抗早1 號對DEHP 聯(lián)合BPA 誘導(dǎo)的雌性性早熟大鼠的治療作用及機(jī)制研究

鄭月琳 盛麗先 王其莉 何蓓暉

性早熟是兒童內(nèi)分泌?？谱畛Ｒ姷木驮\原因之一[1]。研究顯示，女孩和男孩性早熟發(fā)病率分別高達(dá)11.47%和3.26%[2]。性早熟的發(fā)病原因復(fù)雜，與遺傳、性別、肥胖等相關(guān)，同時(shí)也受到環(huán)境因素的影響。如已被證實(shí)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（EEDs）與兒童性早熟的發(fā)生有密切關(guān)系[3]。日常生活中常見的EEDs 有鄰苯二甲酸酯（PAEs）、雙酚A（BPA）等，其中PAEs 代表物質(zhì)包括鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）、鄰苯二甲酸二酯（DEHP）等，廣泛存在于各類塑料制品及玩具中，不但可造成女童性早熟，也可能造成男童性發(fā)育異常[3-4]。全國名老中醫(yī)盛麗先教授在長期臨床診治中，自擬經(jīng)驗(yàn)方抗早1 號治療性早熟，取得了顯著的療效。本文通過建立DEHP 聯(lián)合BPA 誘導(dǎo)的雌性性早熟大鼠模型，探討抗早1 號對染毒性早熟模型尿PAEs 相關(guān)代謝產(chǎn)物的影響及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 32 只雌性SD 大鼠購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，21 日齡，體質(zhì)量50～59 g，無特定病原體級。動(dòng)物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，相對濕度55%，溫度25 ℃，自然光照，自由進(jìn)食及進(jìn)水。本研究通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)審核備案（批準(zhǔn)號：IACUC-20200506-17）。

1.2 藥 物 抗早1 號由生地黃、炙龜板、黃柏、知母、茯苓各9 g，澤瀉、柴胡、路路通各6 g 組成，中藥材飲片由浙江省中醫(yī)院中藥房提供并負(fù)責(zé)煎煮，水煎液藥物濃度為1.0 g/mL。

1.3 主要儀器及試劑 超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧離子源（美國Waters 公司，型號：UPLC-TQ Detector），由杭州譜勝檢測科技有限公司檢測。DEHP 和BPA（上海阿拉丁生化有限公司，批號D294897、B108653）；黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）試劑盒（南京建成公司，批號H206-1-1、H102-1）；磷酸二氫鈉（分析純）（批號7558-80-7）、磷酸氫二鈉（分析純）（批號7558-79-4）、乙酸銨（分析純）（批號631-61-8）、甲醇（色譜純）（批號67-56-1）、乙腈（色譜純）（批號75-05-8）、甲酸（色譜純）（批號64-18-6）、乙酸（色譜純）（批號64-19-7）、β-葡萄糖醛酸脫氫酶（批號BGALS-RO）均購于德國Merck 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模 32 只雌性21 日齡未成熟大鼠，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，模型組，抗早1 號低、高劑量組，每組8 只。模型組及抗早1 號低、高劑量組均于21 日齡予DEHP 400mg/kg 加BPA 200mg/kg聯(lián)合灌胃，1 次/d，共7 d，建立性早熟大鼠模型[5-6]?？乖? 號低、高劑量組于28 日齡灌胃給藥干預(yù)，模型組和正常組予等劑量生理鹽水灌胃，抗早1 號高、低劑量組大鼠分別灌服濃度10.08、5.04 mg/（g·次），灌胃量均為1.2 mL/（只·次），1 次/d。共干預(yù)7 d。DEHP染毒后的24 h 開始，每天檢查并記錄四組大鼠陰道開口情況。給藥7 d 后，留取各組大鼠24 h 尿液，大鼠稱重。采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉。腹主動(dòng)脈取血，處死大鼠后進(jìn)行相關(guān)檢測。

2.2 HE 染色觀察子宮、卵巢病理學(xué)改變 各組大鼠麻醉后處死，迅速分離卵巢、子宮，稱重后，甲醛溶液固定，經(jīng)脫水后，常規(guī)石蠟包埋切片（3 μm），蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察大鼠卵巢卵泡發(fā)育情況。計(jì)算子宮、卵巢系數(shù)，器官系數(shù)=器官濕質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測血清LH、E2 水平 各組大鼠取動(dòng)脈血，4 ℃下4000 r/min 離心10 min后，分離血清待用。各孔加入血清/標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，然后加入生物素抗原工作液50 μL，輕輕搖晃，蓋上封板膜，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。第1 次洗滌，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加入洗滌液，靜置30 s 后棄去，重復(fù)5 次，拍干。加入50 μL 親和素-辣根過氧化物酶到各孔中，輕輕搖晃，蓋上封板膜，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。第2 次洗滌，步驟同上。顯色：每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，37 ℃避光顯色10 min。每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm 波長測定各孔吸光度（OD 值）。

2.4 DEHP 代謝物檢測 各組大鼠分別加入防腐劑后收集24 h 尿液，離心后吸取1 mL 尿液于2 mL EP 管中，加入10 μL 混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液和200 μL 1 mol/L 乙酸銨水溶液（pH 5.0）以及10 μL β-葡萄糖醛酸脫氫酶；混合物渦旋1 min 后放置于37 ℃恒溫水浴箱中過夜酶解。并過濾凈化后，經(jīng)反相色譜柱通過梯度洗脫分離測定尿中PAEs 代謝產(chǎn)物水平，具體代謝物見表1。

表1 鄰苯二甲酸酯代謝產(chǎn)物

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組均數(shù)比較，方差齊時(shí)，采用SNK（Student-Newman-Keuls）檢驗(yàn)法；方差不齊時(shí)，采用秩和（Kruskal-Wallis）檢驗(yàn)法。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 抗早1 號對性早熟大鼠陰道開口時(shí)間、子宮和卵巢系數(shù)的影響 觀察四組陰道開口情況，模型組平均陰道開口時(shí)間較正常組明顯提前（P＜0.01）。與正常組比較，病理光鏡下發(fā)現(xiàn)，性早熟模型組大鼠的子宮壁增厚，子宮腺體增多，局部可見上皮細(xì)胞空泡化，提示DEHP+BPA 誘導(dǎo)的雌性性早熟大鼠造模成功。與模型組比較，抗早1 號低、高劑量組均有延緩陰道開口時(shí)間的作用（P＜0.01）。與正常組比較，模型組的子宮系數(shù)顯著升高（P＜0.05），卵巢系數(shù)有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)抗早1 號治療后，子宮、卵巢系數(shù)明顯下降，其中抗早1 號高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）。見表2。

表2 抗早1 號對陰道開口時(shí)間、子宮和卵巢系數(shù)的影響（）

表2 抗早1 號對陰道開口時(shí)間、子宮和卵巢系數(shù)的影響（）

注：模型組及抗早1 號低、高劑量組均于21 日齡給予鄰苯二甲酸二酯400 mg/kg 加雙酚A 200 mg/kg 聯(lián)合灌胃；28 日齡模型組和正常組予1.2 mL/只生理鹽水灌胃，抗早1 號低、高劑量組分別灌服濃度5.04、10.08 mg/（g·次）抗早1 號，灌胃量均為1.2 mL/只；與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

3.2 抗早1 號對性早熟大鼠子宮和卵巢病理的影響與正常組比較，模型組大鼠子宮壁增厚，局部可見上皮細(xì)胞空泡化。與模型組比較，抗早1 號低、高劑量組子宮壁厚度降低。與正常組比較，模型組可見較多的生長卵泡與成熟卵泡。與模型組比較，抗早1 號低、高劑量組卵泡數(shù)量減少。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮、卵巢病理圖（蘇木精-伊紅染色，×100）

3.3 抗早1 號對性早熟大鼠血清E2、LH 的影響與正常組比較，模型組血清E2、LH 顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。經(jīng)抗早1 號低劑量治療后，血清E2 明顯降低（P＜0.05），LH 也下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；抗早1 號高劑量治療后，血清E2 和LH 明顯降低（P＜0.01）。見表3。

表3 抗早1 號對性早熟大鼠血清E2、LH 的影響（）

表3 抗早1 號對性早熟大鼠血清E2、LH 的影響（）

注：模型組及抗早1 號低、高劑量組均于21 日齡給予鄰苯二甲酸二酯400 mg/kg 加雙酚A 200 mg/kg 聯(lián)合灌胃；28 日齡模型組和正常組予1.2 mL/只生理鹽水灌胃，抗早1 號低、高劑量組分別灌服濃度5.04、10.08 mg/（g·次）抗早1 號，灌胃量均為1.2 mL/只；E2 為雌二醇；LH 為黃體生成素；與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

3.4 抗早1 號對性早熟大鼠尿PAEs 代謝產(chǎn)物的影響 與正常組比較，模型組大鼠尿PAEs 代謝產(chǎn)物MEHP、MEOHP、MEHHP、MECPP、MCMHP 顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，抗早1 號低、高劑量組尿MEHP、MEOHP、MEHHP、MECPP、MCMHP 顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 抗早1 號對性早熟大鼠尿PAEs 代謝產(chǎn)物的影響（μg/mL，）

表4 抗早1 號對性早熟大鼠尿PAEs 代謝產(chǎn)物的影響（μg/mL，）

注：模型組及抗早1 號低、高劑量組均于21 日齡予鄰苯二甲酸二酯400 mg/kg 加雙酚A 200 mg/kg 聯(lián)合灌胃；28 日齡模型組和正常組予1.2 mL/只生理鹽水灌胃，抗早1 號低、高劑量組分別灌服濃度5.04、10.08 mg/（g·次）抗早1 號，灌胃量均為1.2 mL/只；PAEs 為鄰苯二甲酸酯；MEHP 為鄰苯二甲酸單乙基己基酯；MEOHP 為鄰苯二甲酸單乙基酮基己基酯；MEHHP 為鄰苯二甲酸單乙基羥基己基酯；MECPP 為鄰苯二甲酸乙基羥基戊基酯；MCMHP 為單鄰苯二甲羥基己基酯；與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

4 討論

性早熟是兒童提早出現(xiàn)第二性征發(fā)育的內(nèi)分泌異常性疾病，對患兒身心健康可產(chǎn)生不良影響，加劇家長焦慮情緒及社會(huì)醫(yī)療支出[7]。性早熟的發(fā)病，特別是中樞性性早熟具體病因及分子機(jī)制尚不明確，現(xiàn)EEDs 已被證實(shí)與兒童性早熟的發(fā)生有密切關(guān)系[3]。DEHP 和BPA 是最常見的EEDs，有雌激素樣作用，可在城市用水、空氣、日常用品、植物蔬菜及動(dòng)物體內(nèi)廣泛檢測出[8-10]。實(shí)驗(yàn)證明，DEHP 進(jìn)入體內(nèi)代謝為MEHP，后者可作用于細(xì)胞表面雌激素受體α，干擾DNA 甲基化，進(jìn)而刺激細(xì)胞異常增殖、分化，而這種毒性作用呈濃度依賴性[8-9]。BPA 作為世界上最高產(chǎn)量的化學(xué)品之一，同樣具有類雌激素樣作用，BPA 在性早熟中的致病機(jī)制近年成為研究熱點(diǎn)[10]。本實(shí)驗(yàn)中以未成熟SD 雌性大鼠（21 日齡，青春前期）作為造模開始的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，這個(gè)時(shí)期大鼠對EEDs 的敏感程度明顯增高。另外，鑒于正常大鼠的平均陰道開口時(shí)間為35 d 左右，故選擇28 日齡作為給藥的干預(yù)節(jié)點(diǎn)。觀察四組陰道開口情況，性早熟模型組平均陰道開口時(shí)間較正常組明顯提前，說明DEHP+BPA 誘導(dǎo)的雌性性早熟模型大鼠造模成功。同時(shí)，與正常組比較，病理光鏡下發(fā)現(xiàn)，性早熟模型組大鼠的子宮壁增厚，子宮腺體增多，局部可見上皮細(xì)胞空泡化，也提示造模成功。

目前國內(nèi)外普遍采用促性腺激素釋放激素類似物治療中樞性性早熟，在療效和安全性上具有明顯的優(yōu)勢，在我國也有極其廣泛的應(yīng)用[1，11]。但其使用有嚴(yán)格的適應(yīng)證，且存在價(jià)格昂貴，療程長，依從性差等缺點(diǎn)，而大量臨床實(shí)驗(yàn)證明中醫(yī)辨治性早熟安全有效[12-13]?？乖? 號主要藥物為生地、炙龜板、黃柏、知母、柴胡、路路通、茯苓、澤瀉。方中黃柏、知母瀉相火；生地、龜板滋腎陰；柴胡、路路通疏肝氣；澤瀉、茯苓瀉降濕濁。盛教授總結(jié)，天癸是以腎精充沛為基礎(chǔ)，并由腎氣激發(fā)而產(chǎn)生，它可以促進(jìn)性腺外觀及內(nèi)在功能發(fā)育成熟旺盛。天癸提前形成成熟，會(huì)使兒童提前出現(xiàn)月經(jīng)等情況，其中醫(yī)病機(jī)與西醫(yī)“下丘腦-垂體-性腺軸”的萌動(dòng)在功能和空間特性上具有相似之處。中醫(yī)的“腎陰虛相火旺”即為性調(diào)節(jié)軸的失調(diào)、亢進(jìn)。EEDs 誘發(fā)性早熟的中醫(yī)病機(jī)為腎陰不足，相火上亢，肝郁氣滯，濕濁內(nèi)阻?？乖? 號全方合奏，正是治以滋陰降火，疏肝泄?jié)?，達(dá)到抑制性早熟的作用。

本研究通過干預(yù)DEHP 聯(lián)合BPA 誘導(dǎo)建立的性早熟模型大鼠，明確抗早1 號顯著延緩性早熟大鼠陰道開口時(shí)間及性腺發(fā)育。與模型組比較，抗早1號可以降低血清LH、E2 值，同時(shí)可顯著降低尿PAEs代謝產(chǎn)物。我們據(jù)此推測抗早1 號可能通過加速體內(nèi)EEDS 的分解及排除，從而發(fā)揮防治性早熟的作用。