DPPH·和ABTS+·比較研究毛建草多酚、黃酮和多糖的抗氧化協(xié)同作用

李慧卿，曹葉霞，黃坊嬌

（忻州師范學(xué)院 化學(xué)系，山西 忻州 034000）

毛建草屬于唇形科，是全草具有香味的多年生草本植物［1］，在山西北部廣泛分布。毛建草中含有豐富的的類多酚、類黃酮和多糖化合物［2-4］等，具有抗氧化、降血脂降膽固醇、抗衰老、抗腫瘤［5-9］等多種功能。隨著人們?nèi)找鎸Φ胤浇?jīng)濟(jì)作物的開發(fā)，毛建草被較大范圍人工種植，其中的抗氧化組分被分離提取，開發(fā)食品產(chǎn)品。本文就其含有的多酚類、黃酮類、多糖等主要抗氧化物質(zhì)為研究對象，通過其清除DPPH·和ABTS+·以探索這些共存的組分是否可以協(xié)同發(fā)揮作用。 DPPH·和ABTS+·常被用來研究食品、蔬菜、水果提取物質(zhì)的抗氧化性，但由于兩者不同的結(jié)構(gòu)及自由基消除機(jī)理的差別［10］，對于供試物的抗氧化能力得出的結(jié)論會有差別。對于協(xié)同作用的研究，目前有顯 著 差 異法［11］、Isobologram 分 析 法［12-13］、Hou-Talalay 中效原理［14］等等，其中Isobologram 更為研究者普遍認(rèn)同。 本研究擬通過比較DPPH·和ABTS+·方法研究其組分間的協(xié)同抗氧化作用，旨在為DPPH·和ABTS+·方法研究抗氧化協(xié)同作用提供方法依據(jù)，同時(shí)也為開發(fā)其混配產(chǎn)品提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

毛建草采摘于山西寧武，為自然風(fēng)干的全草；蘆丁BR，成都市科龍化工試劑廠；沒食子酸AR，福林酚試劑BR，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-2450 型紫外可見分光光度計(jì)：配有Thermo Insight 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器工廠；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抗氧化組分提取

（1） 多糖的提取

參考文獻(xiàn)方法［15］，取一定量粉碎、過80 目篩的毛建草粉末，以料液比1∶20 加入二次水，溫度80℃回流2 h。抽濾去茶渣，得深棕色濾液，3500 r·min-1離心5 min，取上清液，于70℃下旋蒸至原溶液體積的三分之一，使用體積比為4∶1 的氯仿/正丁醇混合溶液，振蕩10 min，離心，脫去蛋白。所得水相于70 ℃旋蒸去部分水，得到的多糖粗品溶液中加入一定量無水乙醇，于冰箱中過夜。過濾，無水乙醇洗滌，最后得到的固體于60 ℃下烘干，得到毛建草多糖。

（2） 多酚的提取

參考文獻(xiàn)方法［16］一定量過篩毛建草粉末，加入20 倍量的清水，在90 ℃下攪拌浸提15 min。趁熱過濾后，濾渣再浸提2 次；合并3 次濾液，加人等體積的氯仿攪拌萃取30 min，靜置分層后，取水相，加入3 倍量乙酸乙酯，抽提3 次，每次20 min。靜置分層，收集水相，濃縮至干，冷卻后冷凍干燥得粉狀產(chǎn)品。

（3） 黃酮的提取

稱一定量毛建草粉末，料液比1∶20 加入無水乙醇，超聲。功率280 W，溫度50 ℃，時(shí)間30 min?？刂茰囟仍谧笥?，超聲結(jié)束后，80 ℃回流提取2 h，抽濾，濾渣重復(fù)提取1 次，合并兩次濾液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40 ℃減壓下除去乙醇，真空干燥，得固體粉末。

1.3.2 多糖、多酚、黃酮含量測定

（1） 多糖含量測定

0.04 g·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取葡萄糖溶液0.0，0.1，0.3，0.6，0.9 mL 置10 mL 比色管中，補(bǔ)水2 mL，分別加入新配的6%的苯酚溶液1 mL，再分別及時(shí)加入濃硫酸5 mL，搖勻，靜置5 min，之后沸水浴加熱15 min，加熱結(jié)束后，冷水迅速冷卻。室溫放置20 min，最后在波長490 nm 測吸光度［17］。標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.011 7x+0.079 8，R2=0.995 4。提取多糖樣品代替葡萄糖用上述方法檢測。

（2） 多酚含量測定

配制0.1 g·L-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取沒食子酸溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL置于10 mL 比色管，加2.5 mL 蒸餾水和0.25 mL的福林酚試劑，靜置，加入0.75 mL（C=75 g·L-1）的碳酸鈉溶液，定容，水浴加熱（75℃，10 mim），765 nm 處 測 定 吸 光 度［18］。 回 歸 方 程 為：y=98.86x+0.066，R2=0.999 9。多酚樣品代替沒食子酸用上述方法檢測。

（3） 黃酮含量測定

配制0.2 g·L-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取蘆丁溶液0.0，1.0，3.0，6.0，9.0 mL 置于25 mL 比色管，分別加入5%的亞硝酸鈉1 mL，靜置5 min 后，再加入10%的硝酸鋁1 mL，搖勻，靜置5 min，最后加入1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液5 mL，30%的乙醇溶液定容，搖勻，靜置10 min。波長507 nm 處測定吸光度?；貧w方程：y=9.020 5x+0.013 4，R2=0.998 1。黃酮樣品代替蘆丁用上述方法檢測。

1.3.3 毛建草中各組分的抗氧化活性的研究

（1） 多酚、黃酮和多糖清除DPPH·自由基的效果

準(zhǔn)確稱取一定量的相應(yīng)固體產(chǎn)品配置溶液，分別量取不同體積的溶液于10 mL 的比色管中，各加入5 mL 的DPPH·自由基（濃度20 μmol·L-1）溶液，定容至刻度線，置于避光處40 min，在波長為525 nm 處測定吸光度A。另準(zhǔn)備干凈的10 mL的比色管，加入與上述相同濃度的提取液，定容至刻度線，在波長525 nm 處測定吸光度A1。取5 mL的DPPH·溶液于比色管，定容至刻度線，測定吸光度A0［19］。清 除率的計(jì) 算公式：

式中，A1與A分別為樣品及樣品加入DPPH·時(shí)的吸光度；A0為DPPH·溶液的吸光度。

（2） 多酚、黃酮和多糖清除ABTS+·自由基效果精確量取不同體積的提取液置于10 mL 的比色管中，加入4.9 mLABTS+·（濃度20 μmol·L-1）溶液，定容，水浴加熱（30 ℃），靜置10 min。在波長752 nm 下測吸光度。清除率計(jì)算使用公式（1）。

（3） 多酚、黃酮和多糖的協(xié)同抗氧化活性研究

采 用Isobologram 分 析 法［20］，根 據(jù) 單 組 分 的IC50值，分別按質(zhì)量濃度最接近整比的比例關(guān)系選擇2.5∶1、1∶1 和1∶2.5 三種復(fù)配比例混合液研究其對DPPH·和ABTS+·自由基的清除效果，根據(jù)擬合曲線求出IC50mix值，按照公式（2）計(jì)算IC50add值。

式中，IC50add—理論復(fù)配組的IC50值，IC50a—a 組分單獨(dú)作用時(shí)的IC50值；Pa，Pb—分別為a，b 在復(fù)配組分中占有的比例；R—a，b 兩組分單獨(dú)作用時(shí)IC50的比值，即R=IC50a/IC50b。如果IC50add＜IC50mix，說明各組分之間具有拮抗作用；如果IC50add＞IC50mix，說明具有協(xié)同作用。

按照公式（3）來計(jì)算相互作用的指數(shù)γ，評價(jià)復(fù)配組分間相互作用的強(qiáng)弱程度。γ=1 表明組分間具有相加作用；γ＞1 表明組分間具有拮抗作用，而且γ 值越大，拮抗作用就越強(qiáng)；γ＜1 表明組分間具有協(xié)同作用，而且γ 值越小，其協(xié)同作用就越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

將試驗(yàn)所得多酚、黃酮和多糖的IC50值及95%可信線作為橫坐標(biāo)，多酚、黃酮和多糖的IC50值及95%可信線作為縱坐標(biāo)，將IC50值連接成相加線，繪制出95%置信區(qū)與IC50值。如果復(fù)配體系的效應(yīng)點(diǎn)落于相加線及95%置信區(qū)內(nèi)，就表明該復(fù)配組合為相加作用；如果落于相加線左側(cè)，就表明該復(fù)配組合為協(xié)同作用；如果落于右側(cè)，就表明該復(fù)配組合為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛建草各組分的單抗氧化研究

2.1.1 毛建草各組分對DPPH·和ABTS+·自由基的清除效果

毛建草中多酚、黃酮、多糖分別對DPPH·自由基清除效應(yīng)見圖1A，隨著各組分的濃度的增加，對自由基清除效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，并在較高濃度呈現(xiàn)出減緩趨勢。擬合各曲線，得多酚、黃酮、多糖的IC50分別為0.280、0.311、0.764 mg·L-1，得出對DPPH·自由基的清除效應(yīng)：多酚＞黃酮＞多糖。

圖1 毛建草各組分對DPPH·（A）和ABTS+·（B）自由基的清除效應(yīng)Fig.1 Scavenging abilities of antioxidant components in D.rupestre on DPPH·（A）and ABTS+·（B）

各組分對ABTS+·自由基清除效應(yīng)見圖1B，清除趨勢與DPPH·類似，擬合得多酚、黃酮、多糖的IC50值依次為0.204、0.243、0.584 mg·L-1，清除效應(yīng)為多酚＞黃酮＞多糖。

比較對2 種自由基的清除效應(yīng)，各組分對ABTS+·的清除能力都明顯優(yōu)于DPPH·，如果毛建草組分的抗氧化性強(qiáng)弱依據(jù)為對自由基的清除百分?jǐn)?shù)，從ABTS+·得出的結(jié)論明顯強(qiáng)于從DPPH·得出的結(jié)論。清除自由基主要途徑是通過抗氧化劑轉(zhuǎn)移電子或轉(zhuǎn)移氫給自由基。電子轉(zhuǎn)移迅速，氫轉(zhuǎn)移較慢，需要一定的時(shí)間達(dá)到平衡［21］。ABTS+·既可以通過轉(zhuǎn)移電子也可通過氫轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)消除，DPPH·消除則主要是通過抗氧化劑轉(zhuǎn)移氫給自由基，只在強(qiáng)氫鍵溶劑如甲醇中電子轉(zhuǎn)移才會占主導(dǎo)地位［22］。即使在充分考慮了反應(yīng)時(shí)間的影響，忽略動力學(xué)因素，抗氧化組分也對ABTS+·表現(xiàn)出更強(qiáng)活性。而且兩親的ABTS+·的苯并噻唑結(jié)構(gòu)比DPPH·的疏水的芳環(huán)結(jié)構(gòu)更容易使之與多酚類物質(zhì)發(fā)生電子或氫轉(zhuǎn)移。而多酚與黃酮類對自由基的清除能力優(yōu)于多糖，則可能是多酚、黃酮類與自由基間的疏水作用或芳環(huán)間π-π 堆積作用，以及毛建草多酚或黃酮與自由基芳環(huán)更匹配的空間結(jié)構(gòu)［23-24］使然。

2.2 毛建草各組分之間的協(xié)同抗氧化研究

2.2.1 Isobologram 分析法分析復(fù)配液清除DPPH·自由基的能力

根據(jù)多酚、黃酮、多糖各組分的IC500.280、0.311、0.764 mg·L-1，分別按質(zhì)量濃度最接近整比的比例關(guān)系1∶1∶2.5，組分兩兩復(fù)配，其復(fù)配后清除DPPH·自由基的結(jié)果如表1～表3，擬合后的IC50mix值、IC50add值和γ 值如下表4。

表1 毛建草多酚與黃酮復(fù)配后清除DPPH·自由基的能力Table 1 DPPH·scavenging abilities of the mixture of polyphenols and flavonoids from D.rupestre

表2 毛建草黃酮與多糖復(fù)配后清除DPPH·自由基的能力Table 2 DPPH·scavenging abilities of the mixture of flavonoids and polysaccharides from D.rupestrece

表3 多酚與多糖復(fù)配后清除DPPH·自由基的能力Table 3 DPPH·scavenging abilities of the mixture of polyphenols and polysaccharides from D.rupestre

由表4 可見，不同比例的多酚與黃酮復(fù)配后對DPPH·清除率的IC50mix值均小于IC50add，表明復(fù)配組合之間存在協(xié)同抗氧化作用。同理，黃酮與多糖復(fù)配后，多酚與多糖復(fù)配后均有較好的協(xié)同抗氧化作用。多酚與黃酮按2.5∶1、1∶1、1∶2.5 復(fù)配后的相互作用指數(shù)γ 分別為0.909，0.850，0.954，黃酮與多糖復(fù)配后的γ 值分別為0.938，0.886，0.912，多酚與多糖復(fù)配后的γ 值分別為0.910，0.909，0.954，其γ 值均小于1，亦表明了各組分的復(fù)配組合間均存在協(xié)同抗氧化作用，在各組分復(fù)配比例為1∶1 時(shí)，γ 值達(dá)到最小，表明此時(shí)各組分的協(xié)同抗氧化效果最好，并且此時(shí)協(xié)同作用的強(qiáng)弱程度為多酚-黃酮＞黃酮-多糖＞多酚-多糖。

表4 毛建草各組分復(fù)配之后清除DPPH·自由基的IC50mix值、IC50add值和γ 值Table 4 IC50mix，IC50add and γ values of DPPH·scavenging by the mixture from D.rupestre

2.2.2 Isobologram 分析法分析各組分復(fù)配后清除ABTS+·自由基的能力

各組分兩兩復(fù)配后清除ABTS+·自由基擬合后 的IC50mix值、IC50add值 和γ 值 如 下 表5。由 表5 可知，不同比例的多酚與黃酮復(fù)配后對ABTS+·清除率的IC50mix值均小于IC50add，表明復(fù)配組合之間存在協(xié)同抗氧化作用。同理，黃酮與多糖復(fù)配后，多酚與多糖復(fù)配后均有明顯的協(xié)同作用。多酚與黃酮按2.5∶1、1∶1、1∶2.5 復(fù)配后的相互作用指數(shù)γ值均小于1，亦表明了各組分的復(fù)配組合間均存在協(xié)同抗氧化作用，在各組分復(fù)配比例為1∶1 時(shí)，γ 值達(dá)到最小，表明協(xié)同抗氧化效果最好，并且此時(shí)協(xié)同作用的強(qiáng)弱程度為多酚-黃酮＞黃酮-多糖≈多酚-多糖。

表5 毛建草各組分復(fù)配之后清除ABTS+·自由基的IC50mix值、IC50add值和γ 值Table 5 IC50mix，IC50add and γ values of ABTS+·scavenging by the mixture from D.rupestre

毛建草抗氧化組分復(fù)配對ABTS+·和DPPH·自由基的清除效果是一致的，多酚與黃酮復(fù)配后協(xié)同作用最佳。多酚與黃酮都具有芳環(huán)結(jié)構(gòu)，復(fù)配后，兩者間的相互作用譬如疏水作用和芳環(huán)的π堆積，可能使它們與存在相類結(jié)構(gòu)的自由基間的電子或氫轉(zhuǎn)移更易實(shí)現(xiàn)。而多糖與之復(fù)配，也存在協(xié)同，但相應(yīng)效果弱些。比較多酚與黃酮相同比例復(fù)配的各γ 值，ABTS+·并沒有表現(xiàn)出比DPPH·更明顯的協(xié)同效應(yīng)（γ 偏離1）。

2.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組分復(fù)配之后對DPPH·和ABTS+·自由基的清除效果

圖2A～C 為黃酮-多酚、黃酮-多糖、多酚-多糖清除DPPH·自由基按相應(yīng)的效果圖。各比例復(fù)配后的效應(yīng)點(diǎn)均在置信區(qū)間和相加線的下方，表明復(fù)配組分間都存在協(xié)同抗氧化作用，并且效應(yīng)點(diǎn)距離相加線的距離為1∶1 最大，顯示該比例下協(xié)同效應(yīng)更強(qiáng)。 圖3A～C 是相應(yīng)復(fù)配后清除ABTS+·自由基效果圖，結(jié)論與清除DPPH·一致。ABTS+·并沒有表現(xiàn)出比DPPH·更明顯的優(yōu)勢。

圖2 毛建草復(fù)配組分清除DPPH·自由基的Isobologram 分析Fig.2 Isobologram analysis of DPPH·scavenging by the mixture from D.rupestre

圖3 毛建草復(fù)配組分清除ABTS+·自由基的Isobologram 分析Fig.3 Isobologram analysis of ABTS+·scavenging by the mixture from D.rupestre

Isobologram 分析圖比數(shù)據(jù)更直觀地表明抗氧化組分間明顯的協(xié)同性。但在實(shí)驗(yàn)條件下，改變組分比例，協(xié)同差異性變化不突出。推測來自黃酮（多酚或多糖）成分多樣化，沒有哪種成分含量突出或存在某種突出的協(xié)同反應(yīng)優(yōu)勢。這一方面的探討需要進(jìn)一步分離純化產(chǎn)品以進(jìn)行分析。

3 討論

多酚、黃酮、多糖為植物組分中抗氧化物質(zhì)，都有清除體內(nèi)自由基、抗氧化、抗衰老的功效。毛建草中3 種組分對2 種自由基DPPH·和ABTS+·都有明顯的清除效應(yīng)，IC50都比較小，但多酚和黃酮對兩種自由基的清除作用明顯優(yōu)于多糖。比較ABTS+·法和DPPH·法，從ABTS+·得出的組分的抗氧化性明顯優(yōu)于從DPPH·得出的結(jié)論。這與ABTS+·兩親的結(jié)構(gòu)及既可以通過轉(zhuǎn)移電子也可通過氫轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)自由基消除有關(guān)，而DPPH·消除則主要是通過抗氧化劑轉(zhuǎn)移氫給自由基。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了一種區(qū)別抗氧化劑抗氧化性的優(yōu)選方法，采用ABTS+·效果會更明顯。

組分復(fù)配時(shí)，無論是用ABTS+·還是DPPH·，相互作用指數(shù)γ 均偏離1，可以得出組分間存在協(xié)同作用。但當(dāng)組分復(fù)配清除自由基時(shí)，雖然每種復(fù)配組分對ABTS+·的清除效應(yīng)仍然優(yōu)于對DPPH·的清除，但由于相互作用指數(shù)γ 涉及到各組分混合時(shí)的和單組分時(shí)的IC50的比值（公式3），混配時(shí)，ABTS+·相對于DPPH·的優(yōu)勢并不明顯，用ABTS+·反映出來的γ 值并沒有更偏離1，從而得出更強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。這應(yīng)該和分析協(xié)同作用采用的Isobologram 方法有關(guān)，后續(xù)可以探討多種協(xié)同作用分析方法比較，從而進(jìn)一步識別結(jié)論的適用性。

多酚、黃酮、多糖作為植物組分中抗氧化物質(zhì)，共存于植物體內(nèi)，是獨(dú)立地發(fā)揮作用，還是協(xié)同增效，不僅對于探討植物生物功能具有重要的意義，也為開發(fā)利用天然植物的產(chǎn)品有指導(dǎo)意義。如毛建草多酚、黃酮類可以提取用以化妝品、食品添加成分開發(fā)新功能。并且可以多種組分配伍使用，協(xié)同增效，使產(chǎn)品具有應(yīng)用優(yōu)勢。而對ABTS+·、DPPH·自由基清除的差異性，則對研究體外抗氧化性及協(xié)同抗氧化性具有參考意義。

4 結(jié)論

毛建草中的3 種主要組分多酚、黃酮、多糖對自由基ABTS+·、DPPH·都有顯著的清除作用，清除能力兩者得出的結(jié)論一致，都為多酚＞黃酮＞多糖，但采用ABTS+·自由基，提取成分的抗氧化性更突出。通過Isobologram 分析法、統(tǒng)計(jì)方法分析研究3 種組分兩兩復(fù)配后對2 種自由基的清除的協(xié)同效應(yīng)，結(jié)果顯示在對ABTS+·和DPPH·清除過程中，組分兩兩間都體現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，且當(dāng)各組分復(fù)配比例為1∶1 時(shí)，協(xié)同效應(yīng)最強(qiáng)。協(xié)同效應(yīng)方面，采用ABTS+·沒有比DPPH·表現(xiàn)出更明顯協(xié)同作用。DPPH·和ABTS+·比較為研究組分抗氧化或協(xié)同抗氧化提供了方法依據(jù)，復(fù)配產(chǎn)品的協(xié)同作用則為混配毛建草組分開發(fā)產(chǎn)品提供了相應(yīng)的理論參考。