DNA脫堿基位點(diǎn)的檢測(cè)方法及其生物學(xué)研究進(jìn)展

武海江，張雅姣，袁舒妍，徐 華*，謝劍煒

（1．軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；2．沈陽(yáng)藥科大學(xué) 無(wú)涯創(chuàng)新學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

生理?xiàng)l件下，DNA會(huì)自發(fā)斷裂N-糖苷鍵脫去堿基（Apurinic/apyrimidinic，AP）形成AP位點(diǎn)損傷［1-7］（圖1A），據(jù)報(bào)道，平均每天每個(gè)哺乳細(xì)胞至少會(huì)產(chǎn)生10 000個(gè)內(nèi)源性AP位點(diǎn)［2，8］。當(dāng)DNA暴露于外源性物質(zhì)如酸、烷化劑、電離離子或紫外線后［9-12］均會(huì)使DNA脫去堿基并生成AP位點(diǎn)［13］（圖1B）。另外AP位點(diǎn)也是堿基切除修復(fù)（Base excision repair，BER）途徑的關(guān)鍵中間體［14］，如活性氧引起DNA氧化損傷的標(biāo)志物8-羥基-2′-脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷（8-OHdG）經(jīng)BER中特殊糖基化酶的切除而形成AP位點(diǎn)［13，15］（圖1C）。若AP位點(diǎn)未有效修復(fù)，可能會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶停滯和DNA鏈斷裂，產(chǎn)生突變和細(xì)胞毒性［1-2，13，16］，因此對(duì)AP的檢測(cè)有助于細(xì)胞損傷程度評(píng)估和化合物毒性評(píng)價(jià)［17-19］。近年來(lái)，由于交聯(lián)損傷的嚴(yán)重性，AP位點(diǎn)形成的DNA鏈間交聯(lián)（Interstrand crosslink，ICL）［20-27］和蛋白質(zhì)交聯(lián)［28-32］（DNAprotein crosslink，DPC）亦引起人們的重點(diǎn)關(guān)注。本課題組在前期工作中建立了細(xì)胞、血液、尿液及臟器中DNA加合物的質(zhì)譜定量方法，實(shí)現(xiàn)了各臟器中DNA損傷的定量評(píng)價(jià)［33-35］；構(gòu)建了組蛋白H2AX和H3磷酸化生物標(biāo)志物的穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物基因毒性的快速發(fā)現(xiàn)和定量檢測(cè)，并初步證明了該方法具有體外評(píng)價(jià)化學(xué)品致癌性的應(yīng)用潛力［36-37］。課題組近期還開(kāi)展了脫堿基位點(diǎn)交聯(lián)加合物（AP-base）的高靈敏LC-MS/MS分析，在細(xì)胞中首次鑒定3種新型AP-base，對(duì)不同類型細(xì)胞中AP-base本底值進(jìn)行了定量評(píng)價(jià)及相關(guān)毒物暴露研究［38］。

圖1 AP位點(diǎn)的形成機(jī)制：DNA自發(fā)脫堿基形成AP位點(diǎn)（A）；AP位點(diǎn)形成的潛在來(lái)源（B）；脫氧鳥(niǎo)苷（dG）與活性氧反應(yīng)生成8-OHdG，隨后經(jīng)DNA糖基化酶將8-OHdG切除后生成AP位點(diǎn)（C）Fig．1 Mechanisms of AP site formation：spontaneous base loss of DNA leads to the AP site formation（A），potential sources of base damage destabilizing the N-glyosidic bond and generating AP site（B），and deoxyguanosine（dG）reacted with reactive oxygen species to generate 8-OHdG，which is subsequently cleaved by DNA glycosylase to generate AP sites（C）R：DNA

AP位點(diǎn)的檢測(cè)方法主要有14C［39-40］或32P［41-42］后標(biāo)記法、含醛基反應(yīng)探針（Aldehyde-reactive probe，ARP）的酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA-like）［43-46］、熒光法［17-18，47-49］和液相色譜-質(zhì)譜法［50-54］等。其中，含ARP的ELISA-like方法是檢測(cè)和定量分析AP位點(diǎn)的重要方法，但其除標(biāo)記AP位點(diǎn)的開(kāi)鏈醛外［48，55-56］還會(huì)標(biāo)記其它含醛基的化合物，可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。近些年，質(zhì)譜法以其高靈敏和高特異的技術(shù)優(yōu)勢(shì)逐漸應(yīng)用于AP位點(diǎn)的分析檢測(cè)［50，57-58］。

本文對(duì)AP位點(diǎn)的定性和定量分析方法進(jìn)行了總結(jié)，對(duì)AP位點(diǎn)損傷在環(huán)境污染物及抗癌藥物的評(píng)價(jià)、細(xì)胞損傷和疾病相關(guān)的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。由于AP位點(diǎn)相關(guān)交聯(lián)（如ICL和DPC）存在潛在重要的生物學(xué)意義，本文亦重點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行了介紹。

1 脫堿基位點(diǎn)特點(diǎn)

每個(gè)細(xì)胞每天均可能產(chǎn)生成千上萬(wàn)的AP位點(diǎn)，其作為一種常見(jiàn)的DNA損傷形式，能對(duì)細(xì)胞的功能、基因組穩(wěn)定性和疾病產(chǎn)生較大影響，能有效阻斷聚合酶并影響其對(duì)基因組信息的讀取和復(fù)制，是致突變的潛在源頭之一［13］。

AP位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)以閉鏈縮醛形式（99%）和開(kāi)鏈醛（1%）兩者的平衡形式存在（圖2）［4］。由于氫鍵及其他非共價(jià)相互作用的缺失，AP位點(diǎn)會(huì)使DNA雙鏈變得不穩(wěn)定。AP位點(diǎn)自身親電且具有化學(xué)不穩(wěn)定性，例如，DNA的AP位點(diǎn)在生理?xiàng)l件（pH 7．4，37℃）下的半衰期約為200 h［59］，在加熱處理或弱堿處理時(shí)會(huì)加速DNA鏈在AP位點(diǎn)的斷裂［60-62］，在酸性條件下也會(huì)通過(guò)脫嘌呤產(chǎn)生額外的AP位點(diǎn)。

圖2 AP位點(diǎn)在水溶液中的平衡態(tài)存在形式：閉鏈縮醛和開(kāi)鏈醛［4］Fig．2 The equilibrating forms of AP site in aqueous solution：close-chain acetal and open-chain aldehyde［4］

除了產(chǎn)生鏈斷裂，由于AP位點(diǎn)的化學(xué)反應(yīng)活性，AP位點(diǎn)的開(kāi)鏈醛還會(huì)分別與蛋白質(zhì)或DNA互補(bǔ)鏈上的堿基發(fā)生共價(jià)反應(yīng)形成DPCs和ICLs，從而形成更嚴(yán)重的損傷類型［2，19］。目前，細(xì)胞有多種修復(fù)和耐受機(jī)制以應(yīng)對(duì)DNA損傷，雙鏈DNA中的AP位點(diǎn)大多數(shù)通過(guò)BER途徑進(jìn)行修復(fù)，核苷酸切除修復(fù)（NER）則作為備用途徑［14］。近期，對(duì)AP位點(diǎn)的修復(fù)和耐受途徑研究已有評(píng)述報(bào)道［13］。

2 脫堿基位點(diǎn)作為中間體形成的交聯(lián)

相比于其它DNA損傷如DNA加合物、堿基錯(cuò)配和堿基損傷等類型，DNA鏈間交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的研究報(bào)道較少［28-29］。但由于DNA交聯(lián)以及DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)可導(dǎo)致嚴(yán)重的基因毒性，近年來(lái)其研究越來(lái)越受到重視［28］，AP位點(diǎn)作為最常見(jiàn)的DNA損傷類型之一，與其相關(guān)的ICL和DPC交聯(lián)現(xiàn)象已成為研究重點(diǎn)［29，31］。

2.1 AP位點(diǎn)形成的DNA交聯(lián)

DNA鏈間交聯(lián)是最嚴(yán)重的DNA損傷類型之一，其形成會(huì)影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄［2］。由于AP位點(diǎn)存在兩種互變平衡結(jié)構(gòu)（圖2），DNA中AP位點(diǎn)的開(kāi)鏈醛可與互補(bǔ)鏈上的堿基發(fā)生共價(jià)加合形成ICL（圖3）。

圖3 由AP位點(diǎn)作為中間體形成ICL的形成機(jī)制及對(duì)應(yīng)生成的交聯(lián)加合物Fig．3 The formation mechanisms of ICL derived from the AP site as intermediate and the corresponding crosslinked adducts

Dutta等［27］首次在無(wú)外源分子參與情況下清晰表征了DNA鏈間交聯(lián)情況，隨后運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)和凝膠電泳技術(shù)證明AP位點(diǎn)可分別與鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤的環(huán)外氨基發(fā)生反應(yīng)，形成AP-dG和AP-dA的ICL［20-21］（圖3A、3B），同時(shí)利用核磁共振技術(shù)表征了形成的ICL交聯(lián)加合物（圖3D）［63-64］。通過(guò)考察AP-dG和AP-dA交聯(lián)加合物的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)這兩類交聯(lián)加合物在pH 7．0、37℃時(shí)相當(dāng)穩(wěn)定，意味著AP-dG ICL和AP-dA ICL可能是一種持久損傷，可能導(dǎo)致DNA的復(fù)制阻滯［63-64］。研究又通過(guò)可以耦合DNA合成和鏈置換的噬菌體φ29 DNA聚合酶作為模型系統(tǒng)測(cè)試了AP-dA交聯(lián)影響DNA加工酶的能力，證明AP位點(diǎn)形成的交聯(lián)能阻斷細(xì)胞中各種DNA加工酶的作用［65］。

最近，Hu等［66］利用高分辨質(zhì)譜技術(shù)在小牛胸腺DNA（Calf thymus DNA，CT-DNA）酶解樣品中檢出了AP位點(diǎn)與胞嘧啶殘基反應(yīng)形成的交聯(lián)加合物（AP-dC）［66-67］。Varela等［24］隨后也證明了AP位點(diǎn)的醛基可與互補(bǔ)鏈上已錯(cuò)配胞嘧啶的環(huán)外氨基發(fā)生反應(yīng)，形成AP-dC ICL（圖3C）。值得注意的是，研究表明，當(dāng)胞嘧啶殘基與鳥(niǎo)嘌呤發(fā)生正常沃森-克里克配對(duì)時(shí)，這二者并不能形成交聯(lián)。

目前，AP-dG、AP-dA和AP-dC等3種ICLs的形成僅在溶液體系中被鑒定，但細(xì)胞中是否存在上述鏈間交聯(lián)及其結(jié)構(gòu)特性如何仍屬未知［19，24］。對(duì)不同寡核苷酸序列的研究表明AP-dA、AP-dG形成交 聯(lián)的 產(chǎn)率 分別 為15%~85%［21］和2%~3%［20，27］，經(jīng)NaCNBH3還原 后 的AP-dG交聯(lián) 產(chǎn)率 為20%左右［20，27］?？紤]到細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下會(huì)產(chǎn)生至少10 000個(gè)AP位點(diǎn)［2，8］，研究者們推斷在細(xì)胞中可能會(huì)檢測(cè)到AP位點(diǎn)交聯(lián)加合物，但對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提出了更高要求［19，66］。Huskova等［22］通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究了AP-ICL的形成速率、產(chǎn)量和穩(wěn)定性，揭示AP位點(diǎn)周圍富含腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對(duì)（AT）比富含鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶堿基對(duì)（GC）的區(qū)域更易形成AP-ICL，并基于AP-ICL形成的生化實(shí)驗(yàn)，推斷在人體細(xì)胞中存在或可形成1~5個(gè)ICLs。相比其它常見(jiàn)的DNA損傷類型，由AP位點(diǎn)作為中間體形成的DNA鏈間交聯(lián)是一種更為嚴(yán)重的DNA損傷，這種交聯(lián)在細(xì)胞中存在的可能性及其可能引起的生物學(xué)結(jié)局值得重點(diǎn)關(guān)注。

2.2 AP位點(diǎn)形成的蛋白質(zhì)交聯(lián)

DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)是蛋白質(zhì)和DNA中1條鏈發(fā)生共價(jià)加合形成的一種交聯(lián)，也是嚴(yán)重的DNA損傷類型之一，同樣會(huì)阻滯DNA復(fù)制和翻譯。受到檢測(cè)技術(shù)重復(fù)性、靈敏性和特異性等方面的限制，與其它的DNA損傷類型相比，DPC的研究相對(duì)較少［13，29］。AP位點(diǎn)可在細(xì)胞和組織中自發(fā)產(chǎn)生，是多種生理過(guò)程中形成的最普遍的DNA損傷之一。由于AP位點(diǎn)與核小體中的組蛋白非常接近，以AP為中間體形成的DPC已被重點(diǎn)研究報(bào)道，如AP-Lys和AP-Cys（圖4）［28，32，68］。Chan等［28］用同位素稀釋LC-MS/MS方法首次從細(xì)胞中檢出新型的由AP位點(diǎn)與蛋白質(zhì)的半胱氨酸（Cys）殘基發(fā)生反應(yīng)形成的AP-Cys交聯(lián)，從HeLa細(xì)胞（Human cervix adenocarcinoma cell）中測(cè)得AP-Cys DPCs的本底含量為5．45個(gè)/107nts。近期，Chan等［32］再次利用LC-MS/MS方法首次定量分析了細(xì)胞內(nèi)AP位點(diǎn)與賴氨酸（Lys）殘基反應(yīng)形成的DPCs，檢測(cè)到HeLa細(xì)胞中AP-Lys DPCs的本底含量為0．03個(gè)/107nts。結(jié)果表明，在HeLa細(xì)胞中AP-Cys DPCs的含量高于AP-Lys DPCs，且與近期文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)胞中本底AP位點(diǎn)數(shù)目接近。此外，Tang等［69］基于DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)測(cè)序技術(shù)，利用AP位點(diǎn)與Lys殘基共價(jià)結(jié)合的特點(diǎn)，應(yīng)用于人類HEK293T細(xì)胞（Human embryonic kidney 293T cell）中胸苷乙二醇的全基因組圖譜繪制。表1列出了采用不同方法對(duì)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物組織中AP位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果及特征分析比較。

圖4 由AP位點(diǎn)作為中間體形成的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)形成機(jī)制及對(duì)應(yīng)生成的交聯(lián)加合物Fig．4 The formation mechanisms of DNA-protein crosslink derived from the AP site as intermediate and the corresponding crosslinked adducts

DPCs交聯(lián)的形成與修復(fù)機(jī)制亦值得深入研究，研究發(fā)現(xiàn)AP位點(diǎn)也可與多種修復(fù)酶如5′-脫氧核糖-5-磷酸/脫堿基裂解酶（KU）［70］、DNA聚合酶β（Pol β）［71］和多聚ADP核糖聚合酶1/2（PARP1/2）［72-73］等形成交聯(lián)，形成的DPC通常被認(rèn)為是有害或短暫的中間體，且與AP位點(diǎn)的修復(fù)相關(guān)［31］。目前對(duì)AP位點(diǎn)作為中間體形成DPC的化學(xué)結(jié)構(gòu)或生物學(xué)結(jié)局的了解很有限，仍亟待開(kāi)發(fā)相應(yīng)的檢測(cè)方法并深入研究［29，31］。

3 DNA脫堿基位點(diǎn)的檢測(cè)方法

當(dāng)前檢測(cè)AP位點(diǎn)主要基于以下兩種方式。一種是非共價(jià)方式，依靠試劑與DNA分子間的氫鍵、范德華力和靜電引力等弱相互作用力，使檢測(cè)分子能夠進(jìn)入AP位點(diǎn)，通過(guò)改變檢測(cè)分子的物理信號(hào)（如熒光和電化學(xué)），進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)AP位點(diǎn)的標(biāo)記檢測(cè)［74］。另一種是共價(jià)標(biāo)記AP位點(diǎn)的方式，依靠不同含氨基基團(tuán)的標(biāo)記試劑分子與AP位點(diǎn)的開(kāi)鏈醛發(fā)生反應(yīng)形成相對(duì)穩(wěn)定的共價(jià)亞胺（通常稱為席夫堿）［75-77］（圖5），并進(jìn)一步利用不同技術(shù)檢測(cè)標(biāo)記分子實(shí)現(xiàn)對(duì)AP位點(diǎn)的分析。由于非共價(jià)標(biāo)記方式基于弱相互作用力，其結(jié)合能力普遍低于共價(jià)反應(yīng)探針，因此目前研究報(bào)道以共價(jià)標(biāo)記方式居多，本文主要概述利用共價(jià)標(biāo)記AP位點(diǎn)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展。

圖5 標(biāo)記DNA脫堿基位點(diǎn)示意圖Fig．5 Schematic of labeling DNA abasic site

AP位點(diǎn)的重要檢測(cè)方法有14C或32P標(biāo)記法、ELISA-like分析法、熒光分析法和LC-MS法等，其各具優(yōu)勢(shì)和不足。其中，ELISA-like分析法是用于檢測(cè)和定量分析AP位點(diǎn)的常用方法之一，近年來(lái)，隨著高特異和高靈敏質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜方法正逐漸成為AP位點(diǎn)檢測(cè)的主流方法。

3.1 14C或32P后標(biāo)記法

14C標(biāo)記法是利用同位素閃爍計(jì)數(shù)技術(shù)對(duì)AP位點(diǎn)的醛基基團(tuán)和14C甲氧胺反應(yīng)形成的肟類化合物進(jìn)行檢測(cè)。該方法靈敏度和特異性均較低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)AP位點(diǎn)的準(zhǔn)確定量［39-40，52］。Weinfeld等［42］使用32P后標(biāo)記法可在fmol水平對(duì)DNA中的AP位點(diǎn)進(jìn)行定量分析，方法靈敏度較高，但該方法需進(jìn)行核酸凝膠電泳和色譜分離等前處理操作，費(fèi)時(shí)耗力，且涉及放射性污染等問(wèn)題［41］。因此，目前鮮有關(guān)于上述兩種標(biāo)記方法的報(bào)道。

3.2 ELISA-like分析法

為應(yīng)對(duì)上述14C或32P后標(biāo)記法的不足，Kubo等［78］于1992年構(gòu)建了一種生物素標(biāo)記的含醛反應(yīng)性探針（ARP）的ELISA-like方法。其原理是利用生物素標(biāo)記探針的羥胺基團(tuán)與DNA中AP位點(diǎn)發(fā)生加合反應(yīng)，然后使用偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的抗生物素蛋白作為指示酶，通過(guò)ELISA-like方法對(duì)生物素標(biāo)記的AP位點(diǎn)進(jìn)行比色測(cè)定［43，78］。

該方法靈敏度較高且操作簡(jiǎn)單，因此基于其改進(jìn)的方法相繼被用于檢測(cè)和定量分析AP位點(diǎn)或含其它醛基的潛在DNA損傷［46，53，79-81］。Kubo等［78］在熱解或酸解后的CT-DNA或噬菌體f1 DNA中檢測(cè)到fmol水平的AP位點(diǎn)，該方法無(wú)需使用一抗和二抗，通過(guò)指征指示劑酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白/生物素復(fù)合物直接檢測(cè)生物素和DNA的含量即可測(cè)定AP位點(diǎn)。Kubo等［44］在HeLa RC355細(xì)胞（具輻射抗性的HeLa細(xì)胞株）中測(cè)得的AP位點(diǎn)為＜1個(gè)/105nts［43］，在HeLa細(xì)胞中為5個(gè)/106nts（0．1 fmol）。

ELISA-like方法雖有較多應(yīng)用，但由于缺乏特異性［48，55-56］，尚存在諸多局限：①該方法所使用的生物素在細(xì)胞中也同樣存在［49］；②ARP的結(jié)構(gòu)空間體積較大［52］，因此ARP很可能因位阻導(dǎo)致未與AP位點(diǎn)充分反應(yīng)；③DNA中存在的除AP位點(diǎn)之外的DNA氧化產(chǎn)物［82］、其它含醛基化合物如5-甲?；奏ぃ?fC）和5-甲?；蜞奏ぃ?fU）亦可能被錯(cuò)誤標(biāo)記［56，83-84］，存在假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。因此，近年來(lái)出現(xiàn)了基于其它原理的高特異性方法的報(bào)道和應(yīng)用。

3.3 熒光分析法

相比于ELISA-like分析法，目前用于定量分析AP位點(diǎn)的熒光分析法應(yīng)用仍較少，多數(shù)研究主要集中在如何提高檢測(cè)方法的靈敏度和特異性［48-49］。熒光分析法通過(guò)設(shè)計(jì)能與AP位點(diǎn)的開(kāi)鏈醛反應(yīng)的熒光探針?lè)肿?，?duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)并實(shí)現(xiàn)對(duì)AP位點(diǎn)的測(cè)定［18，48］。

使用常規(guī)含賴氨酸-羅丹明［18］和熒光素［85］標(biāo)記的熒光分析方法分別能檢測(cè)到129 fmol和17 fmol水平的AP位點(diǎn)，其實(shí)驗(yàn)操作所需時(shí)間雖比ELISA-like分析法少，但靈敏度較低，且所需DNA樣品量較大，洗滌后也難以避免痕量熒光探針的存在，從而影響分析結(jié)果。Fundador等［17］利用激光誘導(dǎo)熒光的毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)熒光團(tuán)-ARP標(biāo)記的AP位點(diǎn)，靈敏度較前述熒光方法明顯提高，檢出限可達(dá)1．2個(gè)AP位點(diǎn)/106nts（0．02 fmol），但受限于必須采用合適的抗體，該方法的普適性較低。

最近，Liu等［48］測(cè)試了含萘二甲酰亞胺熒光標(biāo)簽的羥胺探針?lè)肿优cDNA中含醛基或酮基的化合物的反應(yīng)能力，發(fā)現(xiàn)其均能與AP位點(diǎn)、5fU和5fC發(fā)生反應(yīng)，三者反應(yīng)效率并無(wú)較大差別。而以往研究報(bào)道中使用的羥胺或烷氧胺試劑僅標(biāo)記了AP位點(diǎn)［18，47］、5fU［51，86］和5fC［87］中的一種化合物，推測(cè)其原因可能是實(shí)驗(yàn)未考慮DNA中所有含醛基化合物或優(yōu)化特殊反應(yīng)條件所致［48］。因此，利用熒光分析法準(zhǔn)確檢測(cè)AP位點(diǎn)或其它含醛基化合物時(shí)，除考慮適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)簽外，必須考慮結(jié)合特殊的反應(yīng)條件以評(píng)估和優(yōu)化熒光標(biāo)記分子與目標(biāo)物的反應(yīng)效率［49，88］。

3.4 液相色譜-質(zhì)譜法

液相色譜-質(zhì)譜法是利用烷氧胺［50，52］或肼類［54］試劑對(duì)AP位點(diǎn)開(kāi)鏈醛進(jìn)行衍生標(biāo)記形成穩(wěn)定的肟或腙類目標(biāo)化合物，實(shí)現(xiàn)對(duì)AP位點(diǎn)的準(zhǔn)確定量分析。

Zhou等［52］基于14C甲氧胺衍生化構(gòu)建了AP位點(diǎn)的加速器質(zhì)譜法，檢出限為1個(gè)AP位點(diǎn)/106nts。該方法雖提高了靈敏度，但能與14C甲氧胺反應(yīng)的除AP位點(diǎn)外，還包括鏈斷裂位點(diǎn)及多種帶有醛和酮基的降解產(chǎn)物，故該方法僅適用于檢測(cè)造成多位點(diǎn)損傷的DNA。Li等［54］利用同位素稀釋的LC-MS/MS法定量分析基因組DNA中的AP位點(diǎn)，檢出限為4個(gè)AP位點(diǎn)/109nts（6．5 fmol），該方法靈敏度雖有提高，但對(duì)AP位點(diǎn)的衍生化標(biāo)記發(fā)生于DNA酶解完成后，存在DNA酶解導(dǎo)致假陽(yáng)性AP位點(diǎn)生成的可能性，從而導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。Rahimoff等［51］亦利用LC-MS/MS方法在小鼠胚胎干細(xì)胞中測(cè)得0．9個(gè)AP位點(diǎn)/106nts。Turesky等［50］構(gòu)建基于利用O-［（3-吡啶基）甲基］羥胺（PMOA）試劑對(duì)AP位點(diǎn)進(jìn)行衍生化標(biāo)記的高靈敏和高特異性的LC-MS/MS定量方法，驗(yàn)證了與提取DNA后對(duì)AP位點(diǎn)進(jìn)行衍生化的流程相比，在細(xì)胞裂解時(shí)即直接對(duì)AP位點(diǎn)進(jìn)行衍生化標(biāo)記是減少假陽(yáng)性結(jié)果的較好方式，并最終從小鼠肝組織中測(cè)得約0．9個(gè)AP位點(diǎn)/107nts。

質(zhì)譜法測(cè)定AP位點(diǎn)靈敏度的不斷提高有益于實(shí)現(xiàn)對(duì)AP位點(diǎn)的分析檢測(cè)，同時(shí)質(zhì)譜方法能提供精確質(zhì)量及特征碎片離子，可實(shí)現(xiàn)精確定性與準(zhǔn)確定量。但構(gòu)建AP位點(diǎn)液質(zhì)定量方法時(shí)除需考慮衍生化試劑的衍生化效率外，更需要考慮的重要影響因素是AP位點(diǎn)自身結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，由于在DNA裂解、消化或衍生化過(guò)程中均可造成AP位點(diǎn)的形成或丟失，易導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)偏差，因而目前測(cè)定AP位點(diǎn)時(shí)需重點(diǎn)關(guān)注其化學(xué)穩(wěn)定性［4，29，50］。通常考慮以下樣品處理?xiàng)l件，以盡量避免假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果：①條件盡量溫和，如酶解溫度不能太高、樣品混勻時(shí)輕輕振蕩及選擇適宜pH值等［50，89-90］；②酶解時(shí)添加劑的選擇，如加入甲磺酸去鐵胺能有效防止樣品被氧化［66，89-91］；③衍生化時(shí)機(jī)的選擇，如衍生化試劑越早添加越能監(jiān)測(cè)到生物體本底水平的AP位點(diǎn)［50］。

如表1所示，在諸多測(cè)定AP位點(diǎn)的分析方法中，ELISA-like分析法和液相色譜-質(zhì)譜法最為常用和有效。前者在人類細(xì)胞系中最少可檢出超過(guò)6．7個(gè)AP位點(diǎn)/107nts，最高在人或哺乳動(dòng)物組織中檢出100個(gè)AP位點(diǎn)/107nts；后者在人肺臟或白細(xì)胞中最少檢出2個(gè)AP位點(diǎn)/107nts，最高在小鼠胚胎干細(xì)胞中測(cè)得10個(gè)AP位點(diǎn)/107nts。兩組數(shù)據(jù)比較分析顯示，對(duì)于細(xì)胞系或組織的AP位點(diǎn)本底水平測(cè)定，ELISA-like分析法測(cè)得的含量較高，其主要原因可能與ELISA-like方法的非特異性有關(guān)［55］。因此，目前亦日趨采用更特異更靈敏的LC-MS方法用于AP位點(diǎn)的檢測(cè)和定量分析。

表1 不同方法對(duì)寡核苷酸、細(xì)胞或哺乳動(dòng)物組織中DNA AP位點(diǎn)的檢測(cè)分析特征總結(jié)Table 1 Summary of the characteristics of determination of DNA AP sites in oligonucleotides，cell lines or mammalian tissues by a variety of techniques

4 毒性評(píng)價(jià)和癌癥治療相關(guān)應(yīng)用研究

4.1 毒性評(píng)價(jià)

自從報(bào)道在細(xì)胞內(nèi)存在大量AP位點(diǎn)后，多數(shù)檢測(cè)方法的目的是測(cè)定AP位點(diǎn)在細(xì)胞或組織中的本底表達(dá)水平和經(jīng)毒物暴露后的AP位點(diǎn)變化情況及損傷修復(fù)趨勢(shì)，并進(jìn)一步研究其作為生物標(biāo)志物用于損傷評(píng)價(jià)、BER修復(fù)過(guò)程檢測(cè)和化合物毒性評(píng)價(jià)等的可能性。

早期，人們利用ELISA-like分析方法開(kāi)展了致癌物暴露細(xì)胞后AP位點(diǎn)的含量測(cè)定［44，46］、細(xì)胞中AP位點(diǎn)的修復(fù)過(guò)程監(jiān)測(cè)［43］和老齡化過(guò)程中AP位點(diǎn)的變化程度［45］等研究，但由于該方法的特異性不強(qiáng)，導(dǎo)致上述研究可能存在較高的假陽(yáng)性問(wèn)題（見(jiàn)表1）。因此，近十五年來(lái)，陸續(xù)報(bào)道利用高靈敏和高特異的質(zhì)譜技術(shù)對(duì)AP位點(diǎn)進(jìn)行定性定量分析，但大多均停留在方法構(gòu)建方面。近期Turesky課題組［50］構(gòu)建了能有效降低假陽(yáng)性的定量分析AP位點(diǎn)的LC-MS/MS方法，基于該方法，Guo等［58］開(kāi)展了動(dòng)物暴露于煙草中特異性亞硝胺形成AP位點(diǎn)的研究，并評(píng)估了吸煙者和非吸煙者DNA中的AP位點(diǎn)，為理解煙草中亞硝胺誘發(fā)癌癥的可能機(jī)制提供了一個(gè)新的角度。

4.2 癌癥治療

數(shù)十年來(lái)，人們對(duì)DNA損傷反應(yīng)（DNA damage response，DDR）的理解不斷加深，拓寬了腫瘤學(xué)的治療領(lǐng)域。DDR缺陷導(dǎo)致的細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性誘發(fā)了癌癥的發(fā)生，但這些缺陷亦可被應(yīng)用作為治療切入點(diǎn)，如選擇一些DDR途徑中成員的抑制劑進(jìn)行癌癥靶向治療［92］。AP位點(diǎn)作為BER途徑中的修復(fù)中間體，是最常見(jiàn)的DNA損傷之一，基于AP位點(diǎn)的癌癥治療研究也逐步興起［93-94］。

Chen等［57］利用LC-MS方法測(cè)定了氮芥（NM）處理小鼠后各組織中NM-DNA加合物和AP位點(diǎn)含量，并繪制了二者之間的動(dòng)力學(xué)曲線，發(fā)現(xiàn)AP位點(diǎn)的修復(fù)過(guò)程與NM-DNA加合物的清除有密切關(guān)聯(lián)，提示AP位點(diǎn)可作為用于新型化療方案設(shè)計(jì)和療效評(píng)估的生物標(biāo)志物。近期，Mandi等［94］將AP位點(diǎn)作為抗癌藥物發(fā)現(xiàn)的靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)熒光喹喔啉胺能增強(qiáng)特定雙功能烷基化藥物的反應(yīng)，當(dāng)含硝基的單喹喔啉DNA嵌入劑單獨(dú)或與熒光喹喔啉胺組合使用時(shí)可導(dǎo)致HCT-116細(xì)胞（Human colorectal carcinoma cell）凋亡，為后期靶向癌細(xì)胞中AP位點(diǎn)的治療應(yīng)用提供了思路。Xue等［93］結(jié)合癌細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）的豐度，開(kāi)發(fā)了具有靶向抗腫瘤活性和細(xì)胞光毒性的GSH響應(yīng)性AP捕獲劑，為癌癥靶向化療提供了一種可能策略。

5 展望

AP位點(diǎn)損傷可由核苷酸自發(fā)水解產(chǎn)生，亦是DNA修復(fù)烷基化或氧化堿基過(guò)程中生成的中間體。若DNA中的AP位點(diǎn)未及時(shí)獲得修復(fù)，可能會(huì)導(dǎo)致DNA復(fù)制阻滯并影響轉(zhuǎn)錄過(guò)程，并進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞突變或細(xì)胞毒性。因此，通過(guò)體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)探討AP位點(diǎn)損傷數(shù)目與細(xì)胞或哺乳動(dòng)物組織中DNA損傷程度的關(guān)聯(lián)，以及驗(yàn)證AP位點(diǎn)數(shù)目超過(guò)某一閾值可否作為判斷基因毒性的標(biāo)志，對(duì)于AP位點(diǎn)損傷的定量分析研究顯得尤為重要［17-18］。由于AP位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，目前能準(zhǔn)確定量分析AP位點(diǎn)的方法仍較少［29，50］。近年來(lái)，隨著利用LC-MS/MS技術(shù)定量分析AP位點(diǎn)損傷的研究逐漸增多［50］，已初步開(kāi)展了人群受基因毒性物質(zhì)如亞硝胺的暴露研究［58］，相信LC-MS/MS技術(shù)將在定量分析AP位點(diǎn)中扮演重要角色。

盡管AP損傷仍被認(rèn)為是易于修復(fù)的致突變損傷，但AP位點(diǎn)的親電性使其在生物學(xué)效應(yīng)中扮演的角色（如ICL或DPC）仍需獲得更多關(guān)注［2，28］，相信與AP位點(diǎn)相關(guān)的毒性評(píng)價(jià)和癌癥治療相關(guān)應(yīng)用研究亦會(huì)逐步興起。