綠肥油菜復(fù)種棉花對(duì)土壤細(xì)菌和團(tuán)聚體的影響

董章輝，王虎，張艷麗，趙麗芬，眭書祥，李增書，高馳，朱青竹

（石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北石家莊 050041）

土壤是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)，土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著非常重要的作用。土壤微生物不僅參與土壤中養(yǎng)分的分解、轉(zhuǎn)化和循環(huán)，而且影響土壤結(jié)構(gòu)、土壤肥力和植物健康，對(duì)維持土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)和功能正常至關(guān)重要［1-2］。近年來，大量施用化肥對(duì)我國土壤質(zhì)量和生態(tài)造成嚴(yán)重影響，使土壤微生物多樣性和菌群數(shù)量下降，土壤容重增加，土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性受到影響［3］。

綠肥是重要的有機(jī)肥，不僅可以提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，改善土壤理化性質(zhì)，而且可以提高土壤微生物種群數(shù)量和活性，改善土壤微生物種群結(jié)構(gòu)。祖韋軍等［4］研究了耕作深度和不同綠肥對(duì)植煙土壤微生物功能多樣性和酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光葉紫花苕、黑麥草和油菜作綠肥均能提高土壤微生物功能多樣性及土壤酶活性，且光葉紫花苕深耕表現(xiàn)最好。趙冬雪等［5］研究了套作綠肥對(duì)植煙土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)及功能多樣性的影響，表明套作綠肥改變了微生物菌群結(jié)構(gòu)，提高了菌群多樣性，增強(qiáng)了微生物碳源應(yīng)用能力。周德平等［6］研究表明綠肥油菜還田量與土壤細(xì)菌數(shù)量和下茬水稻產(chǎn)量呈高度正相關(guān)。Muhammad 等［7］研究表明，大麥和光葉紫花苕綠肥可以有效提高土壤中細(xì)菌和真菌的種類和數(shù)量。宋佳等［8］研究表明冬種綠肥和秸稈還田可以提高土壤中大團(tuán)聚體、超大團(tuán)聚體和有機(jī)碳的含量，提升土壤團(tuán)聚體和有機(jī)質(zhì)的穩(wěn)定性。袁苗苗等［9］利用9 個(gè)不同油菜品種研究了油菜壓青對(duì)土壤團(tuán)聚體及腐殖質(zhì)結(jié)合形態(tài)的影響，結(jié)果表明綠肥油菜可以提高土壤大團(tuán)聚體含量、土壤松緊比和松穩(wěn)比，提高土壤各結(jié)合形態(tài)腐殖質(zhì)含量及團(tuán)聚體對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)的貢獻(xiàn)率。土壤微生物與土壤團(tuán)聚體相互作用，密切相關(guān)，土壤微生物是土壤團(tuán)聚體形成和穩(wěn)定的重要影響因素，土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)直接影響土壤肥、水、熱、氣和土壤養(yǎng)分，進(jìn)而影響土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)［10-12］。

油菜作為綠肥生物量大，肥效好，而且生育期短，與早熟棉可以直播復(fù)種，栽培管理簡單，經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益顯著。近年來，綠肥油菜與棉花復(fù)種的栽培模式已有應(yīng)用，然而其對(duì)土壤微生物菌群組成及土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)的影響研究較少。本研究連續(xù)3 年綠肥油菜壓青后復(fù)種棉花，分析了該復(fù)種模式對(duì)土壤細(xì)菌菌群組成、多樣性和功能的影響及對(duì)土壤團(tuán)聚結(jié)構(gòu)的改良效果，以期為該復(fù)種模式對(duì)土壤改良效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地情況

試驗(yàn)地點(diǎn)位于河北省邯鄲市曲周縣西漳頭村（東經(jīng)115o1'2''，北緯36o47'23''），供試土壤質(zhì)地為黏土，地勢(shì)平坦、地力中等、肥力均勻。土壤基本理化性狀為：有機(jī)質(zhì)含量17.73 g·kg-1，全氮含量1.19 g·kg-1，堿解氮含量66.33 mg·kg-1，有效磷含量24.42 mg·kg-1，速效鉀含量362.33 mg·kg-1，pH值8.17，電導(dǎo)率235 μS·cm-1。

1.2 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

油菜品種選用灃油958，為甘藍(lán)型油菜品種；棉花品種選用早熟棉品種冀石929。2018-2020年，連續(xù)3 年在曲周縣西漳頭村試驗(yàn)基地開展綠肥油菜與棉花復(fù)種試驗(yàn)，油菜壓青后復(fù)種棉花，同時(shí)設(shè)置單作棉花為對(duì)照。2020 年開展田間區(qū)組對(duì)比試驗(yàn)，設(shè)油菜壓青（YQ）和對(duì)照（CK）2 個(gè)處理，3 次重復(fù)，小區(qū)面積為222.2 m2。油菜壓青處理：綠肥油 菜 在3 月5 日 播 種，播種量 為9 kg·hm-2，5 月15日壓青，翻壓深度25 cm 以上，5 月25 日播種棉花，密度為90 000 株·hm-2，不蓋地膜；對(duì)照：單作棉花，不種綠肥油菜。各小區(qū)在棉花播種前施入45%復(fù)合肥（15-15-15 N-P2O5-K2O）作為底肥，施用量為150 kg·hm-2。

1.3 土壤微生物測(cè)定和分析

2020 年第3 年綠肥油菜與棉花復(fù)種試驗(yàn)期間，油菜壓青60 d 后在YQ 和CK 處理的每小區(qū)15 cm耕作層，利用三點(diǎn)取樣法取土樣。土樣委托北京百邁克公司提取樣品總DNA，基于細(xì)菌16S rDNA 進(jìn)行高通量測(cè)序，每個(gè)土樣檢測(cè)1 次，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

從原始數(shù)據(jù)中導(dǎo)出測(cè)序序列，使用Limav1.7.0 軟件進(jìn)行識(shí)別、過濾，使用UCHIME v4.2 軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到有效序列；使用Usearch 軟件［13］在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得基本分類單元（OTU），并基于Silva 分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU 進(jìn)行分類學(xué)注釋。在門、綱、目、科、屬、種各分類水平上進(jìn)行分類，統(tǒng)計(jì)比較各等級(jí)的物種類型數(shù)目。以測(cè)序序列數(shù)與OTU 物種數(shù)構(gòu)建稀釋性曲線［14］，利用Mothur 軟件和R 語言工具依據(jù)各樣品的測(cè)序量在不同測(cè)序深度的Shannon 指數(shù)（反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)）繪制Shannon 多樣性指數(shù)稀釋曲線。將OTU 序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的物種分類信息，在門、綱、目、科、屬、種各分類水平上的不同物種進(jìn)行相對(duì)豐度分析。通過Bug-Base 表型分析［15］，在門水平上對(duì)樣品土壤中好氧性、厭氧性、兼性厭氧性、革蘭氏陰性、革蘭氏陽性、致病性、生物膜形成、脅迫耐受性和移動(dòng)元件等表型的物種相對(duì)豐度進(jìn)行分析。

1.4 土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)測(cè)定與分析

2020 年第3 年綠肥油菜與棉花復(fù)種試驗(yàn)期間，選取油菜壓青后30 d 和60 d，在壓青和不壓青處理的每個(gè)小區(qū)利用三點(diǎn)取樣法取15 cm 耕作層土樣，利用濕篩法測(cè)量土壤水穩(wěn)性團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)［16］。測(cè)定0.5～2 mm 和0.25～0.5 mm 大 團(tuán)聚體，0.053～0.25 mm 小團(tuán)聚體和小于0.053 mm 黏粒等4 個(gè)粒級(jí)的質(zhì)量百分含量，計(jì)算土壤團(tuán)聚體平均質(zhì)量直徑（MWD），公式如下：

式中，Xi表示第i 個(gè)粒徑團(tuán)聚體的平均直徑/mm，Wi表示第i 個(gè)粒徑團(tuán)聚體的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)/%。

所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜壓青對(duì)土壤細(xì)菌菌群多樣性的影響

油菜壓青和不壓青地塊分別取土樣提取DNA，基于16S rDNA 進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序后共得到78 048 條有效序列，其中對(duì)照土樣39 027條，壓青土樣39 021 條。使用Usearch 軟件，將有效序列在97%相似度水平下與數(shù)據(jù)庫比對(duì)，進(jìn)行聚類，劃分OTU。結(jié)果，對(duì)照土壤中共得到1583個(gè)OTU，油菜壓青土壤比對(duì)照中減少50 個(gè)OTU，同時(shí)增加92 個(gè)新的OTU，達(dá)到1625 個(gè)。壓青處理和對(duì)照土壤中共同擁有的OTU 為1533個(gè)（圖1）。

圖1 壓青和不壓青土壤中細(xì)菌種群OTU 物種多樣性分布Fig.1 The distribution of OTU diversity in the treatments with（YQ）/without（CK）rapeseed as green manure

以測(cè)序序列數(shù)與OTU 物種數(shù)來構(gòu)建稀釋性曲線，驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性。利用Mothur 軟件和R 語言工具依據(jù)各樣品的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的Shannon 指數(shù)繪制Shannon 多樣性指數(shù)稀釋曲線，以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。結(jié)果如圖2 所示：隨著測(cè)序數(shù)的加大稀釋性曲線趨于平緩，表示此環(huán)境中的物種并不會(huì)隨測(cè)序數(shù)量的增加而顯著增多，表明測(cè)序序列數(shù)充分，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；Shannon 指數(shù)曲線趨向平坦后，油菜壓青樣品Shannon 指數(shù)高于對(duì)照，說明油菜壓青增加了土壤中細(xì)菌物種的多樣性。

圖2 壓青和不壓青細(xì)菌OTU 稀釋性曲線和Shannon 指數(shù)曲線Fig.2 Soil bacteria OUT dilution curve and Shannon index curve of the YQ and CK treatments

基于OTU 分析結(jié)果對(duì)樣品在門、綱、目、科、屬、種各分類水平上統(tǒng)計(jì)比較各等級(jí)的物種類型數(shù)目。由表1 可以看出，油菜壓青后細(xì)菌在門、綱、目和科分類水平上細(xì)菌物種類型數(shù)目稍有減少，但差異不明顯；屬和種水平上細(xì)菌物種類型數(shù)目增多，且差異達(dá)到顯著水平。

表1 壓青和不壓青土壤中細(xì)菌各等級(jí)物種OTU 數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 1 The OTU number of per level species in the treatments of YQ and CK

2.2 油菜壓青對(duì)土壤細(xì)菌菌群組成影響分析

將OTU 序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)OTU 對(duì)應(yīng)的物種分類信息。對(duì)油菜壓青和不壓青土壤在門、綱、目、科、屬、種各分類水平上，對(duì)細(xì)菌不同物種進(jìn)行相對(duì)豐度分析、比較，并對(duì)相對(duì)豐度前10 的物種菌群繪制相對(duì)豐度分布柱狀圖。由圖3 可以看出，在門水平上，相對(duì)豐度前10 的優(yōu)勢(shì)菌群在對(duì)照和壓青土壤中分別達(dá)到80.0%和82.2%，其中變形菌門（Proteobacteria）、Acidobacteriota 門和擬桿菌門（Bacteroidota）為優(yōu)勢(shì)菌群，油菜壓青后Acidobacteriota 門相對(duì)豐度顯著降低，放線菌門（Actinobacteriota），藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）相對(duì)豐度顯著升高；在綱分類水平上，相對(duì)豐度前10 的優(yōu)勢(shì)菌群在對(duì)照和壓青土壤中分別達(dá)到69.0%和70.1%，其中γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）和Vicinamibacteria 綱為優(yōu)勢(shì)菌群，油菜壓青后Vicinamibacteria 綱相對(duì)豐度顯著降低，浮霉菌綱（Planctomycetes）相對(duì)豐度顯著升高；在目水平上，相對(duì)豐度前10 的優(yōu)勢(shì)菌群在對(duì)照和壓青土壤中分別達(dá)到52.8%和50.3%，其中Burkholderiales、Vicinamibacterales 和Chitinophagales 為 優(yōu) 勢(shì) 菌 群，油 菜壓青后Vicinamibacterales 相對(duì)豐度由12.3%降低為8.5%，顯著降低；在科水平上，相對(duì)豐度前10 的優(yōu)勢(shì)菌群在對(duì)照和壓青土壤中分別達(dá)到37.8%和35.8%，Vicinamibacteraceae 和 Chitinophagaceae為優(yōu)勢(shì)菌群，其中Vicinamibacteraceae 相對(duì)豐度最高，且壓青后顯著降低；在屬和種水平上，相對(duì)豐度最高的菌群分別為Vicinamibacter和Vicinamibacter_silvestris，且壓青后均顯著降低。

圖3 壓青和不壓青土壤細(xì)菌各分類水平菌群物種相對(duì)豐度分布Fig.3 The relative abundances of each species of the bacterial community in YQ and CK treatments

2.3 油菜壓青后門水平細(xì)菌功能分析

通過BugBase 功能分析，在門水平上對(duì)壓青和不壓青土壤中好氧性、厭氧性、兼性厭氧性、革蘭氏陰性、革蘭氏陽性、致病性、生物膜形成、脅迫耐受性和移動(dòng)元件等表型的物種相對(duì)豐度進(jìn)行分析。由圖4 可以看出，好氧性、革蘭氏陽性、脅迫耐受性和移動(dòng)原件表型的物種豐度明顯提高，厭氧性和致病性表型物種豐度降低。其中，壓青后好氧性表型的浮霉菌門（Planctomycetes）和變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度提高；革蘭氏陽性表型的放線菌門（Actinobacteriota）豐度顯著升高；厭氧性表型和致病性表型的酸桿菌門（Acidobacteria）相對(duì)豐度顯著降低。

圖4 壓青和不壓青土壤細(xì)菌門水平BugBase 功能分析Fig.4 BugBase function analysis at phylum level for YQ and CK

2.4 土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)分析

團(tuán)聚體是土壤結(jié)構(gòu)的基本單元，是土壤肥力和作物產(chǎn)量的主要影響因素，在調(diào)節(jié)土壤保水性和通氣性，維持土壤肥力，減緩?fù)寥狼治g等方面起重要作用［17］。連續(xù)3 年綠肥油菜壓青后，我們?cè)?020 年油菜壓青30 d 和60 d 取15 cm 耕作層土樣用濕篩法測(cè)量土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)，同時(shí)以不壓青土樣作為對(duì)照。結(jié)果顯示（表2）：油菜壓青后，大團(tuán)聚體質(zhì)量百分含量提高，其中0.5～2 mm 粒級(jí)大團(tuán)聚體在壓青30 d 和60 d 提高均達(dá)到顯著水平，0.25～0.5 mm 粒級(jí)大團(tuán)聚體在壓青30 d 提高達(dá)到顯著水平；壓青后，0.053～0.25 mm 粒級(jí)微團(tuán)聚體質(zhì)量百分含量降低，在壓青30 天和60 天均達(dá)到顯著水平；＜0.053 mm 粒級(jí)黏粒質(zhì)量百分含量稍有降低，但沒有達(dá)到顯著水平。另外，與對(duì)照相比土壤團(tuán)聚體平均質(zhì)量直徑在油菜壓青后有明顯提高，且30 d 和60 d 均達(dá)到顯著水平。這說明油菜壓青有利于土壤中小團(tuán)聚體向大團(tuán)聚體轉(zhuǎn)化，提高土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性，改善土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)。

表2 油菜壓青對(duì)土壤團(tuán)聚體質(zhì)量百分含量和平均質(zhì)量直徑的影響Table 2 The analysis of the difference of mass percentage of soil aggregates and mean weight diameter between YQ and CK

3 討論

農(nóng)業(yè)田間管理對(duì)土壤微生物有較大影響，施肥方式、耕作深度、作物輪作、和翻壓綠肥等都會(huì)影響土壤微生物特性。綠肥還田為微生物提供了充足的碳源，創(chuàng)造了一個(gè)營養(yǎng)充足的土壤生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)更多的微生物生長。已有研究表明翻壓綠肥有利于提高土壤細(xì)菌菌群多樣性，改變其相對(duì)豐度分布［5-6］，本研究進(jìn)一步表明綠肥油菜與棉花復(fù)種栽培模式也可以有效提高土壤中細(xì)菌物種的多樣性，在門、綱、目、科、屬、種各個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)、比較物種多樣性，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)油菜壓青使細(xì)菌多樣性在屬和種水平有更明顯提高。土壤微生物多樣性參與著土壤生態(tài)系統(tǒng)的互作，在營養(yǎng)物質(zhì)分解，流動(dòng)和循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用，土壤中高水平的微生物多樣性有利于土壤質(zhì)量的提高［18-19］。另外，本研究分析了細(xì)菌不同分類水平上的優(yōu)勢(shì)菌群，發(fā)現(xiàn)在門水平上以變形菌門（Proteobacteria）、Acidobacteriota 門 和 擬 桿 菌 門（Bacteroidota）為優(yōu)勢(shì)菌群，在綱水平上以變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）和Vicinamibacteria 綱為優(yōu)勢(shì)菌群，這與以往的研究基本一致［20-21］。另外，呂桌呈等［21］研究表明綠肥處理，可以使土壤中變形菌門相對(duì)豐度提高；李文廣等［20］報(bào)導(dǎo)飼料油菜翻壓還田土壤疣微菌門和變形菌門相對(duì)豐度提高。本研究油菜壓青后土壤中疣微菌門（Verrucomicrobiota）和變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度也均有一定程度的提高，這與前人研究結(jié)果相一致。我們對(duì)油菜壓青后門水平細(xì)菌功能進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)好氧型細(xì)菌豐度升高，厭氧型細(xì)菌豐度降低，這可能是因?yàn)橛筒藟呵喔纳屏送寥澜Y(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了土壤透氣性，促進(jìn)了好氧型細(xì)菌的增長；另外，壓青后致病性細(xì)菌豐度的降低，有利于降低植物細(xì)菌性病害。

作為土壤結(jié)構(gòu)的基本單元，土壤團(tuán)聚體對(duì)土壤肥力、土壤通氣性、土壤微生物、作物產(chǎn)量以及土壤的可持續(xù)利用有重要影響。較多研究表明綠肥壓青有利于土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)的改善：袁苗苗等［9］研究表明油菜壓青可以提高土壤大團(tuán)聚體含量和團(tuán)聚體對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)的貢獻(xiàn)率，有利于土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性；張欽等［22］研究表明連續(xù)種植綠肥提高了土壤大團(tuán)聚體的含量和土壤團(tuán)聚體平均質(zhì)量直徑。本研究中油菜壓青后復(fù)種棉花，發(fā)現(xiàn)大團(tuán)聚體質(zhì)量百分含量顯著提高，微團(tuán)聚體質(zhì)量百分含量降低，且土壤團(tuán)聚體平均質(zhì)量直徑顯著提高，這與之前的研究相一致。這說明綠肥油菜與棉花的復(fù)種模式改變了土壤團(tuán)聚體粒級(jí)分布，促進(jìn)土壤微團(tuán)聚體向大團(tuán)聚體的轉(zhuǎn)化，提高了土壤團(tuán)聚體平均質(zhì)量直徑。土壤團(tuán)聚體平均質(zhì)量直徑值越大，表明土壤團(tuán)聚體的團(tuán)聚度越高，團(tuán)聚體的穩(wěn)定性越好［23-24］，而土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性的提高可以減少土壤養(yǎng)分流失，增強(qiáng)土壤結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和抗侵蝕性［22］。

本研究通過翻壓綠肥油菜，同時(shí)提高土壤細(xì)菌物種多樣性和土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。已有研究表明土壤微生物與土壤團(tuán)聚體有明顯相關(guān)性：李景等［25］研究表明土壤細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)與土壤團(tuán)聚體平均質(zhì)量直徑顯著相關(guān)；蔣雪洋等［26］研究發(fā)現(xiàn)土壤團(tuán)聚體平均質(zhì)量直徑與土壤真菌和叢枝菌根真菌豐度極顯著正相關(guān)，與古細(xì)菌豐度顯著正相關(guān)。土壤團(tuán)聚體是土壤微生物生存活動(dòng)的場(chǎng)所，土壤微生物是土壤團(tuán)聚體形成的重要影響因素［26-27］，土壤微生物與土壤團(tuán)聚體相互作用，相互影響。土壤大團(tuán)聚體和超大團(tuán)聚體含量提高，改善了土壤結(jié)構(gòu)，增加了土壤通氣性，改善了土壤微生態(tài)環(huán)境，有利于土壤微生物活動(dòng)繁衍；土壤微生物代謝產(chǎn)物、生物量碳和微生物菌絲促進(jìn)土壤大團(tuán)聚體形成［28］。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)分析了綠肥油菜壓青對(duì)土壤細(xì)菌菌群組成和土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，油菜壓青顯著提高了土壤中細(xì)菌菌群的多樣性，在不同分類水平上改變了優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度分布，降低了厭氧性和致病性表型菌群相對(duì)豐度，改善了土壤細(xì)菌微生物環(huán)境；另外，綠肥油菜壓青促進(jìn)了土壤微團(tuán)聚體向大團(tuán)聚體的轉(zhuǎn)化，提高了土壤團(tuán)聚體平均質(zhì)量直徑，改善了土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。