SARS-CoV-2疫苗接種對(duì)人體抗體產(chǎn)生和免疫功能的影響

譚美玉，殳 潔，宣彬彬，周麗達(dá)，李 紅，侯尚偉，盛慧明

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200336；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院虹橋醫(yī)學(xué)國(guó)際研究院，上海 200336）

2019年年底，新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）的出現(xiàn)導(dǎo)致了新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的全球大流行[1]。目前，世界各國(guó)學(xué)者已廣泛開(kāi)展對(duì)SARS-CoV-2的研究，在深入解析該病毒特性的同時(shí)，逐步開(kāi)展疫苗、治療性抗體和抗病毒藥物的研究工作。《新冠病毒疫苗接種技術(shù)指南（第一版）》建議18周歲及以上人群接種新冠病毒滅活疫苗（Vero細(xì)胞）2劑，2劑之間的接種時(shí)間間隔≥3周，并在8周內(nèi)盡早完成[2]。為了驗(yàn)證接種SARS-CoV-2滅活疫苗后機(jī)體的保護(hù)性抗體滴度，確認(rèn)疫苗接種效果，本研究擬分析SARS-CoV-2滅活疫苗接種者的相關(guān)指標(biāo)，探討疫苗接種后中和抗體的產(chǎn)生情況，以及將外周血T細(xì)胞亞群作為疫苗接種后維持免疫力的標(biāo)志物的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年12月—2021年10月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院進(jìn)行SARS-CoV-2滅活疫苗接種的醫(yī)務(wù)人員志愿者121名，其中男43名、女78名，年齡20～59歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有湖北省旅居史者，我國(guó)港、澳、臺(tái)地區(qū)居民，其他國(guó)家或地區(qū)的居民，2019年12月以來(lái)報(bào)告的COVID-19患者；（2）既往感染嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒；（3）接種SARS-CoV-2滅活疫苗14 d內(nèi)出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽、疼痛、腹瀉、呼吸困難或呼吸急促等不良反應(yīng)；（4）實(shí)驗(yàn)室檢查異常，血清特異性IgM或IgG陽(yáng)性；（5）處于孕期或哺乳期；（6）對(duì)疫苗中的任何成分過(guò)敏；（7）有癲癇發(fā)作或精神疾病史；（8）未按照知情同意書(shū)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)采集靜脈血或采血量不足2 mL。所有受試者均接種北京生物制品研究所生產(chǎn)的新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero細(xì)胞）（6.5 U/0.5 mL）。將所有對(duì)象根據(jù)接種劑次分為2劑次組（接種2劑疫苗）和3劑次組（接種3劑疫苗），分組情況見(jiàn)表1。本研究通過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（同仁倫審2021-007-01），所有志愿者均簽署知情同意書(shū)。

表1 121名志愿者的一般情況

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集2劑次組接種第1針疫苗前和接種第2針疫苗后7 d靜脈血2 mL；采集3劑次組接種第3針疫苗前（接種第2針后6個(gè)月）和接種第3針疫苗后7 d靜脈血2 mL。所有血液樣本均采用乙二胺四乙酸抗凝，離心分離血漿，置于-80℃冰箱保存，統(tǒng)一檢測(cè)SARS-CoV-2總抗體（IgG+IgM+IgA）、SARS-CoV-2 IgG抗體、SARS-CoV-2受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）特異性中和抗體。嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行操作。

1.2.2 SARS-CoV-2總抗體、SARS-CoV-2 IgG抗體、SARS-CoV-2 RBD特異性中和抗體的檢測(cè) 采用Caris2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀（廈門(mén)萬(wàn)泰公司）及配套試劑（化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法）檢測(cè)血漿SARS-CoV-2 IgG抗體和SARSCoV-2總抗體，以S/CO值≥1.0 COI判定為陽(yáng)性。采用Lumigenex時(shí)間分辨熒光免疫分析儀[光景生物科技（蘇州）有限公司]及配套試劑（時(shí)間分辨熒光免疫分析法）檢測(cè)SARS-CoV-2 RBD特異性中和抗體，基本原理：結(jié)合墊中含有標(biāo)記的SARS-CoV-2棘突（spike，S）蛋白R(shí)BD抗原，標(biāo)記的RBD蛋白可與固定在測(cè)試線（T線）上的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體結(jié)合。當(dāng)樣本中含有中和抗體時(shí)，樣本中的中和抗體競(jìng)爭(zhēng)性和RBD蛋白結(jié)合，可降低RBD與ACE2的結(jié)合效率，T線信號(hào)顯著下降，質(zhì)控線（C線）信號(hào)不變。人體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體含量越多，T/C值越小。

1.2.3 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 采用FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）及配套試劑（CD19-FITC、CD45-APC、CD3-FITC、CD4-BV510、CD8-Percp、CD16CD56-PE、CXCR5-BV421、ICOS-PE）檢測(cè)CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+輔助性T細(xì)胞、CD3+CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD16+CD56+自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞的百分比和絕對(duì)值，以及CD4+CXCR5+ICOS+濾泡輔助性T細(xì)胞（T follicular helper cell，Tfh）百分比。對(duì)于Tfh細(xì)胞的圈門(mén)，首先圈出FSC-SSC中的淋巴細(xì)胞群，然后圈出SSC-CD3+細(xì)胞，分別設(shè)門(mén)于CD3+CD4+細(xì)胞、CD4+CXCR5+細(xì)胞、CD4+CXCR5+ICOS+細(xì)胞。

1.2.4 血常規(guī)指標(biāo)及細(xì)胞因子檢測(cè) 采用BC-6800Plus全血細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞公司）及配套試劑檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)[白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、單核細(xì)胞比值、嗜酸性粒細(xì)胞比值、嗜堿性粒細(xì)胞比值、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值、單核細(xì)胞絕對(duì)值、嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值、嗜堿性粒細(xì)胞絕對(duì)值、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)]。采用多重微球流式免疫熒光發(fā)光法檢測(cè)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12P70、IL-17、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）、α-干擾素（interferon alpha，IFN-α）、γ-干擾素（interferon gamma，IFN-γ），試劑購(gòu)自青島瑞斯凱爾生物科技有限公司，檢測(cè)儀器為BriCyte E6流式細(xì)胞儀（深圳邁瑞公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2劑次組SARS-CoV-2總抗體和IgG抗體檢測(cè)結(jié)果

2劑次組配對(duì)的61名受試者中有57名在第2針疫苗接種后7 d檢出SARS-CoV-2總抗體和IgG抗體，抗體產(chǎn)生的有效率均為93.44%（57/61）。2劑次組SARS-CoV-2總抗體檢出值為0.09～590.24 COI，均值為（136.5±19.2）COI；IgG抗體檢出值為0.01～21.29 COI，均值為（11.1±0.8）COI。男性、女性SARS-CoV-2總抗體分別為（139.5±27.1）、（134.7±26.0）COI；I g G抗體檢出值分別為（11.3±1.3）、（11.1±0.9）COI；不同性別之間SARSCoV-2總抗體和IgG抗體差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2劑次組接種第2針疫苗后7 d SARSCoV-2總抗體和IgG抗體的產(chǎn)生情況見(jiàn)圖1。

圖1 2劑次組接種第2針疫苗后7 d SARS-CoV-2總抗體和IgG抗體的產(chǎn)生情況

2.2 2劑次組SARS-CoV-2中和抗體檢測(cè)結(jié)果

2劑次組中和抗體陽(yáng)性率為8 1.9 6%（50/61），接種前和接種第2針疫苗后7 d的T/C值分別為2.247±0.072、2.058±0.099，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 2劑次組接種前與接種第2針后7 d淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果比較

2劑次組接種前與接種第2針后7 d血常規(guī)指標(biāo)和CRP均正常。見(jiàn)表2。

表2 2劑次組接種前與接種第2針后7 d血常規(guī)和CRP檢測(cè)結(jié)果

2劑次組接種前與接種第2針后7 d的CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+輔助性T細(xì)胞、CD3+CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD16+CD56+NK細(xì)胞百分比和絕對(duì)值及IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），接種第2針后7 d的Tfh百分比（11.4%）顯著高于接種前（3.92%）（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 2劑次組接種前與接種第2針后7 d淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果比較

圖3 2劑次組接種前與接種第2針后7 d Tfh檢測(cè)結(jié)果比較

2.4 3劑次組第3針疫苗接種前后各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

3劑次組第3針疫苗接種前SARS-CoV-2總抗體、IgG抗體和中和抗體（T/C值）分別為（18.52±5.20）COI、（2.66±0.40）COI、2.30±0.05；第3針疫苗接種后7 d分別為（490.74±83.20）COI、（8.87±0.90）COI、1.87±0.05；SARS-CoV-2總抗體、IgG抗體的陽(yáng)性率分別為100%（30/30）、93.33%（28/30）。3劑次組第3針疫苗接種前、后SARS-CoV-2各項(xiàng)抗體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)圖4。

圖4 3劑次組第3針疫苗接種前后各項(xiàng)抗體檢測(cè)結(jié)果的比較

3劑次組第3針疫苗接種前、后CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+輔助T細(xì)胞、CD3+CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD16+CD56+NK細(xì)胞百分比和絕對(duì)值及IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 3劑次組第3針疫苗接種前后淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

COVID-19傳染性強(qiáng)，早期癥狀不典型，且無(wú)可用于治療的特效藥物[3-4]，因此目前防控COVID-19疫情最有效的方法就是接種疫苗。本研究志愿者接種的疫苗為北京生物制品研究所生產(chǎn)的新型冠狀病毒滅活疫苗。滅活疫苗與減毒活疫苗相比，采用的是非復(fù)制性抗原（死疫苗），其安全性好，但免疫原性較弱，因此必須加強(qiáng)免疫。

本研究共入組121名志愿者，年齡為20～59歲。由于最初采用的是2劑次免疫，因此本研究中2劑次組受試者完全配對(duì)。后根據(jù)防疫政策，改為接種加強(qiáng)針，因時(shí)間跨度比較大，3劑次組不能做到嚴(yán)格配對(duì)，第3針疫苗接種前和第3針疫苗接種后7 d各入組30名志愿者。本研究結(jié)果顯示，2劑次組男性、女性之間SARS-CoV-2總抗體及IgG抗體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。有學(xué)者對(duì)COVID-19恢復(fù)期血漿捐獻(xiàn)者做過(guò)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)男性的抗體水平高于女性，較年長(zhǎng)者的抗體水平高于較年輕者[5]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[5]不一致，提示疫苗接種后的體液免疫狀況與真實(shí)感染后的免疫狀況有所不同。疫苗接種后抗體產(chǎn)生的年齡段差異及性別差異，以及抗體持續(xù)時(shí)間需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量后深入分析。

本研究結(jié)果顯示，2劑次組第2針疫苗接種后7 d總抗體、IgG抗體產(chǎn)生的有效率均為93.44%（57/61），3劑次組第3針疫苗接種后7 d SARS-CoV-2總抗體、IgG抗體的陽(yáng)性率分別為100.00%、93.33%，提示接種SARS-CoV-2疫苗后，人體體液免疫被激活。本研究結(jié)果還顯示，在第3針疫苗接種前SARS-CoV-2總抗體和IgG抗體水平顯著降低，第3針疫苗接種后7 d SARS-CoV-2總抗體和IgG抗體水平顯著升高。說(shuō)明加強(qiáng)針疫苗刺激了接種者體內(nèi)原有的記憶B細(xì)胞、記憶T細(xì)胞快速產(chǎn)生大量抗體，提示按免疫程序接種2針疫苗后，再次接種疫苗加強(qiáng)針是非常有必要的。

SARS-CoV-2可通過(guò)S蛋白結(jié)合ACE2進(jìn)入人體細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制并誘導(dǎo)膜融合[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，與SARS-CoV-2 S蛋白受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體可防止病毒附著于宿主細(xì)胞并中和病毒[7]，功能性中和抗體的生成具有保護(hù)作用[8]。本研究結(jié)果顯示，2劑次組SARS-CoV-2 RBD中和抗體的陽(yáng)性率為81.96%。3劑次組中和抗體接種前T/C值為2.30±0.05，接種后為1.87±0.05，其接種前、后的T/C值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。提示接種SARS-CoV-2滅活疫苗后人體能產(chǎn)生有效的中和抗體。本研究2劑次組中和抗體陽(yáng)性率低于同一疫苗在國(guó)外Ⅲ期臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)（中和抗體陽(yáng)性率為99.52%）[9-10]，原因可能與本研究入組例數(shù)較少以及采血時(shí)間點(diǎn)不同有關(guān)。

從人體防御機(jī)制上看，病毒會(huì)被抗原呈遞細(xì)胞攝入，呈遞給輔助性T細(xì)胞，進(jìn)而激活B細(xì)胞，產(chǎn)生抗體[11]。Tfh的主要功能是參與B細(xì)胞分化過(guò)程中的信息傳遞，協(xié)助激活B細(xì)胞，促進(jìn)生發(fā)中心的形成和免疫球蛋白類別的轉(zhuǎn)換，維持長(zhǎng)時(shí)間的體液免疫應(yīng)答。Tfh對(duì)免疫系統(tǒng)的建立以及功能的完善非常重要，特別是針對(duì)感染性疾病的體液免疫起決定性調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，2劑次組接種第2針疫苗后7 d的Tfh百分比（11.4%）顯著高于接種前（3.92%）（P＜0.01）。提示接種SARS-CoV-2滅活疫苗后機(jī)體產(chǎn)生了有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。后續(xù)將對(duì)疫苗接種后的細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行跟蹤和評(píng)價(jià)，分析Tfh及其他細(xì)胞亞群與疫苗接種后免疫力維持之間的關(guān)系，全面探討疫苗接種對(duì)人體各種免疫功能狀態(tài)的影響。

機(jī)體對(duì)抗外來(lái)感染是一系列免疫相關(guān)功能表達(dá)的綜合作用，COVID-19重癥患者可因細(xì)胞因子的大量釋放而導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴。細(xì)胞因子風(fēng)暴是病毒性肺炎患者已知的死因之一[12]。石玉玲等[13]的研究結(jié)果顯示，有多種炎癥指標(biāo)，如CRP、IL-6、IL-8的水平變化與COVID-19關(guān)系密切。COVID-19患者在疾病的發(fā)生、發(fā)展中，IL-6和CRP均高于參考區(qū)間上限，并處于持續(xù)升高狀態(tài)，CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著下降，并隨著患者病情的好轉(zhuǎn)而逐漸恢復(fù)[14]。本研究結(jié)果顯示，2劑次組接種前與接種第2針后7 d、3劑次組第3針疫苗接種前與接種后7 d的12種細(xì)胞因子（IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-α、IFN-γ、TNF-α）水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示接種SARS-CoV-2滅活疫苗不會(huì)對(duì)人體免疫功能造成影響。

綜上所述，接種SARS-CoV-2滅活疫苗后機(jī)體可產(chǎn)生中和抗體和反應(yīng)性抗體，且不會(huì)影響人體免疫功能。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討邊緣區(qū)B細(xì)胞對(duì)調(diào)控SARS-CoV-2 S蛋白的免疫記憶機(jī)制，為COVID-19的早診早治提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。