預(yù)知子聯(lián)合雷公藤紅素對肝癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用及對NF-κB通路的影響

張夜航，彭佩克，方肇勤，盧文麗

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海201203

原發(fā)性肝癌（以下簡稱“肝癌”）在全世界常見36種惡性腫瘤中發(fā)病率居第6位，致死率居第3位。肝癌起病隱匿，增殖迅速，臨床多數(shù)患者在診斷時(shí)已為中晚期或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，需要接受除手術(shù)、介入等手段外的全身性系統(tǒng)治療，中醫(yī)藥是系統(tǒng)治療的重要組成部分。課題組前期體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，行氣活血法代表中藥預(yù)知子醇提物能有效抑制多種肝癌細(xì)胞增殖，聯(lián)合雷公藤紅素具有協(xié)同增效作用，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期，然而其體內(nèi)作用效果尚不清楚。核因子（NF）-κB通路是與腫瘤和炎癥密切相關(guān)的經(jīng)典通路，雷公藤紅素在多種腫瘤研究中顯示對該通路的抑制作用，且多有聯(lián)合用藥探索，而預(yù)知子對該通路的影響較少涉及。因此，本研究通過建立SMMC7721肝癌荷瘤裸鼠模型，觀察預(yù)知子聯(lián)合雷公藤紅素對腫瘤生長影響，并從NF-κB通路探討二者聯(lián)合的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞

雄性Balb/c裸鼠30只，體質(zhì)量16～18 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級實(shí)驗(yàn)室，使用許可證號SYXK（滬）2020-0009。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（PZSHUTCM201120006）。人肝癌SMMC7721細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d 傳代1 次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及制備

預(yù)知子藥材1 000 g，上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，批號200723，獲取種子208 g，60 ℃干燥過夜，粉碎，加入10倍體積50%乙醇浸泡2 h，80 ℃回流提取2次，每次2 h，合并回流液，過濾，濃縮至膏狀、無醇味，凍干，得凍干粉47 g，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。雷公藤紅素，美國MedChemExpress公司，批號78528。參考文獻(xiàn)[10-11]方法，稱取一定量殼聚糖粉末，磁力攪拌下溶解于0.1 mol/L鹽酸溶液中，4 ℃過夜充分溶脹并除去氣泡，次日4 000 r/min離心10 min去除雜質(zhì)，置于4 ℃冰箱備用。稱取一定量甘油磷酸鈉粉末，于雙蒸水中充分溶解，置于4 ℃冰箱備用。于4 ℃向殼聚糖溶液中逐滴加入甘油磷酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌約10 min，即得空白殼聚糖/甘油磷酸鈉凝膠溶液。將適量預(yù)知子凍干粉溶于甘油磷酸鈉溶液，4 ℃下逐滴加至殼聚糖溶液，使其終濃度為60 mg/mL；將一定量雷公藤紅素溶于二甲基亞砜，逐滴加至殼聚糖溶液中，再向該溶液中滴加甘油磷酸鈉溶液，搖晃混勻，使其終濃度為0.33 mg/mL；同法制成含相同濃度的預(yù)知子提取物和雷公藤紅素的混合溶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.3 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美國Corning 公司，批號分別為33920003、26219003、22420008），殼聚糖（生工生物工程上海股份有限公司，批號G925BA0023），PageRuler預(yù)染蛋白ladder（美國Thermo Scientific，批號00792185），青霉素-鏈霉素、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號分別為C0222、A0216、P0013B、P1005、P1045-2），超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號120319201009），小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號241171031026），β-甘油磷酸二鈉（美國Merck，批號BCCD6874），NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）一抗、周期蛋白D1（Cyclin D1）一抗、周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）一抗（英國Abcam，批號分別為GR3275776-6、GR275907-38、GR3233421-7、GR3302404-8），p-NF-κB p65（Ser536）一抗、p-IκBα（Ser32/Ser36）一抗（美國Affinity Biosciences，貨號AF2006、AF2002），IκB激酶α一抗（IKKα，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號121918211028），β-actin單抗（美國Affinity Biosciences公司，批號85r7978）。Alpha 1-2 LD plus 冷凍干燥機(jī)（德國CHRIST），CP2250 分析天平（德國Sartorus 公司），MH-1 搖床（海門其林貝爾儀器），Model 310 CO培養(yǎng)箱、1300 SERIES A2 生物安全柜、HPS RT2 加熱磁力攪拌器（美國Thermo Scientific公司），ELX-800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司），XDS-1B倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠），PowerPacBasic 電泳儀及配套電泳槽、170-3930 小型濕轉(zhuǎn)槽（美國Bio-Rad 公司），F(xiàn)luorChem E 凝膠成像與分析系統(tǒng)（美國Protein-Simple公司），Tissuelyser-64L多樣品組織研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.4 造模、分組及給藥

裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，每只右腋皮下接種0.2 mL SMMC7721細(xì)胞懸液（1.5×10個(gè)/mL）。7 d后待腫瘤長出，隨機(jī)將裸鼠分為模型對照組、預(yù)知子提取物組（0.30 g/kg）、雷公藤紅素組（1.67×10g/kg）和聯(lián)合組（以上劑量聯(lián)合），分別為7、7、8、8只，分別于分組后第1、6、11日經(jīng)皮瘤內(nèi)注射相應(yīng)藥物，每次100 μL，共3次。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 一般情況

每2日觀察裸鼠飲食、活動(dòng)及生長狀況，稱量裸鼠體質(zhì)量，計(jì)算瘤體積（0.5×a×b，a為長徑，b為寬徑）。第16日脫頸處死動(dòng)物，取瘤組織后稱定質(zhì)量，計(jì)算瘤指數(shù)和抑瘤率，瘤指數(shù)＝瘤質(zhì)量÷去瘤體質(zhì)量，抑瘤率（%）＝（模型對照組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量）÷模型對照組平均瘤質(zhì)量×100%。取肝、脾、左腎并稱重，計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量÷去瘤體質(zhì)量。

1.5.2 ELISA檢測

第16日處死動(dòng)物前，摘眼球取血，4 ℃靜置2 h，2 000 r/min離心20 min，取血清，按ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清TNF-α含量。

1.5.3 HE染色

將瘤組織置于10%福爾馬林溶液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，60 ℃浸蠟2 h，切片機(jī)切片（厚度約5 μm），37 ℃恒溫箱中烘干過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水洗后，蘇木素染色5 min，蒸餾水浸洗，伊紅染色1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，正置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.4 Western blot檢測

取瘤組織，加入RIPA裂解液（含磷酸酶和蛋白酶抑制劑）裂解，采用磁珠粉碎后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液測定蛋白濃度；蛋白上樣量約30 μg，電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜，5%BSA室溫封閉2 h，加入IKKα一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶2 000）、p-NF-κB p65 一抗（1∶1 000）、IκBα 一抗（1∶2 000）、p-IκBα 一抗（1∶1 000）、Cyclin D1一抗（1∶20 000）、CDK2一抗（1∶5 000）、β-actin一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，滴加二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，ECL顯色曝光，用FluorChem E凝膠成像與分析系統(tǒng)獲得條帶，Image J軟件計(jì)算條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 預(yù)知子聯(lián)合雷公藤紅素對荷瘤裸鼠一般狀況的影響

實(shí)驗(yàn)過程中，模型對照組死亡2只、雷公藤紅素組死亡1只，其余2組未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。

各組裸鼠初始（第1日）體質(zhì)量及瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；實(shí)驗(yàn)第16日，與模型對照組比較，雷公藤紅素組裸鼠體質(zhì)量、去瘤體質(zhì)量、瘤質(zhì)量、瘤指數(shù)、瘤體積顯著減少（＜0.05），聯(lián)合組裸鼠瘤質(zhì)量、瘤體積顯著減少（＜0.05）。預(yù)知子提取物組、雷公藤紅素組、聯(lián)合組抑瘤率分別為6.68%、35.08%、22.00%。見表1。

表1 各組裸鼠一般狀況比較（）

與模型對照組比較，預(yù)知子提取物組、雷公藤紅素組、聯(lián)合組裸鼠肝質(zhì)量、肝指數(shù)、左腎質(zhì)量顯著降低（＜0.05），預(yù)知子提取物組和雷公藤紅素組裸鼠左腎指數(shù)顯著降低（＜0.05）。見表2。

表2 各組裸鼠臟器質(zhì)量和指數(shù)比較（）

2.2 預(yù)知子聯(lián)合雷公藤紅素對荷瘤裸鼠血清腫瘤壞死因子-α含量的影響

與模型對照組比較，各給藥組裸鼠血清TNF-α含量顯著增加（＜0.05），各給藥組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見表3。

表3 各組裸鼠血清TNF-α含量比較（，pg/mL）

2.3 預(yù)知子聯(lián)合雷公藤紅素對荷瘤裸鼠瘤組織形態(tài)的影響

模型對照組裸鼠腫瘤細(xì)胞大小不一，部分區(qū)域出現(xiàn)壞死、細(xì)胞核消失、炎性細(xì)胞浸潤，可見少量巨噬細(xì)胞；預(yù)知子提取物組裸鼠瘤組織核深染細(xì)胞和炎性細(xì)胞較少，但有間質(zhì)增多現(xiàn)象；雷公藤紅素組裸鼠瘤組織也出現(xiàn)間質(zhì)增多、核深染及炎性細(xì)胞減少現(xiàn)象，同時(shí)部分區(qū)域細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞核變小甚至消失；聯(lián)合組裸鼠腫瘤細(xì)胞大小不一、排列相對無序，間質(zhì)增多依然存在，壞死區(qū)域出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤堆積。見圖1。

圖1 各組裸鼠瘤組織形態(tài)（HE染色，×200）

2.4 預(yù)知子聯(lián)合雷公藤紅素對荷瘤裸鼠核因子-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4.1 對上游IKKα 和下游CDK2、Cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響

與模型對照組比較，雷公藤紅素組裸鼠瘤組織IKKα、CDK2、Cyclin D1 蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05），且與預(yù)知子提取物組和聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。見圖2。

圖2 各組裸鼠瘤組織IKKα、CDK2、Cylin D1蛋白表達(dá)比較（，每組3～6只）

2.4.2 對IκBα、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

與模型對照組比較，聯(lián)合組裸鼠瘤組織IκBα、p-IκBα蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05），雷公藤紅素組裸鼠瘤組織NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05），各給藥組瘤組織p-NF-κB p65蛋白表達(dá)有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見圖3。

圖3 各組裸鼠瘤組織IκBα、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較（，每組3～6只）

3 討論

對于惡性腫瘤、慢性病等難治性疾病，因單藥治療在耐藥性及不良反應(yīng)等方面存在局限性，單一靶點(diǎn)、單一藥物的常規(guī)治療策略已經(jīng)逐漸轉(zhuǎn)向多成分、多靶點(diǎn)的聯(lián)合療法，且具有減量、增效、減毒等優(yōu)勢。雖然聯(lián)合用藥理念成為共識，但傳統(tǒng)全身給藥方式療效不佳，局部或靶向治療可能成為未來腫瘤治療的新方向。局部或靶向治療需要媒介，可注射溫敏性載藥系統(tǒng)，如殼聚糖/甘油磷酸鈉載藥系統(tǒng)。該系統(tǒng)能在低溫下保持液態(tài)、體溫下形成凝膠，且具有良好的生物相容性、降解性、可控緩釋等特點(diǎn)，許多研究者嘗試將該系統(tǒng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤局部給藥，以形成局部給藥儲存和緩釋系統(tǒng)，達(dá)到較好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，借助可注射溫敏性殼聚糖/甘油磷酸鈉載藥系統(tǒng)，將預(yù)知子提取物和雷公藤紅素共載，觀察局部聯(lián)合給藥對腫瘤生長的抑制作用，并分析可能的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，給藥干預(yù)總體呈積極效應(yīng)。從動(dòng)物生存情況分析，模型對照組死亡2只，推測與腫瘤不斷生長、動(dòng)物負(fù)荷增加、局部壓迫和應(yīng)激有關(guān)；雷公藤紅素組死亡1只，而預(yù)知子提取物組和聯(lián)合組均未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。從抑制腫瘤生長上分析，3個(gè)給藥組按抑瘤率由高到低排序依次為雷公藤紅素組、聯(lián)合組、預(yù)知子提取物組，即抑瘤率以雷公藤紅素最高，但同時(shí)在3個(gè)給藥組中，雷公藤紅素組裸鼠生存情況較差，肝、腎質(zhì)量和指數(shù)及去瘤體質(zhì)量等均較低，而聯(lián)合組在一定程度上能糾正以上變化。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，各給藥組裸鼠血清TNF-α含量增加，但各給藥組間無顯著差異，還需綜合其他血清學(xué)指標(biāo)如白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β等輔助判斷。同時(shí)，瘤組織HE染色結(jié)果提示，經(jīng)預(yù)知子提取物或雷公藤紅素作用后，局部細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，且聯(lián)用后炎癥、壞死程度加重。

有研究表明，可通過影響NF-κB通路活性，如抑制IκBα蛋白磷酸化，從而影響肝癌預(yù)后。在其他腫瘤研究方面，NF-κB抑制劑雷公藤紅素與組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA 聯(lián)用可抑制SAHA 單藥引起的NF-κB激活，既有協(xié)同抗肺癌活性又未增加毒性。還有研究將多烯紫杉醇與雷公藤紅素共載，用于治療乳腺癌荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)多烯紫杉醇對NF-κB p65等蛋白表達(dá)影響不大，而雷公藤紅素對該通路有較好抑制作用，最終發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。本研究中，單用雷公藤紅素能抑制NF-κB通路，包括NF-κB p65、上游IKKα以及下游CDK2、Cyclin D1分子；單用預(yù)知子提取物對該通路影響不大，但與雷公藤紅素聯(lián)合后又能一定程度逆轉(zhuǎn)雷公藤紅素引起的相應(yīng)變化。這些分子水平的變化，與各組去瘤體質(zhì)量、抑瘤率等指標(biāo)變化趨勢基本一致。此外，預(yù)知子提取物組和雷公藤紅素組p-IκBα水平總體呈下降趨勢，且在聯(lián)合組呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢。因此，推測p-IκBα可能是二者聯(lián)合發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)之一。

現(xiàn)有給藥方式和劑量條件下，就抑制腫瘤增殖效果而言，預(yù)知子提取物作用并不十分顯著，雷公藤紅素最為突出，聯(lián)合組居中。此結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)聯(lián)合組抑瘤效應(yīng)最強(qiáng)不完全一致?？赡芘c本研究采用的殼聚糖/甘油磷酸鈉載藥系統(tǒng)有關(guān)。該載藥系統(tǒng)對于預(yù)知子提取物凍干粉載藥有限，而對于雷公藤紅素卻有較大的容許空間，一定程度上限制了預(yù)知子藥效發(fā)揮，也影響了預(yù)知子和雷公藤紅素的劑量比例，而劑量比例直接影響能否發(fā)揮最大聯(lián)合作用。鑒于目前文獻(xiàn)所載藥物多為中藥單體，如紫杉醇、去甲斑蝥素、姜黃素等。因此，今后可以將預(yù)知子提取物進(jìn)行進(jìn)一步萃取、提純，明確其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)；另一方面，可以考慮優(yōu)化載藥體系，如采用脂質(zhì)體、納米顆粒等微載體系統(tǒng)，優(yōu)化二者抑制肝癌細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用，拓展肝癌協(xié)同用藥研究空間。