石榴ATG基因家族鑒定及其在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

劉司瑜, 林藝靈, 王令宇, 夏家欣, 楊毓賢, 房經(jīng)貴, 王 晨, 上官凌飛

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 江蘇省果樹品種改良與種苗繁育工程中心, 江蘇 南京 210095)

石榴(PunicagranatumLinn.)為千屈菜科(Lythraceae)石榴屬(PunicaLinn.)的果樹，栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富[1]。石榴是一種集觀賞、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和保健于一體的優(yōu)良果樹，因其果實(shí)富含維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、鞣質(zhì)和類黃酮等，越來越受到消費(fèi)者的喜愛[2]。與其他果樹一樣，石榴在栽培過程中也常受高鹽、干旱、營養(yǎng)缺乏和病原菌侵染等脅迫影響，干旱脅迫下植株的生長和生理功能，尤其是光合特性等會發(fā)生一系列變化。王紫彤等[3]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫影響大蒜(AlliumsativumLinn.)葉綠素的合成，從而抑制葉綠體的發(fā)育，光合效率降低，使植株生長遲緩。石榴雖為一種較為耐旱的植物，但卓熱木·塔西等[4]研究發(fā)現(xiàn)土壤相對含水量從70%自然降到30%期間，植株光合等生理指標(biāo)下降，生長受到限制。細(xì)胞自噬是生物體降解蛋白質(zhì)過程中一條非常重要的途徑，存在于真核單細(xì)胞生物、植物和動物中。調(diào)控細(xì)胞自噬形成與發(fā)生的基因稱作自噬相關(guān)基因(autophagy-relatedgene，ATG)[5]。除了正常生長發(fā)育與衰老外，當(dāng)植物體受到外界環(huán)境的刺激而處在逆境條件下，植物體內(nèi)的細(xì)胞也會在ATG等基因的調(diào)控下，形成自噬小體，將受損的蛋白質(zhì)或者細(xì)胞器包裹起來，運(yùn)輸?shù)揭号葸M(jìn)行水解，產(chǎn)生的物質(zhì)和能量被植物體循環(huán)利用[6]。

目前，在非生物脅迫方面，研究較多的是ATG5、ATG7、ATG8和ATG18等基因，例如：核桃(JuglansregiaLinn.)ATG18a基因能響應(yīng)逆境，參與核桃適應(yīng)不良環(huán)境[7]；小麥(TriticumaestivumLinn.)ATG18s基因及其參與的自噬過程與小麥對白粉菌侵染的免疫反應(yīng)密切相關(guān)，也與小麥響應(yīng)非生物脅迫環(huán)境相關(guān)[8]；當(dāng)番茄(SolanumlycopersicumLinn.)受到高溫脅迫時(shí)，ATG5和ATG7基因表達(dá)量上調(diào)，而將ATG5和ATG7基因沉默后，番茄株系對高溫的耐受性顯著下降[9]。但到目前為止，對石榴ATG基因家族的研究還少見報(bào)道。脫落酸(ABA)可以調(diào)節(jié)植物對外界脅迫的響應(yīng)[10]。Qian等[11]研究認(rèn)為，在干旱脅迫下，60 μmol·L-1ABA能夠顯著提高石榴對干旱脅迫的耐受性。

自2017年，石榴品種‘大笨籽’(‘Dabenzi’)、‘泰山紅’(‘Taishanhong’)和‘突尼斯’(‘Tunisia’)的基因組測序陸續(xù)完成，獲得了更高質(zhì)量的石榴基因組序列[12-14]，也為在全基因組水平上鑒定與分析基因家族提供了可能性。本研究從目前基因組質(zhì)量最高的石榴品種‘突尼斯’基因組中挖掘ATG基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)探究其在不同非生物脅迫下的表達(dá)情況，為后續(xù)深入分析ATG基因在石榴響應(yīng)非生物脅迫中的功能奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 基因組數(shù)據(jù)來源

石榴基因組數(shù)據(jù)(ASM220158v2)[14]下載自NCBI數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)，擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.)Heynh.〕基因組數(shù)據(jù)下載自EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(http:∥plants.ensembl.org/Arabidopsis_thaliana/Info/Index)，葡萄(VitisviniferaLinn.)基因組數(shù)據(jù)下載自EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(ftp:∥ftp.ensemblgenomes.org/pub/release-33/plants/gtf/vitis_vinifera)[15]。石榴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra)[11,16]。

1.2 方法

1.2.1 石榴ATG基因家族成員的鑒定 根據(jù)已報(bào)道的擬南芥和水稻(OryzasativaLinn.)ATG基因核酸序列，利用BLASTx程序(ftp:∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)從石榴蛋白質(zhì)序列集中檢索潛在的石榴ATG序列(E≤10-5)；利用NCBI網(wǎng)站的CDD在線工具(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)批量鑒定石榴ATG基因家族成員序列的功能域，篩選并剔除其中的假陽性序列，獲得候選的石榴ATG基因家族成員。

1.2.2 石榴ATG家族成員的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 運(yùn)用在線軟件Protparam(http:∥us.expasy.org/tools/protparam.html)對候選的石榴ATG家族成員進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，獲得石榴ATG家族成員氨基酸序列的氨基酸殘基數(shù)、理論相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)和不穩(wěn)定系數(shù)。

1.2.3 石榴ATG基因家族成員染色體定位和基因結(jié)構(gòu)分析 利用MG2C網(wǎng)站(http:∥mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)繪制石榴ATG基因家族成員染色體定位圖。根據(jù)石榴全基因組的GFF格式的注釋文件，提取石榴ATG基因家族成員序列中的非翻譯區(qū)、編碼序列和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)信息。利用TBtools軟件[17]分析其基因結(jié)構(gòu)，生成相應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)圖。

1.2.4 石榴ATG家族成員的氨基酸序列對比和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 使用MEGA7.0軟件[18]中的MUSCLE方法對石榴和擬南芥ATG家族成員的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)生成進(jìn)化樹，設(shè)置校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap的重復(fù)次數(shù)為1 000。使用iTOL在線軟件[19](https:∥itol.embl.de/)修飾美化進(jìn)化樹。

1.2.5 石榴ATG基因家族成員共線性分析 運(yùn)用MCScanX軟件[20]對石榴ATG基因家族成員進(jìn)行共線性分析，選出具有顯著共線性的成員。此外，利用TBtools軟件繪制石榴、擬南芥和葡萄ATG基因家族成員的共線性圖譜，并計(jì)算石榴具有顯著共線性成員的Ka/Ks值，其中Ka為非同義替換率，Ks為同義替換率。若Ka/Ks值大于1，則認(rèn)為存在正向選擇；若Ka/Ks值等于1，則認(rèn)為存在中性選擇；如果Ka/Ks值小于1，則認(rèn)為存在純化選擇。

1.2.6 石榴ATG基因家族成員在非生物脅迫下的表達(dá)信息挖掘 根據(jù)石榴ATG基因家族成員基因ID號，利用前人發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[11,16]分析石榴ATG基因家族成員在ABA緩解干旱脅迫和NaCl脅迫下的表達(dá)量，利用TBtools軟件繪制熱圖。

1.2.7 石榴ATG基因家族成員在非生物脅迫下的表達(dá)驗(yàn)證 石榴品種‘突尼斯’2年生苗(購自山東振邦生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司)種植于盆口直徑20 cm、高25 cm的塑料盆中，栽培基質(zhì)為育苗專用基質(zhì)(江蘇興農(nóng)基質(zhì)科技有限公司)，每盆1株，置于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬實(shí)踐基地溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。

參考Qian等[11]的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，挑選長勢基本一致的12株植株用于干旱脅迫處理，將12株植株隨機(jī)分為4組，每組3株。干旱脅迫時(shí)間為31 d(4月13日至5月13日)，脅迫期間保持土壤含水量為30%～35%。在干旱脅迫的同時(shí)，其中3組每天分別全株噴灑30、60和90 μmol·L-1ABA溶液10 mL，剩余1組作為對照，噴灑等體積的蒸餾水(即0 μmol·L-1ABA溶液)。處理結(jié)束后收集各植株的全部葉片，立即在液氮中冷凍后儲存于-80 ℃冰箱，用于提取RNA。

參考Liu等[16]的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和獲得的表達(dá)信息，發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫第6天基因的應(yīng)答強(qiáng)烈，同時(shí)根中響應(yīng)基因較葉片中多，因此本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR)以0和6 d根系為材料分析石榴ATG基因表達(dá)特點(diǎn)。參考Liu等[16]的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，挑選長勢基本一致的6株植株用于NaCl脅迫處理，將6株植株隨機(jī)分為2組，每組3株。NaCl脅迫時(shí)間為6 d(4月13日至4月18日)，其中一組用200 mmol·L-1NaCl溶液施肥1次，每盆施用1 L；于4月13日收獲未進(jìn)行NaCl脅迫處理組植株的全部根系作為對照。實(shí)驗(yàn)期間NaCl脅迫處理組每盆下面放置1個碟子收集滲濾液并倒回塑料盆中。第6天(處理結(jié)束后)收集NaCl脅迫處理組各植株的全部根系，立即在液氮中冷凍后儲存于-80 ℃冰箱，用于提取RNA。

所有樣品使用CTAB法[21]提取RNA，使用Nanodrop-100a超微量分光光度計(jì)(美國賽默飛公司)檢測RNA濃度，使用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查完整性。利用PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)用于qRT-PCR分析，引物由通用生物股份有限公司合成，參照關(guān)曉彎等[22]的研究使用PgActin為內(nèi)參基因。按照SYBRPremixExTaqTM試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕說明書，采用qRT-PCR測定基因的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系總體積20.0 μL，包括cDNA 1.0 μL、反應(yīng)MIX〔寶生物工程(大連)有限公司〕10.0 μL、正向和反向引物各0.8 μL，超純水7.4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、58 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。每個樣品3次重復(fù)。采用2-ΔΔCT計(jì)算方法，以對照計(jì)算相對表達(dá)量。

表1 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理

利用EXCEL 2010和LinReg PCR軟件[23]分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 石榴ATG基因家族鑒定及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

通過BLASTx檢索和CDD批量鑒定和篩選，初步鑒定出58個石榴ATG基因家族成員，并對其進(jìn)行命名。

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果(表2)表明：石榴ATG家族成員的氨基酸殘基數(shù)變化幅度較大，介于94～3 708之間，其中PgATG5a的氨基酸殘基數(shù)最多，PgATG12的氨基酸殘基數(shù)最少。該家族成員的理論相對分子質(zhì)量為10 550～413 118，其中PgATG5a的理論相對分子質(zhì)量最大，而PgATG12的理論相對分子質(zhì)量最小。該家族成員的理論等電點(diǎn)為pI 4.69～pI 9.39，其中35個家族成員的理論等電點(diǎn)小于pI 7，其余23個家族成員的理論等電點(diǎn)大于pI 7。該家族成員的不穩(wěn)定指數(shù)介于30.41～70.17之間，其中PgATG2、PgATG8c-1、PgATG8c-2、PgATG8c-3、PgATG10和PgATG16這6個家族成員的不穩(wěn)定指數(shù)小于40。

表2 石榴ATG基因家族成員編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)

2.2 石榴ATG基因家族的染色體定位和基因結(jié)構(gòu)分析

染色體定位分析結(jié)果(圖1-A)顯示：58個石榴ATG基因家族成員分布于8條染色體上。其中，Pg06染色體上的石榴ATG基因家族成員數(shù)量最少，只有4個；Pg02染色體上分布的石榴ATG基因家族成員最多，有14個。其余6條染色體上分布的石榴ATG基因家族成員數(shù)量為5～8。石榴ATG基因家族成員在同一條染色體上的分布是不均勻的，大多分布在各染色體的上端、中上端和下端，除了Pg01、Pg02和Pg08染色體上的ATG基因家族成員分布較為集中外，其余染色體上的ATG基因家族成員分布較為分散。此外，PgATG1b-1、PgATG11a和PgVTI12b-2這3個基因的染色體定位信息不足。

Pg01-Pg08: 染色體Chromosomes.: 非翻譯區(qū)Untranslated region; : 編碼序列Coding sequence; ─: 內(nèi)含子Intron.

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖1-B)顯示：58個石榴ATG基因家族成員均含有內(nèi)含子。成員之間結(jié)構(gòu)差異較大，其中PgTORa、PgTORb和PgTORc基因的結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，有56個外顯子，而PgATIa-3基因的結(jié)構(gòu)最簡單，僅有1個外顯子。

2.3 石榴ATG家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(圖2)顯示：58個石榴ATG家族成員可以分為A、B、C、D、E和F 6個亞族。其中A亞族是最大的亞族，含有23個石榴ATG家族成員，主要包括PgATG8、PgATG5、PgATG18f和PgATG18h；B亞族含有17個石榴ATG家族成員，主要包括PgATG1b、PgATIa、PgATG13、PgTOR和PgATG6；C亞族含有5個石榴ATG家族成員，包括PgVTI12和PgATG101；D亞族僅含有PgATG11的3個家族成員；E亞族為最小的亞族，僅含有PgVPS15這1個石榴ATG家族成員；F亞族含有9個石榴ATG家族成員，包括PgATG18a、PgATG18c和PgVPS34。此外，石榴ATG家族成員與擬南芥ATG家族成員的進(jìn)化關(guān)系相似。

Pg: 石榴Punica granatum Linn.; At: 擬南芥Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.

2.4 石榴ATG基因家族的共線性分析及Ka/Ks分析

共線性分析結(jié)果(圖3)顯示：58個石榴基因家族成員中存在3對共線關(guān)系，說明石榴ATG基因家族的擴(kuò)張來源于串聯(lián)重復(fù)事件。在石榴與擬南芥ATG基因家族成員間存在45對共線關(guān)系，石榴與葡萄ATG基因家族成員間則存在41對共線關(guān)系，說明石榴與擬南芥的共線性多于葡萄。

Pg01-Pg08: 石榴染色體Chromosomes of Punica granatum Linn.; At01-At05: 擬南芥染色體Chromosomes of Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.; Vv01-Vv19: 葡萄染色體Chromosomes of Vitis vinifera Linn.紅色線條為石榴種內(nèi)的共線基因?qū)?，藍(lán)色線條為石榴和擬南芥間的共線基因?qū)?，黃色線條為石榴和葡萄間的共線基因?qū)he red lines are the collinear gene pairs within P. granatum, the blue lines are the collinear gene pairs between P. granatum and A. thaliana, and the yellow lines are the collinear gene pairs between P. granatum and V. vinifera.

根據(jù)Ka/Ks分析結(jié)果(表3)顯示：石榴中3個共線基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于1，說明其在進(jìn)化過程中受到了純化選擇。

表3 石榴ATG基因家族成員中共線基因?qū)Φ腒a/Ks分析

2.5 石榴ATG基因家族的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步了解石榴ATG基因在非生物脅迫下可能發(fā)揮的作用，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析石榴ATG基因在ABA緩解干旱脅迫和NaCl脅迫下的差異表達(dá)情況(圖4)。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘后發(fā)現(xiàn)，有5個石榴ATG基因參與ABA緩解干旱脅迫進(jìn)程(圖4-A)。干旱脅迫下，60 μmol·L-1ABA處理的PgVTI12b-1基因表達(dá)量顯著高于其他濃度ABA處理；PgATG1b-1、PgATG8c-2和PgATG8c-3基因的表達(dá)量隨著ABA濃度的提高而不斷上調(diào)，說明這3個基因的表達(dá)在干旱脅迫下受到ABA濃度的正調(diào)控；而30 μmol·L-1ABA處理的PgATG8h-1基因的表達(dá)量較高。

在NaCl脅迫下，石榴根和葉中分別有11和8個基因響應(yīng)NaCl脅迫(圖4-B，C)。石榴根中響應(yīng)NaCl脅迫的11個基因中，除了PgATG1b-2和PgATG6b基因下調(diào)外，PgATG5b、PgATG18c-1、PgTORa、PgTORb、PgVPS34、PgATG5c、PgATG11a、PgATG2和PgATG5a9個基因均上調(diào)，其中，PgATG5c、PgATG11a、PgATG2和PgATG5a基因均隨脅迫時(shí)間延長而不斷上調(diào)，PgTORa、PgTORb和PgVPS34基因則在脅迫第3天時(shí)出現(xiàn)更為明顯的上調(diào)情況。石榴葉中響應(yīng)NaCl脅迫的8個基因中，隨著脅迫時(shí)間的延長，PgATG13b、PgATG8c-1、PgATG12、PgATG8c-4和PgTORb基因不斷上調(diào)，PgATG6b基因則下調(diào)，而PgATG11b基因先下調(diào)后上調(diào)；PgATG1b-2基因則在脅迫第3天出現(xiàn)較為明顯的上調(diào)。同時(shí)，PgATG6b、PgTORb和PgATG1b-2基因在根和葉中均差異表達(dá)，且PgTORb基因在根和葉中均上調(diào)，而PgATG6b基因則均下調(diào)，由此推測PgATG6b和PgTORb基因同時(shí)參與石榴根和葉對NaCl脅迫的響應(yīng)。

FPKM: 表達(dá)豐度Expression abundance.

利用qRT-PCR并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在ABA緩解干旱脅迫和NaCl脅迫下各隨機(jī)選取6個石榴ATG基因進(jìn)行表達(dá)模式分析。結(jié)果(圖5)顯示：干旱脅迫下，不同濃度ABA處理的6個石榴ATG基因中PgATG1b-1、PgATG8h-1、PgATG18a-2、PgVTI12b-1和PgATIa-4基因的表達(dá)模式與其轉(zhuǎn)錄情況基本一致，而PgATG8c-3基因的表達(dá)模式則與其轉(zhuǎn)錄情況不同，推測可能是本研究中的干旱脅迫時(shí)間(31 d)比獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的時(shí)間(90 d)短造成的，可能PgATG8c-3基因需要較長的時(shí)間才能參與改善石榴響應(yīng)ABA緩解干旱脅迫的進(jìn)程。NaCl脅迫處理下，PgATG1b-2、PgATG5a、PgATG5b、PgATG6b、PgATG18c-1和PgTORb基因的表達(dá)模式則與其轉(zhuǎn)錄情況相似。

：qRT-PCR; : RNA-Seq.

3 討 論

細(xì)胞自噬是生物進(jìn)化和生長發(fā)育過程中一個不可缺少的重要機(jī)制，在穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、提高細(xì)胞物料利用率、延緩細(xì)胞衰老以及增強(qiáng)植物抗逆性方面具有正向作用。ATG基因在多種植物中都存在，如擬南芥中有32個ATG基因[24]，水稻中有33個ATG基因[25]，辣椒(CapsicumannuumLinn.)[26]和葡萄[15]中分別有29和35個ATG基因。本研究基于石榴品種‘突尼斯’全基因組數(shù)據(jù)，首次從石榴中鑒定出58個ATG基因家族成員，相對于其他植物較多，說明石榴ATG基因可能在進(jìn)化過程中發(fā)生了基因復(fù)制。同時(shí)，ATG基因家族成員編碼氨基酸序列的氨基酸殘基數(shù)介于94～3 708之間，理論相對分子質(zhì)量在10 550～413 118之間，58個ATG基因家族成員中有52個成員的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，因此，該基因家族整體較不穩(wěn)定，這些與胡楊等[27]對蠶豆(ViciafabaLinn.)ATG基因鑒定中的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)研究結(jié)果類似。58個石榴ATG基因家族成員不均勻地分布在8條染色體上，這與擬南芥[28]的研究結(jié)果類似，說明即使是同一家族的成員，在染色體上的定位也是不同的。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示：58個石榴ATG家族成員分為A、B、C、D、E和F 6個亞族，并且與擬南芥ATG家族成員的進(jìn)化關(guān)系相似，表明石榴ATG家族成員與擬南芥親緣關(guān)系較近，這與葡萄中發(fā)現(xiàn)的ATG基因與雙子葉植物擬南芥的親緣關(guān)系更近相同[29]。同時(shí)，通過共線性分析發(fā)現(xiàn)，58個石榴ATG基因家族成員中存在3對共線關(guān)系，石榴與擬南芥和葡萄ATG基因家族成員間分別存在45和41對共線關(guān)系，說明這些基因在進(jìn)化上高度同源，且在進(jìn)化過程中十分保守。

已有研究結(jié)果顯示：蠶豆[27]、擬南芥[28]、番茄[30]、蘋果(MaluspumilaMill.)[31]和水稻[32]中響應(yīng)干旱脅迫的ATG8和ATG18基因家族成員較多。例如：蠶豆中VfATG8a基因能夠響應(yīng)干旱脅迫[27]；擬南芥中ATG8f/At4g16520和ATG8i/At3g15580基因?qū)Φ蜏?、高溫和干旱等外界環(huán)境極為敏感，且參與了整個植株對多種非生物脅迫的響應(yīng)[28]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了58個石榴ATG基因家族成員在ABA對干旱脅迫的緩解作用下的表達(dá)，初步鑒定出PgVTI12b-1、PgATG1b-1、PgATG8h-1、PgATG8c-2和PgATG8c-3基因可能是石榴響應(yīng)ABA緩解干旱脅迫的基因，且不同基因的響應(yīng)模式不同。60 μmol·L-1ABA能明顯提高石榴耐旱性，且PgVTI12b-1基因是該濃度ABA緩解石榴干旱脅迫的響應(yīng)基因。同時(shí)，PgATG1b-1、PgATG8c-2和PgATG8c-3基因的表達(dá)量隨ABA濃度的提高不斷上調(diào)，說明這3個基因可能響應(yīng)高濃度ABA對干旱脅迫的緩解。石榴在栽培過程中也受到高鹽的影響。沈徐悅等[33]對3種木蘭科(Magnoliaceae)植物的研究發(fā)現(xiàn)，中低濃度NaCl脅迫下，3種植物可通過自身調(diào)節(jié)減輕NaCl脅迫帶來的傷害；而高濃度NaCl脅迫下葉片細(xì)胞膜受到不可逆損傷。由此推測，ATG基因也有可能參與調(diào)節(jié)鹽脅迫的分子機(jī)制，但具體情況有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究通過探索發(fā)現(xiàn)，石榴根中有11個ATG基因(包括PgATG1b-2、PgATG2、PgATG5a、PgATG5b、PgATG5c、PgATG6b、PgATG11a、PgATG18c-1、PgTORa、PgTORb和PgVPS34)響應(yīng)NaCl脅迫，葉中有8個ATG基因(包括PgATG1b-2、PgATG6b、PgATG8c-1、PgATG8c-4、PgATG11b、PgATG12、PgATG13b和PgTORb)響應(yīng)NaCl脅迫。蘇萬龍[34]研究發(fā)現(xiàn)，200 mmol·L-1NaCl誘導(dǎo)楊樹(Populusspp.)中PagATG18a基因的表達(dá)量升高，過表達(dá)PagATG18a基因的植株通過提高植物體內(nèi)的抗氧化酶活性增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植物對NaCl脅迫的耐受性。孫鴻等[8]研究發(fā)現(xiàn)，高鹽(200 mmol·L-1NaCl)、干旱、低溫黑暗和缺氮培養(yǎng)等逆境處理均能夠上調(diào)小麥中TaATG18s基因的表達(dá)。說明ATG8和ATG18基因在多種植物中響應(yīng)NaCl脅迫，這也為進(jìn)一步研究石榴耐鹽ATG基因提供了候選基因及思路。黃成等[35]研究發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusLinn.)BnAPs家族成員中同源基因BnAP36.A04/C08和BnAP39.A06/C03均在花發(fā)育時(shí)期高表達(dá)，且具有相同的表達(dá)模式和qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果，推測二者在甘藍(lán)型油菜中可能有相似的功能。通過共線性分析發(fā)現(xiàn)，58個石榴ATG基因家族成員中存在3個共線基因?qū)Γ葱暂^高，分別為PgATIa-4/PgATIa-1、PgATG8c-2/PgATG8c-5和PgATG18a-1/PgATG18a-2，但這3個共線基因?qū)达@示出石榴對ABA緩解干旱脅迫和NaCl脅迫的響應(yīng)。

同時(shí)，本研究中qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄情況相似，進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但本研究未發(fā)現(xiàn)任何石榴ATG基因家族成員同時(shí)響應(yīng)ABA緩解干旱脅迫和NaCl脅迫，推測在石榴中ATG基因家族不同的成員參與不同非生物脅迫的響應(yīng)，與擬南芥中ATG8f/At4g16520和ATG8i/At3g15580基因參與低溫、高溫、干旱等多種環(huán)境脅迫不同[28]。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)ABA緩解干旱脅迫以及NaCl脅迫的PgATG8和PgATG5相關(guān)成員基因位于A亞族，由此可以推測A亞族在石榴應(yīng)對非生物脅迫方面起著重要的調(diào)控作用，也可推測進(jìn)化樹對基因功能分類有一定參考作用[36]。

4 結(jié) 論

基于石榴品種‘突尼斯’全基因組數(shù)據(jù)，初步鑒定了58個石榴ATG基因，明確了其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)等，且篩選出的PgVTI12b-1、PgATG1b-1、PgATG8h-1、PgATG8c-2和PgATG8c-3基因可能是石榴對ABA緩解干旱脅迫的響應(yīng)基因。NaCl脅迫下，石榴中11個ATG基因在根中響應(yīng)，8個ATG基因在葉中響應(yīng)，且PgATG6b、PgTORb和PgATG1b-2基因同時(shí)在根和葉中響應(yīng)NaCl脅迫，為后續(xù)開展ATG基因調(diào)控石榴干旱和鹽脅迫機(jī)制研究與功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)，并提供了靶標(biāo)基因。

致謝：本研究得到南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物信息學(xué)中心高性能計(jì)算平臺的支持，在此表示感謝！