32個百合品種遺傳多樣性分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建

王子康，蘇江碩，張雪峰，寧心怡，周迎雪，房偉民，陳發(fā)棣，張 飛

(南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095)

百合(Liliumspp.)是百合科(Liliaceae)百合屬(LiliumLinn.)植物的統(tǒng)稱，品種繁多，目前全世界的百合品種多達10 000余個[1]。中國觀賞百合的商品化栽培較晚，自主研發(fā)的品種較少，大部分觀賞百合的商品種球均依賴進口[2]，但很多進口品種存在“同物異名”的問題，亟待進一步鑒定。此外，不同百合品種表型變異豐富、遺傳背景復雜，了解不同百合品種間的遺傳距離及不同雜種系間的親緣關(guān)系對指導中國觀賞百合新品種的選育有重要意義[3]。

DNA指紋圖譜技術(shù)是基于DNA分子標記建立的能夠進行品種純度及真實性檢測的一種現(xiàn)代手段。比起通過植物外部表型來鑒定品種，DNA指紋圖譜具有不受環(huán)境因子影響、方便、可靠和快速等優(yōu)點[4]。目前，DNA指紋圖譜技術(shù)已廣泛用于睡蓮(NymphaeatetragonaGeorgi.)[5]、鈍葉杜鵑〔Rhododendronobtusum(Lindl.)Planch.〕[6]和春蘭〔Cymbidiumgoeringii(Rchb.f.)Rchb.F.〕[7]、叢生竹雜交種[8]和楊柳科(Salicaceae)植物[9]等種質(zhì)資源的鑒定，還用于藥用百合種質(zhì)資源的品種鑒定[10]，但在觀賞百合上鮮有相關(guān)報道[11]。

相關(guān)序列擴增多態(tài)性(SRAP)標記作為分子標記的一種方法，除了其引物沒有物種特異性外，還具有操作簡單、穩(wěn)定、成本低和高共顯性等優(yōu)點[12]。目前，SRAP分子標記已被廣泛應用于植物的遺傳多樣性評價、親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建等方面[13，14]。然而，目前國內(nèi)外相關(guān)學者基于SRAP標記對百合種質(zhì)資源的研究主要在其遺傳多樣性和親緣關(guān)系上[15-17]，尚無觀賞百合品種資源DNA指紋圖譜構(gòu)建的相關(guān)報道。鑒于此，本研究利用SRAP分子標記分析了來自4個不同雜種系的32個觀賞百合品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，并構(gòu)建了DNA指紋圖譜，旨在為百合品種資源鑒定和雜交親本選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試百合種球購自江蘇省沭陽縣新河鎮(zhèn)左猛種子經(jīng)營部和虹越花卉股份有限公司，均為進口的觀賞百合品種。供試32個百合品種來自4個雜種系，包括‘Tiny Moon’、‘Tiny Rocket’、‘Tiny Padhye’、‘Tiny Bee’、‘Tiny Ghost’和‘Yellow Pearl’6個亞洲百合(LiliumAsiatica Hybrids)雜種系(A)的品種；‘Sweet Valley’、‘Dynamix’、‘Mingo Orange’、‘Summer Sky’、‘Summer Snow’、‘Sweet Sugar’、‘Eyeliner’、‘Acumen’和‘Mistery Dream’9個鐵炮百合(LiliumlongiflorumThunb.)與亞洲百合雜種系(LA)的品種；‘Siberia’、‘Sorbone’、‘Sunny Azores’、‘After Eight’、‘Sunny Martinique’、‘Lotus Wonder’、‘Lsabella’、‘Snowboard’、‘Monica’和‘Aisha’10個東方百合(LiliumOriental Hybrids)雜種系(O)的品種；‘White Eyes’、‘Exotic Sun’、‘Conca D’or’、‘Palazzo’、‘Zambesi’、‘Robina’和‘Friso’7個東方百合與喇叭百合(LiliumTrumpet Hybrids)雜種系(OT)的品種。于2021年9月將32個百合品種栽植于南京農(nóng)業(yè)大學湖熟花卉基地；同年10月，采集處于旺盛營養(yǎng)生長期的植株頂端的嫩葉，每個品種采5～8株，每株采集3～5枚葉片，用錫箔紙包好后放入液氮中冷凍，置于-80 ℃冰箱保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 參考文獻[18]，采用改良的CTAB法提取百合基因組DNA。利用NanoDrop One超微量分光光度計〔賽默飛世爾科技(中國)有限公司〕檢測DNA的濃度和純度，然后將其稀釋到100 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱保存、備用。

1.2.2 SRAP-PCR反應程序及電泳檢測 SRAP-PCR體系總體積為20.0 μL，包括10×PCR Buffer 2.0 μL、2.5 nmol·μL-1dNTPs 1.8 μL、10 nmol·μL-1正向和反向引物各1.0 μL、5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.2 μL、100 ng·μL-1模板DNA 1.0 μL和ddH2O 13.0 μL。所用試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min、35 ℃復性1 min、72 ℃延伸1 min，共5個循環(huán)；94 ℃變性1 min、50 ℃復性1 min、72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物于4 ℃保存、備用。

PCR擴增結(jié)束后，用質(zhì)量體積分數(shù)8%非變性聚丙稀酰胺凝膠(PAGE)進行電泳分離，介質(zhì)為1×TBE緩沖液，PCR擴增產(chǎn)物加樣量為5.0 μL，點樣結(jié)束后在240 V恒壓下電泳90 min。電泳結(jié)束后用銀染法[18]染色，并對所得電泳膠圖拍照記錄。

1.2.3 引物篩選 SRAP正向和反向引物序列來源于Li等[19]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成?；谇叭嗽诎俸涎芯恐泻Y選得到的53對多態(tài)性良好的SRAP引物[15-17]，本研究進一步篩選得到17對引物。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

本試驗僅對擴增條帶清晰的多態(tài)性位點進行統(tǒng)計。在相同遷移位置上，有條帶的記為“1”，沒有條帶或條帶不明顯的記為“0”；品種條帶缺失的記為NA(在后續(xù)的軟件分析中，根據(jù)不同軟件對錄入數(shù)據(jù)的要求轉(zhuǎn)換成相應的記錄形式)。標記條帶的命名方法為“引物對-擴增片段大小”，如“ME11-EM8-110”表示引物ME11-EM8在電泳圖譜上DNA大小為110 bp處擴增出的多態(tài)性條帶。依此方法得到每對引物的“0”“1”數(shù)據(jù)矩陣，利用EXCEL 2016軟件記錄，并統(tǒng)計多態(tài)性條帶數(shù)。根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計原理，2個品種的指紋圖譜完全相同的概率(P)的計算公式為P=1/2n,式中，n表示該SRAP引物擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)[20]。

利用Quantity One軟件計算多態(tài)性位點的大小。利用POWERMARKER Ver.3.25軟件計算Nei’s基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量指數(shù)，利用NTSYS pc Ver.2.10e軟件計算不同品種間的遺傳相似系數(shù)，并采用UPGMA方法進行聚類分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 SRAP標記多態(tài)性分析

結(jié)果(表1)顯示：篩選得到的17對多態(tài)性引物，共擴增出177個清晰的多態(tài)性條帶。17對引物擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)在5～18之間，引物ME11-EM8擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)最多，引物ME7-EM5擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)最少，平均每對引物擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)為10.4。17對引物的Nei’s基因多樣性指數(shù)在0.366 8～0.475 6之間，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.424 9，引物ME10-EM3的Nei’s基因多樣性指數(shù)最高，引物ME12-EM1的Nei’s基因多樣性指數(shù)最低。17對引物的多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC)在0.286 4～0.362 3之間，平均PIC值為0.330 6，引物ME10-EM3的PIC值最高，引物ME12-EM1的PIC值最低。

表1 17對多態(tài)性SRAP引物的擴增結(jié)果

2.2 遺傳相似系數(shù)和聚類分析

基于SRAP數(shù)據(jù)分析得到32個百合品種的遺傳相似系數(shù)(表2)。結(jié)果顯示：不同百合品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)為0.356～0.836，平均值為0.561，其中，‘Tiny Bee’與‘Sunny Azores’間的GS值最小,‘Palazzo’與‘Robina’間的GS值最大。6個亞洲百合雜種系(A)品種間的GS值為0.554～0.735，平均值為0.638；9個鐵炮百合與亞洲百合雜種系(LA)品種間的GS值為0.608～0.753，平均值為0.674；10個東方百合雜種系(O)品種間的GS值為0.593～0.808，平均值為0.709；7個東方百合與喇叭百合雜種系(OT)品種間的GS值為0.545～0.836，平均值為0.675。

表2 32個百合品種的遺傳相似系數(shù)1)

聚類分析結(jié)果(圖1)顯示：在GS值為0.578處，32個百合品種可分為2個類群：類群Ⅰ包含15個品種，均屬于A和LA百合雜種系；類群Ⅱ包含17個品種，均屬于O和OT百合雜種系。在GS值為0.632處，類群Ⅰ可進一步分為3個亞類群，類群Ⅱ可進一步分為2個亞類群：亞類群Ⅰa包含‘Tiny Moon’、‘Tiny Rocket’、‘Yellow Pearl’和‘Tiny Ghost’4個品種，均屬于A百合雜種系；亞類群Ⅰb包含‘Sweet Valley’、‘Mingo Orange’、‘Summer Snow’、‘Sweet Sugar’、‘Eyeliner’、‘Dynamix’、‘Acumen’、‘Mistery Dream’和‘Summer Sky’9個品種，均屬于LA百合雜種系；亞類群Ⅰc包含‘Tiny Padhye’和‘Tiny Bee’2個品種，均屬于A百合雜種系；亞類群Ⅱa包含‘Sorbone’、‘Siberia’、‘Sunny Azores’、‘After Eight’、‘Sunny Martinique’、‘Lotus Wonder’、‘Snowboard’、‘White Eyes’、‘Monica’、‘Aisha’、‘Lsabella’、‘Palazzo’、‘Robina’、‘Exotic Sun’、‘Conca D’or’、‘Zambesi’16個品種，屬于O和OT百合雜種系；亞類群Ⅱb僅包含‘Friso’1個品種，屬于OT百合雜種系。

圖1 基于SRAP標記的32個百合品種的UPGMA聚類圖

2.3 指紋圖譜構(gòu)建

在篩選出的17對多態(tài)性引物中，引物ME11-EM8可將32個百合品種完全區(qū)分開，其對32個百合品種DNA的擴增結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：基于引物ME11-EM8擴增出的32個百合品種的DNA擴增條帶清晰，可用于指紋圖譜構(gòu)建。

M: DL2000 DNA marker.1：‘Tiny Moon’；2：‘Tiny Rocket’；3：‘Tiny Padhye’；4：‘Tiny Bee’；5：‘Tiny Ghost’；6：‘Yellow Pearl’；7：‘Sweet Valley’；8：‘Dynamix’；9：‘Mingo Orange’；10：‘Summer Sky’；11：‘Summer Snow’；12：‘Sweet Sugar’；13：‘Eyeliner’；14：‘Acumen’；15：‘Mistery Dream’；16：‘Siberia’；17：‘Sorbone’；18：‘Sunny Azores’；19：‘After Eight’；20：‘Sunny Martinique’；21：‘Lotus Wonder’；22：‘Lsabella’；23：‘Snowboard’；24：‘Monica’；25：‘Aisha’；26：‘White Eyes’；27：‘Exotic Sun’；28：‘Conca D’or’；29：‘Palazzo’；30：‘Zambesi’；31：‘Robina’；32：‘Friso’.

選擇引物ME11-EM8擴增出的18個清晰明顯的多態(tài)性條帶構(gòu)建32個百合品種的DNA指紋圖譜，多態(tài)性條帶的DNA片段長度分別為75、110、126、146、158、170、176、187、197、216、217、238、257、277、293、304、359和410 bp，結(jié)果見圖3。統(tǒng)計結(jié)果顯示：引物ME11-EM8擴增出18個多態(tài)性條帶，則出現(xiàn)2個品種的指紋圖譜完全相同的概率為P=1/218，指紋圖譜的置信概率高達99.99%。

1：‘Tiny Moon’；2：‘Tiny Rocket’；3：‘Tiny Padhye’；4：‘Tiny Bee’；5：‘Tiny Ghost’；6：‘Yellow Pearl’；7：‘Sweet Valley’；8：‘Dynamix’；9：‘Mingo Orange’；10：‘Summer Sky’；11：‘Summer Snow’；12：‘Sweet Sugar’；13：‘Eyeliner’；14：‘Acumen’；15：‘Mistery Dream’；16：‘Siberia’；17：‘Sorbone’；18：‘Sunny Azores’；19：‘After Eight’；20：‘Sunny Martinique’；21：‘Lotus Wonder’；22：‘Lsabella’；23：‘Snowboard’；24：‘Monica’；25：‘Aisha’；26：‘White Eyes’；27：‘Exotic Sun’；28：‘Conca D’or’；29：‘Palazzo’；30：‘Zambesi’；31：‘Robina’；32：‘Friso’.

3 討論和結(jié)論

品種鑒定在植物育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面具有重要意義，是保護植物品種權(quán)、防止假冒劣質(zhì)品種進入市場的重要手段[21,22]。常用的品種鑒定方法有形態(tài)學鑒定、細胞學鑒定、生理生化鑒定和分子標記鑒定[23]。其中，分子標記鑒定法從DNA水平揭示了基因組結(jié)構(gòu)和排列的特點及堿基序列差異，檢測位點數(shù)量多，穩(wěn)定性和可靠性較好[24]。本研究篩選到的17對多態(tài)性SRAP引物共擴增出177個多態(tài)性條帶，平均每對引物擴增10.4個多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性條帶數(shù)多于石斛蘭(DendrobiumnobileLindl.)[25]和孤挺花(HippeastrumhybridumHort.)[26]等花卉。17對引物的平均多態(tài)性信息含量指數(shù)(PIC)為0.330 6，且每對引物的PIC值均大于0.25，根據(jù)Botstein等[27]提出的度量基因座位變異程度的多態(tài)性信息含量標準(當0.25

百合品種資源豐富，遺傳背景復雜。本研究中，32個百合品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)為0.356～0.836，平均值為0.561，說明這些進口的觀賞百合品種在DNA水平上存在豐富的遺傳多樣性。在32個百合品種中，同一雜種系的品種間的GS最小值均大于0.54，說明同一雜種系的百合品種具有更近的親緣關(guān)系，遺傳背景可能更加相似。聚類分析結(jié)果顯示：在GS值為0.578處，32個百合品種可分為2個類群，其中，亞洲百合雜種系(A)和鐵炮百合與亞洲百合雜種系(LA)的品種聚為類群Ⅰ，東方百合雜種系(O)和東方百合與喇叭百合雜種系(OT)的品種聚為類群Ⅱ，聚類結(jié)果與百合的雜交育種史相吻合，也與Cui等[28]和肖偉等[3]基于ISSR標記研究的不同百合雜種系間的遺傳關(guān)系的結(jié)果一致。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在GS值為0.632處，類群Ⅱ可進一步被分為2個亞類群，其中，亞類群Ⅱb僅包含‘Friso’1個品種，說明‘Friso’與其他供試的O和OT百合雜種系品種間的親緣關(guān)系較遠，在未來百合新品種的選育中，其可作為特殊的親本材料以增加新品種間的遺傳差異。

DNA指紋圖譜構(gòu)建的原則是用盡可能少的引物區(qū)分盡可能多的品種[29]。在本研究篩選到的17對多態(tài)性引物中，引物ME11-EM8可將32個百合品種完全區(qū)分開，基于其擴增出的18個多態(tài)性條帶構(gòu)建了32個百合品種的DNA指紋圖譜，指紋圖譜的置信概率高達99.99%，說明構(gòu)建的DNA指紋圖譜在鑒定百合品種上具有很好的準確性。當然，隨著百合品種數(shù)量的增加，需要不斷選擇和增加核心引物，適時擴充百合品種的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，以保證指紋圖譜數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。

綜上所述，引物ME11-EM8可將32個百合品種完全區(qū)分開，依據(jù)其構(gòu)建的DNA指紋圖譜在鑒定百合品種上具有很好的準確性，可用于百合品種資源的鑒定；在未來百合新品種的選育中，‘Friso’可作為特殊的親本材料以增加新品種間的遺傳差異。