化痰祛濕活血方對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞焦亡形態(tài)的影響

劉鳴昊, 劉素彤, 尚東方, 張麗慧, 顧亞嬌, 趙文霞

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽科， 鄭州 450000

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)進展為肝硬化、肝衰竭等終末期肝病的重要環(huán)節(jié)[1]，也是臨床干預(yù)的關(guān)鍵節(jié)點。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)肝臟Kupffer細胞焦亡，放大炎癥反應(yīng)，參與NASH的發(fā)生和進展，此過程類似于“痰濕瘀濁”在肝臟的形成和沉積。有學(xué)者[3]認為細胞焦亡可能是中醫(yī)理論中痰濁、瘀血的一種微觀體現(xiàn)。中藥治療具有多靶點的特點，在NASH的治療中具有一定的優(yōu)勢。化痰祛濕活血方是第二批全國名老中醫(yī)趙文霞教授根據(jù)NASH“痰濕內(nèi)停、瘀血阻絡(luò)、肝失條達”的主要病機而創(chuàng)立的，以澤瀉、丹參、郁金、海藻、決明子、山楂、水飛薊、柴胡組方。方中澤瀉利水滲濕、行氣消瘀為君藥；丹參活血化瘀、涼血安神，郁金活血止痛、行氣解郁，海藻化痰利濕、軟堅消痰，共為臣藥；決明子清肝明目，山楂消積散瘀，水飛薊清熱解毒，共為佐藥；柴胡疏肝理氣為使藥，全方共奏化痰祛濕活血之功效。臨床應(yīng)用效果良好。課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，化痰祛濕活血方可通過抑制肝組織損傷，減輕炎癥反應(yīng)，但其機制尚不完全清晰。據(jù)此本研究將以LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞焦亡，化痰祛濕活血方含藥血清干預(yù)后，采用掃描電鏡觀察細胞焦亡“金指標(biāo)”細胞膜變化，及免疫熒光觀察參與巨噬細胞焦亡發(fā)生相關(guān)的GSDMD-N含量及定位，以此揭示化痰祛濕活血方的部分療效機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥物 SD雄性大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量(150±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物合格證號: 11400700116588; 生產(chǎn)許可證號: SXYK(豫)2015-0005；實驗單位動物使用許可證：SXYK(豫)2017-0001。化痰祛濕活血方顆粒劑: 澤瀉(批號15120135)、丹參(批號15060138)、海藻(批號15070027)、郁金(批號15060128)、決明子(批號15090036)、山楂(批號15060020)、柴胡(批號15070208)、水飛薊(批號15070223)，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供。多烯磷脂酰膽堿膠囊 (易善復(fù)): 賽諾菲(北京) 制藥有限公司(批號5JD070)。

1.2 主要試劑與儀器 臨界點干燥儀(Quorum，k850),離子濺射儀(HITACHI，MC1000),掃描電子顯微鏡(HITACHI，SU8100),電鏡固定液(Servicebio，G1102)抗熒光衰減封片劑(solarbio，S2110)，曲拉通Triton X-100(T8200)，DAPI溶液(索拉寶，C0065)，山羊血清(S9070，索拉寶)，4%組織細胞固定液(P1110，索拉寶)，GSDMD-N抗體(affinity，DF12275)

1.3 含藥血清制備 (1)中藥溶液配制：將化痰祛濕活血方散裝顆粒溶于適量雙蒸水中，混勻后100 ℃水浴鍋中煮5 min，自然冷卻至室溫，4 ℃保存?zhèn)溆谩?2)多烯磷脂酰膽堿膠囊溶液配制：將膠囊去殼，藥物溶于適量雙蒸水中混勻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?3)分組和給藥：將60只SD大鼠隨機分為中藥組、西藥組、空白組。根據(jù)人與動物等效藥量體質(zhì)量換算方法,B種動物的劑量(mg/kg)=W×A種動物的劑量(mg/kg)，W為等效系數(shù)。計算得知大鼠化痰祛濕活血方的等效劑量為1.26 g/100 g體質(zhì)量，化痰祛濕活血方的給藥劑量為等效劑量(相當(dāng)于臨床成人用量的10倍)。中藥組：灌服化痰祛濕活血方顆粒溶液(以純水配成2.52 g/mL，灌服劑量為1 mL/100 g)。西藥組：灌服多烯磷脂酰膽堿混懸液(濃度0.028 5 g/mL)?？瞻捉M：灌服去離子水，1 mL/100 g體質(zhì)量。2 次/d(上午9點及下午5點)，連續(xù)3 d。最后1次灌胃結(jié)束后1 h，采用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射(0.2 mL/100 g體質(zhì)量)麻醉大鼠，穿刺腹主動脈采血，離心后取上清液滅活，采用0.22 μm濾膜過濾后分裝儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 細胞培養(yǎng)與分組 (1)將生長良好的RAW264.7細胞分為6組，分別為空白組、模型組及化痰祛濕活血方高劑量組、中劑量組、低劑量組、對照組。(2)空白組給予含10%空白組血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組給予含LPS(5 μg/mL)的10%空白組血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，高、中、低劑量組在模型組的基礎(chǔ)上分別給予相應(yīng)濃度的10%含藥血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，對照組在模型組的基礎(chǔ)上給予相應(yīng)濃度的10%多烯磷脂酰膽堿含藥血清，分別培養(yǎng)24 h和48 h后備檢。

1.5 掃描電子顯微鏡觀察各組巨噬細胞形態(tài) 將貼壁于蓋玻片的細胞培養(yǎng)處理完成后棄培養(yǎng)基，用PBS漂洗后，加電鏡固定液2 h，再轉(zhuǎn)移至4 ℃保存。固定好的樣品經(jīng)0.1 mol/L磷酸緩沖液PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。再將樣本放入臨界干燥儀內(nèi)干燥，然后緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面上放入離子濺射儀樣品臺上進行噴金30 s，掃描電鏡觀察。

1.6 免疫熒光染色觀察巨噬細胞焦亡相關(guān)蛋白含量及定位 六孔板中棄原培養(yǎng)液；PBS洗滌 2 次；0.25% TritonX-100 ，室溫放置10 min；PBS洗滌2次，每次3 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫放置20 min；PBS洗滌2次，每次3 min；滴加一抗500 μL(抗體濃度按產(chǎn)品說明劑量配制)，放于4 ℃冰箱過夜或37 ℃孵育箱內(nèi)2 h；PBS洗滌2次，每次3 min；滴加二抗500 μL(抗體濃度按產(chǎn)品說明劑量配制)，37 ℃孵育箱內(nèi)40 min；PBS洗滌2次，每次3 min；染核，500 μL(抗體濃度按產(chǎn)品說明劑量配制)，37 ℃孵育箱內(nèi)15 min；PBS洗滌2次，每次3 min；封片后顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 化痰祛濕活血方對LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞焦亡形態(tài)的影響 在掃描電鏡低倍和高倍觀察下發(fā)現(xiàn)LPS促進了巨噬細胞表面的球狀突起和膜孔的形成(圖1)?？瞻捉M細胞形態(tài)呈圓形，無腫脹，包膜表面光滑，無凸起，無皺褶和孔隙;模型組細胞表現(xiàn)形態(tài)偏圓或橢圓，細胞腫脹膨大，表面有許多氣泡狀突出物，大量皺褶和突起，并伸出較長偽足,細胞膜上有孔隙形成，這些變化與焦亡形態(tài)特征相符合;對照組細胞腫脹不明顯，但表面許多氣泡狀突出物，偽足明顯,細胞膜上孔隙較模型組減少;高劑量組細胞形態(tài)無腫脹接近空白組，但表面粗糙有偽足，細胞膜上未見明顯孔隙;低劑量和中劑量組細胞形態(tài)橢圓或圓形，腫脹，細胞膜表面粗糙有孔隙，有偽足伸出。

2.2 化痰祛濕活血方對LSP誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)GSDMD-N水平的影響 與空白組相比模型組 GSDMD-N陽性染色強度明顯增加，對照組與中藥高劑量組相較模型組GSDMD-N陽性染色強度均有減弱(圖2)。

圖1 電鏡下巨噬細胞形態(tài)變化(低倍，×1500；高倍，×6000)Figure 1 Morphological changes of macrophages under electron microscopy (low fold, ×1500; High fold, ×6000)

注：藍色代表PI染色結(jié)果；綠色代表 GSDMD-N染色結(jié)果。

3 討論

Kupffer細胞與NASH致病關(guān)系密切，LPS誘導(dǎo)Kupffer細胞發(fā)生細胞焦亡,分泌IL-1β和IL-18誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)是NASH的形成機制之一。研究[5]發(fā)現(xiàn)NAFLD患者由于飲食結(jié)構(gòu)紊亂等因素，腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、腸球菌、腸桿菌等菌落數(shù)發(fā)生了明顯的改變，腸源性LPS水平增高，腸壁通透性增加，LPS通過腸道-門靜脈-肝臟的“腸-肝軸”循環(huán)影響肝臟，這可能是導(dǎo)致NAFLD向NASH發(fā)展的原因之一。LBP結(jié)合LPS進入細胞內(nèi)。進入到細胞內(nèi)的LPS可直接活化Caspase-11(小鼠亞型，在人身上與 Caspase-11 同源的是 Caspase-4,5)，剪切 GSDMD 形成 GSDMD-N，在胞膜上聚合形成孔道，使 IL-1β 和 IL-18 等炎癥因子被釋放[6]，導(dǎo)致肝細胞損傷。同時IL-1β 和 IL-18 會募集更多炎癥細胞， 擴大肝臟炎癥反應(yīng)。研究[7]發(fā)現(xiàn)，在 NASH 模型小鼠肝臟組織中，GSDMD 和 GSDMD-N 蛋白表達明顯升高，蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng) NASH 模型小鼠在敲除 GSDMD 后，與野生小鼠相比脂肪變性和炎癥程度明顯降低，提示細胞焦亡在 NASH 發(fā)病過程中起到了重要作用。巨噬細胞在非病理狀態(tài)下只表達少量 Caspase-11，當(dāng)給予 LPS 刺激時， Caspase-11 表達量增加，作用于 Caspase-1 和 GSDMD-N，引起 IL-1β、IL-1α、 IL-18 的釋放與Kupffer細胞焦亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞時，細胞表面出現(xiàn)球狀突起和膜孔的形成。這些變化與焦亡形態(tài)特征相符合。當(dāng)給予多烯磷脂酰膽堿及化痰祛濕活血方含藥血清干預(yù)后發(fā)現(xiàn)可以減少細胞腫脹和表明突起現(xiàn)象，高劑量組并可明顯減少細胞孔隙發(fā)生。進一步細胞免疫熒光實驗證明，模型組細胞GSDMD-N陽性染色強度明顯增加，證實GSDMD-N是參與細胞膜孔道形成的關(guān)鍵。對照組與中藥組相較模型組GSDMD-N陽性染色強度均有減弱。證明藥物可通過干預(yù)GSDMD-N的表達減輕細胞焦亡對肝組織的損傷。

綜上所述，本研究從亞細胞水平觀察了化痰祛濕活血方對巨噬細胞超微結(jié)構(gòu)的影響，為中醫(yī)藥防治NASH的機制研究提供了實驗依據(jù)。后續(xù)還會開展針對巨噬細胞焦亡的機制方面探究化痰祛濕活血方的作用靶點，為該方的臨床使用提供更多實驗證據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年9月16日經(jīng)由河南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批，批號為YFYDW2021026，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：劉鳴昊負責(zé)課題設(shè)計；劉素彤負責(zé)資料分析，撰寫論文；尚東方、張麗慧、顧亞嬌參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；趙文霞負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。