑調(diào)控Th17的分化和功能，促進IL-17A的表達和分泌，增強IL-17A的致炎作用。

此外，亦有研究指出，活化的AKT能抑制Notch1受體酪氨酸殘基的磷酸化，減少Notch1經(jīng)溶酶體途徑的單泛素化和降解，以PI3K抑制劑LY294002或負顯性型AKT瞬時轉(zhuǎn)染人急性淋巴母細胞白血病細胞MOLT-4可明顯抑制Notch1蛋白的表達及活性，降低其靶基因Hes1的轉(zhuǎn)錄［19］。在動脈內(nèi)皮細胞、CD4+T淋巴細胞和神經(jīng)元細胞中，AKT能夠上調(diào)Notch1和Notch配體DLL4基因表達或提高Notch2轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控Notch1信號通路活性［20-22］。因此，課題組推測Notch/Hes1信號通路負向調(diào)控PTEN，促進PI3K/AKT/mTORC1信號途徑活化的同時，活化的AKT亦可正向調(diào)控Notch1活性，形成正反饋調(diào)節(jié)，從而促進IL-17A的致炎效應(yīng)。