診斷離子技術(shù)在中藥質(zhì)譜分析中的應(yīng)用

余文怡，應(yīng)金琴，劉艷芳，徐 青，沈愛金*，梁鑫淼*

（1．中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2．江西省中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，贛江中藥創(chuàng)新中心，江西 南昌 330000）

物質(zhì)基礎(chǔ)研究是闡明中藥作用機(jī)理的基本前提，然而中藥化學(xué)成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)類型多樣且含量差異大，物質(zhì)基礎(chǔ)表征存在巨大的挑戰(zhàn)。結(jié)合色譜優(yōu)異的分離能力和質(zhì)譜高通量、高靈敏度等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）在中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面得到了廣泛的應(yīng)用［1-3］。盡管如此，由于獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)量巨大，準(zhǔn)確提取并鑒定中藥化學(xué)成分仍然是一個(gè)艱巨的任務(wù)。截至目前，已發(fā)展了一系列質(zhì)譜數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，包括診斷離子過濾（Diagnostic ion filtering）、質(zhì)量虧損過濾（Mass defect filtering，MDF）［4-6］、中性丟失過濾（Neutral loss filtering，NLF）［7-9］、分子網(wǎng)絡(luò)（Molecular networking，MN）［10-13］等，大大提升了鑒定效率和能力。

“診斷離子（Diagnostic ions）”又稱“診斷碎片（Diagnostic fragments）”、“診斷產(chǎn)物離子（Diagnostic product ions）”、“診斷碎片離子（Diagnostic fragment ions）”、“關(guān)鍵離子（Key ions）”、“關(guān)鍵產(chǎn)物離子（Key product ions）”、“關(guān)鍵診斷碎片離子（Key diagnostic fragment ions）”等［14-21］，是指化學(xué)成分在質(zhì)譜裂解過程中產(chǎn)生的能夠代表該成分化學(xué)結(jié)構(gòu)類型的特征碎片離子?；凇霸\斷離子”的手動(dòng)鑒定或自動(dòng)過濾策略是一種有效的質(zhì)譜數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)未知成分結(jié)構(gòu)類型的快速判斷，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥不同類型化學(xué)成分的鑒定中，顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文將針對(duì)近十年來診斷離子技術(shù)在黃酮類、生物堿類、苯丙素類、酚酸類、萜類、甾體類等中藥不同類型化學(xué)成分質(zhì)譜鑒定中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)和討論，為相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者的質(zhì)譜鑒定研究提供參考。

1 黃酮類（Flavonoids）

黃酮類化合物具有多種結(jié)構(gòu)亞類，在ESI源正負(fù)離子模式下均易離子化，診斷離子技術(shù)的相關(guān)研究主要集中于黃酮苷元、氧苷及碳苷［6-8，14，16，18，22-50］，當(dāng)前最常用的主要是基于已知苷元的分子離子峰（［M+H］+或［M-H］-）進(jìn)行黃酮苷元和氧苷的鑒定［14］。例如Zhang等［7］采用芹菜素、木犀草素和山奈酚等10種苷元離子作為診斷離子，配合NLF從銀杏葉中鑒定出75個(gè)黃酮類成分，其中以芹菜素為診斷離子鑒定出4個(gè)化合物，以木犀草素為診斷離子鑒定出3個(gè)化合物，以山奈酚為診斷離子鑒定出29個(gè)化合物，均為苷元連有不同糖基的氧苷類成分。Li等［29］采用白楊素、芹菜素、木犀草素、山奈酚和槲皮素5種苷元離子對(duì)連錢草中的黃酮類成分進(jìn)行鑒定。此外，基于黃酮母核修飾不同取代基獲取潛在的診斷離子也得到了一定的應(yīng)用。Xie等［14］在黃酮類母核上修飾羥基和甲氧基得到了54種可能的苷元，通過提取相應(yīng)的分子離子峰，并采用逆-狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（Retro Diels-Alder reaction，RDA）裂解碎片對(duì)取代基進(jìn)行確認(rèn)，從密蒙花中鑒定出20個(gè)黃酮類成分。Qiao等［18］采用類似的方法從黃芩中鑒定出75個(gè)黃酮類和25個(gè)二氫黃酮類成分。與黃酮氧苷不同，黃酮碳苷最特征的裂解方式為糖環(huán)連續(xù)丟失CH2O［24］，因此，主要以［M-60-H］-、［M-90-H］-、［M-120-H］-等為診斷離子進(jìn)行鑒定。Cao和Wu等［46，49］分別基于上述特征從紫花地丁和金蓮花屬植物中鑒定出35個(gè)和32個(gè)黃酮碳苷。考慮到黃酮類成分容易發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生A環(huán)和B環(huán)的特征碎片，若同時(shí)以RDA碎片作為診斷離子或許可以更進(jìn)一步地過濾黃酮及氧苷類化合物。

2 生物堿類（Alkaloids）

2.1 異喹啉類生物堿（Isoquinoline alkaloids）

目前采用診斷離子技術(shù)對(duì)異喹啉類生物堿進(jìn)行深入鑒定的報(bào)道不多，處于相對(duì)初級(jí)的階段，通常采用ESI源在正離子模式下進(jìn)行研究［4，51-57］。Lu等［51］對(duì)6種結(jié)構(gòu)類型12個(gè)標(biāo)品生物堿進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)單芐基異喹啉類、普羅托品類和N-甲基四氫小檗堿類均會(huì)發(fā)生骨架裂解，碎片離子m/z一般小于230，此外，單芐基異喹啉類會(huì)發(fā)生含氮基團(tuán)（CH3）2NH或CH3NH2的丟失，產(chǎn)生［M-45］+或［M+H-31］+，普羅托品類會(huì)失H2O產(chǎn)生［M+H-18］+，N-甲基四氫小檗堿類會(huì)丟失CH4產(chǎn)生［M-16］+；小檗堿類、苯駢菲啶類和二氫苯駢菲啶類不會(huì)發(fā)生骨架的裂解，碎片離子m/z一般都在200以上，且小檗堿類容易產(chǎn)生［M-2H］+，苯駢菲啶類會(huì)丟失氮原子上的·CH3產(chǎn)生［M-15］+，二氫苯駢菲啶類易產(chǎn)生m/z332．091 55或m/z348．122 80?；谏鲜鲈\斷信息從血水草中鑒定了95個(gè)化合物。然而，上述診斷離子并不能完全代表該類化合物的特征，例如只有當(dāng)取代基為兩個(gè)亞甲二氧基、1個(gè)亞甲二氧基+兩個(gè)甲氧基時(shí)二氫苯駢菲啶類才會(huì)產(chǎn)生m/z332．091 55、m/z348．122 80。其次，部分診斷離子不具有顯著的特征性，例如上述丟失H2O及·CH3的診斷離子是常見的中性丟失，存在于所有異喹啉甚至其它類型的化合物中，易產(chǎn)生假陽性。Jiang等［54］以骨架裂解后產(chǎn)生的AB環(huán)碎片m/z206和m/z192作為雙芐基異喹啉類的診斷離子，以骨架裂解后產(chǎn)生的C環(huán)碎片m/z107作為單芐基異喹啉類的診斷離子，以連續(xù)丟失氮基團(tuán)和·CH3后的碎片［M+H-CH3NH2-·CH3］+作為阿樸菲類的診斷離子，結(jié)合分子量范圍和碎片豐度信息從蓮子心中鑒定出9個(gè)雙芐基異喹啉類、20個(gè)單芐基異喹啉類和2個(gè)阿樸菲類成分。

2.2 吲哚類生物堿（Indole alkaloids）

吲哚類生物堿結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，目前診斷離子技術(shù)的應(yīng)用主要集中在單萜吲哚類生物堿，一般通過ESI源正離子模式下母核開環(huán)裂解形成的碎片離子、母核氮橋環(huán)丟失中性分子后形成的碎片離子等信息對(duì)該類成分進(jìn)行鑒定［7，20，58-63］，不同亞類之間診斷離子差異十分顯著。Pan等［62］對(duì)四環(huán)單萜吲哚類（tMIA）、四環(huán)單萜氧化吲哚類（tMOA）、四環(huán)單萜氮氧化吲哚類（tMIN）和五環(huán)單萜吲哚類（pMIA）共14個(gè)鉤藤單萜吲哚類生物堿進(jìn)行裂解規(guī)律研究，發(fā)現(xiàn)tMIA和tMOA會(huì)分別發(fā)生C環(huán)裂解產(chǎn)生吲哚母核m/z144．080 8和m/z160．075 7，tMIN會(huì)發(fā)生D環(huán)裂解產(chǎn)生m/z184．099 5，pMIA會(huì)發(fā)生E環(huán)裂解產(chǎn)生m/z265．134 5、m/z247．123 8等離子，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生吲哚母核m/z144．080 8，通過這些診斷信息結(jié)合［M+H-CH3OH］+、［M+H-NH3］+、［M+H-H2O］+等中性丟失從鉤藤中鑒定了92個(gè)單萜吲哚類生物堿。Tian等［63］通過研究發(fā)現(xiàn)士的寧和甲氧基馬錢子堿均會(huì)發(fā)生氮橋環(huán)的裂解生成［M+H-C2H4］+和［M+H-C4H9］+，以這兩個(gè)碎片作為診斷離子，從馬錢子中鑒定出17個(gè)二氫吲哚類生物堿。Kumar等［61］以3個(gè)側(cè)鏈取代基丟失碎片和3個(gè)RDA裂解碎片作為診斷離子，從蘿芙木屬植物中鑒定出10個(gè)育亨賓類單萜吲哚類生物堿。Yang等［20］利用RDA裂解碎片作為診斷離子從吳茱萸中鑒定出5個(gè)吳茱萸胺型生物堿。值得注意的是，診斷離子m/z144．080 8在tMIA、育亨賓類、長春堿類及吳茱萸胺類中均可產(chǎn)生（圖1），因此不適合單獨(dú)作為某一具體類型的診斷離子進(jìn)行鑒定。

圖1 單萜吲哚類生物堿的共有診斷離子Fig．1 Common diagnostic ions of monoterpene indole alkaloids

2.3 甾體生物堿（Steroidal alkaloids）

貝母生物堿是典型的甾體生物堿（C27膽甾烷類），根據(jù)結(jié)構(gòu)差異性，可以分為西藜蘆堿（Cevanine）型、介藜蘆（Jervine）型、藜蘆胺（Veratramine）型和裂環(huán)茄堿（Secosolanidine）型等，其在ESI源正離子模式下容易發(fā)生骨架裂解，當(dāng)前診斷離子技術(shù)在貝母生物堿的鑒定中得到了較好的應(yīng)用［10，21，64］。如圖2所示，西藜蘆堿型相對(duì)穩(wěn)定，一般可以產(chǎn)生明顯的［M+H］+，當(dāng)C20位連有羥基時(shí)產(chǎn)生［M+H-H2O］+，此外，如果氮上有氧取代時(shí)還會(huì)產(chǎn)生很高的［C7H14N］+（m/z112．11）；介藜蘆型生物堿的E環(huán)為一個(gè)含氧呋喃環(huán)，其診斷離子為E環(huán)裂解產(chǎn)生的m/z114．09、84．08及67．05；藜蘆胺型生物堿的結(jié)構(gòu)特征為D環(huán)和E環(huán)通過碳橋相連，碳橋裂解后會(huì)產(chǎn)生E環(huán)診斷離子m/z128．10，通常為基峰；裂環(huán)茄堿型通常以A環(huán)、C環(huán)或E環(huán)裂解產(chǎn)生的［C4H7］+（m/z55．05）、［C6H9］+（m/z81．07）、［C5H9］+（m/z69．06）為基峰，此外還會(huì)有B環(huán)裂解產(chǎn)生的［C7H11］+（m/z95．08）等離子。結(jié)合這些診斷離子，Zhou等［21］從8種貝母中鑒定了41個(gè)甾體類生物堿，An等［64］從伊貝母中鑒定了529個(gè)生物堿，其中大部分為西藜蘆堿型和介藜蘆型；Liu等［10］將診斷離子與分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)結(jié)合，從11種貝母中鑒定了325個(gè)甾體類生物堿。

圖2 4種類型貝母生物堿的裂解路徑Fig．2 Cleavage pathways of four types of fritillaria alkaloids

2.4 萜類生物堿（Terpenoidal alkaloids）

中藥研究比較多的萜類生物堿是烏頭屬植物中的二萜類生物堿，主要包括C19-二萜生物堿和C20-二萜生物堿。C19-二萜生物堿是其中數(shù)量最多的一類［65］，包括雙酯型（DDAs）、脂肪酸酯型（LPAs）、單酯型（MDAs）和醇胺型（ADAs）等［66-68］。C19-二萜生物堿在ESI源正離子模式下的診斷離子與取代基密切相關(guān)，Li等［66］總結(jié)了連有不同取代基類型時(shí)C19-二萜生物堿的診斷離子（表1）；當(dāng)沒有酯基取代時(shí)會(huì)產(chǎn)生［C2H6N］+（m/z44．049 5）、［C3H8N］+（m/z58．065 1）等與N橋斷裂相關(guān)的碎片，當(dāng)有酯基取代時(shí)除了產(chǎn)生上述碎片，還會(huì)產(chǎn)生與酯鍵斷裂相關(guān)的碎片，如當(dāng)有苯甲?；˙enzoyloxyl）取代時(shí)產(chǎn)生［C7H5O］+（m/z105．033 5）、有肉桂?；–innamoyloxyl）取代時(shí)產(chǎn)生［C9H7O］+（m/z131．049 1）等。采用這些診斷碎片，結(jié)合保留時(shí)間和不飽和度等信息，從生附片中鑒定出236個(gè)二萜生物堿。Gao等［67］研究了3個(gè)DDAs、3個(gè)MDAs、3個(gè)ADAs和3個(gè)C20-二萜生物堿標(biāo)品的裂解特征，發(fā)現(xiàn)DDAs和MDAs會(huì)產(chǎn)生豐度很高的m/z105．03，而相比于MDAs，DDAs又會(huì)產(chǎn)生［M-PhCOOH+H］+、［M-CH3COOH+H］+、［M-CO+H］+等碎片，ADAs和C20-二萜生物堿不會(huì)產(chǎn)生m/z105．03。通過這些診斷離子結(jié)合碎片在譜圖中的整體分布情況，從烏頭根中鑒定了24個(gè)苯甲酰取代的二萜生物堿，包括10個(gè)DDAs、7個(gè)MDAs和7個(gè)LPAs。

表1 二萜生物堿中潛在亞結(jié)構(gòu)的相關(guān)診斷離子和/或中性丟失［66］Table 1 Corresponding diagnostic fragment ions and/or neutral losses of potential substructures in diterpene alkaloids［66］

3 苯丙素類（Phenylpropanoids）

3.1 簡單苯丙素類（Simple phenylpropanoids）及香豆素類（Coumarins）

與黃酮類化合物相似，簡單苯丙素及香豆素類主要以結(jié)構(gòu)母核作為診斷離子進(jìn)行鑒定［7，8，15，17，22，30，39，48］。簡單苯丙素容易與糖結(jié)合成苷，一般在ESI源負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，正離子模式也有響應(yīng)，在質(zhì)譜中易發(fā)生糖苷鍵的斷裂，生成［苯丙素-H］-碎片離子，如［咖啡酸-H］-（m/z179．035 0）、［香豆酸-H］-（m/z163．040 1）和［阿魏酸-H］-（m/z193．050 6）等。Zhang等［7］采用這3個(gè)診斷離子從銀杏葉中鑒定出7個(gè)簡單苯丙素類成分，Shang等［15］采用上述3個(gè)診斷離子和［肉桂酸-H］-（m/z147．045 2）從玄參中鑒定出42個(gè)簡單苯丙素類成分。香豆素類成分的診斷離子研究也相對(duì)較少，Li等［8］以羥基香豆素的［M-H］-（m/z161．024 4）和二羥基香豆素的［M-H］-（m/z177．019 3）為診斷離子，從柑橘花中鑒定了12個(gè)羥基香豆素和二羥基香豆素糖苷類成分。

3.2 木脂素類（Lignans）

木脂素由苯丙素氧化聚合而來，根據(jù)聚合方式可分為多種類型，在ESI源正負(fù)離子模式下均有響應(yīng)。不同類型木脂素鑒定使用的診斷離子各不相同［17，30，38-39，41，48，69］，包括母核離子和母核丟失特征取代基產(chǎn)生的碎片離子及母核裂解產(chǎn)生的碎片離子。Zheng等［69］將五味子中的聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素分為5種類型：TypeⅠ的C環(huán)沒有含氧取代基，TypeⅡ的C環(huán)有含氧取代基，TypeⅢ的C環(huán)有含氧取代基且苯環(huán)上有酯鏈，TypeⅣ的C環(huán)同時(shí)有含氧取代基和酯鏈，TypeⅤ的11元環(huán)上有內(nèi)酯環(huán)；將［M-·CH3O-C5H10+H］+·和［M-·CH3-·CH3O+Na］+作為TypeⅠ的診斷離子，［M-H2O+H］+作為TypeⅡ的診斷離子，［M-H2O-C5H6O/C7H4O+H］+作為TypeⅢ的診斷離子，［M-C5H8O2/C7H6O2+Na］+作為TypeⅣ的診斷離子，［M-（CO+H2O）+Na］+作為TypeⅤ的診斷離子，從五味子中鑒定出20個(gè)木脂素類成分，然而TypeⅡ和Ⅴ型診斷離子的特征性并不強(qiáng)，為多種類型化合物均易產(chǎn)生的中性丟失。Dai等［38］以呋喃環(huán)裂解產(chǎn)生的m/z181．050 3、m/z151．040 2和m/z175．076 2作為診斷離子，從蒲地藍(lán)消炎口服液中鑒定了16個(gè)雙環(huán)氧木脂素類化合物。Chen等［39］對(duì)感冒靈顆粒中的二芳基丁烷類、單環(huán)氧木脂素類、雙環(huán)氧木脂素類、芳基萘類4種木脂素類成分進(jìn)行鑒定，以9個(gè)化合物的［M-H］-作為診斷離子，鑒定出14個(gè)連有不同取代基的木脂素類化合物。

4 酚酸類（Phenolic acid）

4.1 綠原酸類（Chlorogenic acids，CGAs）

綠原酸類化合物（CGAs）是由一個(gè)或多個(gè)肉桂酸單元與奎寧酸單元縮合形成的酯類（圖3），主要以肉桂酸和奎寧酸單元作為特征的診斷離子進(jìn)行質(zhì)譜鑒定［6-8，25，29，33，39，41-42，70-76］。CGAs在ESI源負(fù)離子模式下容易生成豐度很高的［奎寧酸-H］-（m/z191．056 1）和［奎寧酸-H-H2O］-（m/z173．045 6）［71，73，75］，除此之外，不同類型的CGAs還會(huì)產(chǎn)生與肉桂酸單元相關(guān)的診斷離子，例如單取代咖啡?？鼘幩崃呀夂髸?huì)產(chǎn)生［咖啡酸-H］-（m/z179．035 0），單取代阿魏?？鼘幩崃呀夂髸?huì)產(chǎn)生［阿魏酸-H］-（m/z193．050 6），雙取代阿魏?？Х弱？鼘幩崃呀鈺r(shí)會(huì)產(chǎn)生［奎寧酸+咖啡酸-H］-（m/z353．087 8）和［奎寧酸+阿魏酸-H］-（m/z367．103 5）。Ouyang等［71］利用上述診斷離子從杏香兔耳風(fēng)中鑒定了14種類型共88個(gè)CGAs，Zhang等［72］將奎寧酸和咖啡酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸和芥子酸進(jìn)行組合后，得到70種CGAs類化合物的分子量，然后對(duì)這些成分進(jìn)行靶向數(shù)據(jù)采集，最后通過每種類型CGAs的診斷離子對(duì)化合物進(jìn)行分類和鑒定，最終從金銀花中鑒定出115個(gè)CGAs，分屬于18種類型。

圖3 綠原酸類化合物的診斷離子Fig．3 Diagnostic ions of chlorogenic acids

4.2 苯乙醇苷類（Phenylethanoid glycosides）

苯乙醇苷由苯乙醇（C6~C2）和糖結(jié)合形成，糖基上的羥基可以被一些芳香酸取代，在ESI源負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，質(zhì)譜裂解以糖苷鍵和酯鍵的斷裂為主，診斷離子主要集中在苯乙醇苷元和芳香酸單元［9，14-15，18，24，41，48，77］。苯乙醇苷類化合物常見的芳香酸單元有咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、丁香酸和香草酸5種，前3種容易產(chǎn)生［M-H-H2O］-峰，丁香酸和香草酸不易發(fā)生酯鍵的斷裂，容易和糖單元、苯乙醇單元一起產(chǎn)生很高的碎片峰，如m/z495．150 8和m/z465．140 2（圖4A）。苯乙醇苷元的變化較多，其中最常見的有羥基酪醇、酪醇和去羥基酪醇，易產(chǎn)生m/z153．055 7、137．060 8和121．065 9，還會(huì)產(chǎn)生與糖基相連的診斷離子，如m/z315．108 0、299．113 1、283．118 2（圖4B）。芳香酸單元診斷離子一般是基峰，而苯乙醇苷元碎片的豐度不高，有時(shí)甚至沒有，在鑒定時(shí)需要綜合多種信息進(jìn)行綜合判斷。Xue等［9］以上述5種芳香酸離子為診斷離子，結(jié)合NLF技術(shù)從厚樸中鑒定出101個(gè)苯乙醇苷類；Xie等［14］以［咖啡酸-H-H2O］-（m/z161．023 9）為診斷離子從密蒙花中鑒定了13個(gè)咖啡酸型苯乙醇苷。

圖4 苯乙醇苷類化合物的診斷離子Fig．4 Diagnostic ions of phenylethanoid glycosides

5 萜類（Terpenoids）

5.1 環(huán)烯醚萜類（Iridoids）

環(huán)烯醚萜多以苷的形式存在，且以單糖苷為主，在ESI源正負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，負(fù)離子模式采用較多。其糖苷鍵在質(zhì)譜中極易斷裂，因此這類化合物最常用的診斷離子是［苷元-H］-，此外，環(huán)烯醚萜苷元脫水產(chǎn)生的［苷元-H-H2O］-和骨架裂解產(chǎn)生的碎片離子也可以作為診斷離子［15，22，33，41-42，48，78-80］。Fu等［78］將［苷元-H］-、［苷元-H-H2O］-、RDA裂解碎片、C1-O2和C4-C5鍵斷裂產(chǎn)生的特征碎片作為診斷離子，從梔子花中成功鑒定出20種環(huán)烯醚萜苷，例如以［京尼平苷苷元-H］-（m/z225．076 2）、［京尼平苷苷元-H-H2O］-（m/z207．066 0）、RDA裂解產(chǎn)生的［C7H7O2］-（m/z123．045 7）及C1-O2與C4-C5鍵斷裂產(chǎn)生的［C4H5O3］-（m/z101．024 4）作為診斷離子（圖5）鑒定出3種環(huán)烯醚萜苷類成分。除此之外，也有采用苷元丟失H2O、CO、CO2、CH3OH產(chǎn)生的碎片作為診斷離子的報(bào)道，如Hao等［79］采用脫糖后連續(xù)丟失H2O和CO2的［C9H10O3］-（m/z165．056 2）作為診斷離子從脈絡(luò)寧注射液中鑒定出5種環(huán)烯醚萜苷類化合物，Shang等［15］采用脫糖且發(fā)生?；鶖嗔旬a(chǎn)生的［C9H11O4］-（m/z183．065 1）作為診斷離子從玄參中成功鑒定出26種?；h(huán)烯醚萜苷類成分。

圖5 環(huán)烯醚萜苷類可能的裂解方式Fig．5 Proposed characteristic cleavage pathway of iridoid glycosides

5.2 二萜類（Diterpenes）

目前通過診斷離子鑒定的二萜類主要以內(nèi)酯類為主，其中銀杏內(nèi)酯類的研究較深入，ESI源正負(fù)離子模式均有報(bào)道［7，27，81］。銀杏內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中包含1個(gè)正丁基和3個(gè)γ-內(nèi)酯環(huán)，在譜圖上容易產(chǎn)生豐度較高的［M-H］-。Zhang等［7］將γ-內(nèi)酯環(huán)裂解產(chǎn)生的［C2HO3］-（m/z72．993 1）作為診斷離子從銀杏中鑒定出15個(gè)銀杏內(nèi)酯類化合物。Pang等［27］采用連續(xù)丟失H2O、CO和CO2產(chǎn)生的m/z349．14、m/z321．17和m/z251．09作為診斷離子，結(jié)合MDF和NLF從銀丹心腦通中鑒定出6個(gè)銀杏內(nèi)酯類化合物，但連續(xù)丟失相比環(huán)裂解的特征性并不強(qiáng)。除了銀杏內(nèi)酯類成分之外，He等［81］發(fā)現(xiàn)半日花烷型二萜易丟失H2O、HCOOH、CO等中性小分子，C9~C11單鍵易斷裂丟失C6H8特征基團(tuán)，他們采用［M+H-H2OHCOOH］+、［M+H-H2O-HCOOH］+、［M+H-H2O-HCOOH-H2O］+、［M+H-H2O-HCOOHH2O-C6H8］+作為診斷離子（圖6），配合NLF策略從馥芳艾納香中鑒定出38種半日花烷型二萜。

圖6 半日花烷型二萜的診斷離子Fig．6 Diagnostic ions of labdane-type diterpenes

5.3 三萜及其苷類（Triterpenes and triterpenoid saponins）

目前通過診斷離子技術(shù)鑒定三萜苷元類化合物的報(bào)道不多，僅Falev等［82］采用大氣壓化學(xué)電離源（Atmospheric pressure chemical ionization，APCI）檢測(cè)了樺樹皮、蘋果皮、蔓越橘皮和甘草根中的五環(huán)三萜類成分，其它研究主要集中于對(duì)三萜皂苷的鑒定［17，19，22-23，27，39，41，44，48，68，76，83-85］。三萜皂苷在ESI源正負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，正離子模式下易脫水，其糖苷鍵在質(zhì)譜中極易斷裂，因而脫糖后的［苷元+H-H2O］+和［苷元-H］-為最常用的診斷離子。如Qi等［85］采用原人參三醇、原人參二醇和擬人參皂苷元的［苷元+H-H2O］+作為診斷離子，配合NLF策略從西洋參中鑒定出70個(gè)三萜皂苷類成分，其中以［原人參三醇+H-H2O］+為診斷離子鑒定出32個(gè)化合物。Yang等［17］選取13個(gè)三萜皂苷類已知化合物作為參考，提取脫糖后的［苷元-H］-作為診斷離子并結(jié)合MDF從鐵冬青中鑒定出70個(gè)三萜皂苷類成分，進(jìn)一步結(jié)合RDA等特征裂解碎片確定了化合物的細(xì)致分類。Li等［86］采用［齊墩果酸+H-H2O］+、［齊墩果酸-H］-及C環(huán)RDA裂解產(chǎn)生的m/z249．18（［C16H25O2］+）、m/z191．17（［C14H23］+）、m/z203．17（［C15H23］+）作為診斷離子（圖7），成功從牛膝中鑒定出22種齊墩果烷型三萜皂苷。此外，Pham等［19］在9種已知的齊墩果烷型三萜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上結(jié)合生物合成途徑在C-3位修飾不同類型和個(gè)數(shù)的?；吞腔?，建立了包含224種齊墩果烷型三萜的虛擬化合物庫，并將脫糖后的［苷元-H］-作為診斷離子，結(jié)合相對(duì)質(zhì)量虧損過濾（Relative mass defect，RMD）策略從匙羹藤中篩選出110個(gè)齊墩果烷型三萜皂苷類化合物。

圖7 齊墩果烷型三萜皂苷類診斷離子Fig．7 Diagnostic ions of oleanane type triterpenoid saponins

6 甾體類（Steroids）

6.1 甾體皂苷類（Steroidal saponins）

甾體皂苷是一類由螺甾烷類化合物和糖結(jié)合形成的寡糖苷，可分為螺甾烷醇類、呋甾烷醇類等，診斷離子技術(shù)在該類化合物中的應(yīng)用主要在早期，且以ESI源正離子模式為主［40，87-92］。甾體皂苷氧苷鍵很容易斷裂產(chǎn)生苷元離子，且在正離子模式下容易發(fā)生E環(huán)裂解，產(chǎn)生［C19H27O］+（m/z271．203 6），進(jìn)一步脫水產(chǎn)生［C19H25］+（m/z253．200 1），如圖8A所示。Zhu等［88］和Li等［92］利用上述診斷離子分別從盾葉薯蕷和黃山藥中鑒定出31個(gè)和13個(gè)甾體皂苷。Lu等［91］采用新綠配基、新海南皂苷元和6-羥基螺甾-3-酮（Solagenin）3種苷元離子作為診斷離子（圖8B），從龍葵中鑒定出9個(gè)甾體皂苷類成分，均為苷元連有不同糖基的氧苷類成分。Man等［90］采用薯蕷皂苷元、偏諾皂苷元等作為診斷離子（圖8B），從重樓中鑒定出23種甾體皂苷。盡管普遍認(rèn)為甾體皂苷在負(fù)離子模式下可提供的信息較少［93］，但Zhang等［89］通過研究11種已知甾體皂苷在負(fù)離子模式下的裂解行為，采用［偏諾皂苷元+Glc］-和［薯蕷皂苷元+Glc］-作為診斷離子，成功從重樓中鑒定出5個(gè)偏諾皂苷和10個(gè)薯蕷皂苷。

圖8 甾體皂苷可能的特征裂解方式及診斷離子結(jié)構(gòu)Fig．8 Proposed characteristic cleavages and diagnostic ions of steroidal saponins

6.2 C21甾體類（C21-steroides）和強(qiáng)心苷類（Cardiac glycosides）

診斷離子技術(shù)在C21甾體類及強(qiáng)心苷類中的應(yīng)用研究相對(duì)較少［93-94］。C21甾體皂苷類在ESI源正負(fù)離子模式下均容易離子化，分別產(chǎn)生豐度很高的［M+Na］+或［M-H］-，也會(huì)發(fā)生糖苷鍵的斷裂產(chǎn)生豐度較高的苷元離子和糖基離子；如果結(jié)構(gòu)中有酯基取代，還會(huì)發(fā)生酯鍵的斷裂形成豐度很高的［M+Na-HCOOH］+。Zheng等［93］利用以上3種類型的診斷離子從蔓生白薇中鑒定出9個(gè)C21甾體皂苷。強(qiáng)心苷類的主要裂解方式是糖苷鍵的斷裂，而苷元的裂解方式較多，包括RDA裂解、非共軛環(huán)裂解、羥基的脫水、脫甲基、酯鍵脫甲酸等。Zhu等［94］在ESI源正離子模式下將苷元骨架裂解產(chǎn)生的碎片作為診斷離子，如將B環(huán)裂解產(chǎn)生的［C9H11］+（m/z119．088 7）作為沙門苷元的診斷離子，將RDA裂解產(chǎn)生的［C21H25O2］+（m/z209．132 0）作為地高辛類的診斷離子，并綜合考慮苷元離子、苷元脫水離子以及糖基離子等信息，結(jié)合MDF等過濾策略最終從藤苦參中鑒定出11個(gè)強(qiáng)心苷元和19個(gè)強(qiáng)心苷類成分。

7 其它類（Others）

除了在上述類型成分中的應(yīng)用外，診斷離子技術(shù)在蒽醌類［95-100］、二苯乙烯類成分［35，95-98，100］、芥子油苷類［101］、紫草素類［102］、膽汁酸類［103］、蟾蜍二烯內(nèi)酯類［11］、吡喃酮類［35］、二苯基庚烷類［40］的鑒定中也有應(yīng)用，但研究相對(duì)較少，且通常采用ESI源。例如，蒽醌糖苷類（Anthraquinones）化合物在ESI源中易產(chǎn)生豐度較高的［M+H］+或［M-H］-，且易發(fā)生糖苷鍵的裂解產(chǎn)生苷元離子，苷元離子又會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生［苷元-H-CO］-或［苷元-H-CO2］-。潘智然等［98］采用［大黃素苷元-H］-、［大黃素苷元-HCO］-和［大黃素苷元-H-CO2］-作為診斷離子從虎杖中鑒定出8個(gè)蒽醌類衍生物，Wang等［95］從大黃中鑒定出34種蒽醌類成分。

8 結(jié)論與展望

診斷離子技術(shù)在中藥質(zhì)譜分析中的應(yīng)用包括以“苷元分子離子”、“苷元分子離子丟失特定基團(tuán)形成的碎片離子”和“骨架裂解形成的碎片離子”為診斷離子進(jìn)行不同類型化學(xué)成分的鑒定。前兩種策略需要系統(tǒng)考慮所有母核可能的取代基種類，從而有效覆蓋診斷離子的范圍，且第二種策略需要以“特征丟失”為基礎(chǔ)，常見的中性丟失如H2O、·CH3對(duì)化合物類型沒有區(qū)分能力，容易產(chǎn)生假陽性判斷；基于骨架裂解形成的診斷離子對(duì)于化合物結(jié)構(gòu)類型具有更好的專屬性，然而這類診斷離子的準(zhǔn)確獲取特別依賴于標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量和專家對(duì)裂解規(guī)律的認(rèn)識(shí)。近年來，借助計(jì)算機(jī)輔助從實(shí)際樣品或標(biāo)品中自動(dòng)尋找診斷離子的策略為診斷離子技術(shù)的發(fā)展提供了一種新的思路［26，33，76，79］，如Xu等［26］發(fā)展了一種“基于離子統(tǒng)計(jì)的策略（Ion statistics-based strategy）”，采用統(tǒng)計(jì)分析的方法尋找22個(gè)標(biāo)品的共有診斷離子，降低了判定“診斷離子”的難度及專家的依賴性。與此同時(shí)，如何借助計(jì)算機(jī)輔助從中藥復(fù)雜樣品中快速自動(dòng)提取并鑒定所有包含“診斷離子”的目標(biāo)成分也將是診斷離子技術(shù)的重要發(fā)展方向。