關(guān)于腺病毒是否為近期兒童不明原因肝炎病原的思考

盧麗娟，徐 錦

（國家兒童醫(yī)學(xué)中心 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海 201102）

自2022年4月初英國向世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）通報英格蘭地區(qū)發(fā)現(xiàn)兒童不明原因肝炎病例以來，其他國家和地區(qū)也陸續(xù)出現(xiàn)了兒童不明原因肝炎病例[1]。以往不明原因的兒童急性肝炎一般為散發(fā)，但近期報道的兒童不明原因急性肝炎2個月內(nèi)在全球多個國家和地區(qū)呈現(xiàn)出短期集中發(fā)生的趨勢。截至2022年5月26日，已有33個國家或地區(qū)向WHO報告了650例兒童不明原因肝炎病例[2]。明確病因?qū)τ趦和幻髟蚋窝椎脑\治有著極其重要的指導(dǎo)意義。

1 近期兒童不明原因肝炎的定義

針對近期兒童不明原因肝炎的相關(guān)報道，2022年4月23日，WHO修訂了兒童不明原因肝炎病例的定義：（1）確診病例（confirmed case），目前尚不適用；（2）可疑病例（possible case），自2021年10月1日起，患有急性肝炎（非甲、乙、丙、丁、戊型病毒肝炎），且丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶＞500 U/L的患兒，年齡＜16歲；（3）流行病學(xué)相關(guān)病例（epi-linked case），自2021年10月1日起，與疑似病例密切接觸的任何年齡的急性肝炎（非甲、乙、丙、丁、戊型病毒肝炎） 患兒；如果尚無甲、乙、丙、丁、戊型病毒肝炎血清學(xué)檢測結(jié)果，但滿足其他標(biāo)準(zhǔn)，可被列為“分類待定（pending classification）”，對其臨床表現(xiàn)有其他解釋的病例不考慮在內(nèi)[1]。

2 近期兒童不明原因肝炎的流行病學(xué)回顧

近期出現(xiàn)的多國兒童不明原因肝炎病例的流行病學(xué)資料顯示，患兒既往身體健康，年齡以＜10歲為主，病例間缺乏流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，且未發(fā)現(xiàn)有新型冠狀病毒肺炎疫情發(fā)生地旅居史，無特殊藥物、食物和飲水暴露接觸史。

2022年4月14日，英國蘇格蘭地區(qū)報道了13例確診為兒童不明原因肝炎的患兒，年齡均＜10歲，中位年齡為3.9歲，除1例患兒可能有潛在基礎(chǔ)性疾病外，其他患兒此前身體健康狀況良好，均未接種新型冠狀病毒疫苗；患兒除黃疸外，還出現(xiàn)了以嘔吐、腹痛、腹瀉為主的腸道癥狀，所有患兒均未出現(xiàn)發(fā)熱癥狀；病原學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，部分患兒進行了除常見的肝炎病毒外的其他病毒，如腸道病毒、6和7型皰疹病毒、人腺病毒的檢測，有5例患兒人腺病毒陽性（2份咽拭子樣本、2份全血樣本、1份糞便樣本），3例患兒近期感染過新型冠狀病毒，2例患兒有新型冠狀病毒感染史[3]。

2022年4月21日，以色列報道了12例兒童不明原因肝炎病例，主要表現(xiàn)為急性嚴(yán)重肝炎，氨基轉(zhuǎn)移酶水平異常升高，常伴有黃疸，且部分患兒在出現(xiàn)肝炎相關(guān)的癥狀前，還出現(xiàn)過腹痛、腹瀉、嘔吐等消化道癥狀；在排除了相關(guān)病毒感染和各種毒素、自身免疫、家族及遺傳疾病等因素后，所有確診病例的共同點是在肝炎發(fā)病前約15周感染過新型冠狀病毒[4]。

2022年4月29日，美國疾病預(yù)防與控制中心報道，2021年10—11月，亞拉巴馬州有9名兒童因重癥肝炎入院，患兒之間沒有任何流行病學(xué)關(guān)聯(lián)，年齡均＜10歲，入院前的癥狀包括嘔吐和腹瀉，入院時有黃疸，氨基轉(zhuǎn)移酶升高；對9例患兒的全血樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)所有患兒均感染了腺病毒，其中5例患兒樣本中的腺病毒測序成功，基因型均為41型，所有患兒新型冠狀病毒核酸檢測均為陰性；有6例患兒同時檢出EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）DNA，但EBV IgM均為陰性；多例患兒同時檢測到腸道病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒等，缺乏新型冠狀病毒血清學(xué)相關(guān)檢測結(jié)果；有6例患兒肝臟組織活檢結(jié)果提示肝臟組織均有不同程度的損傷，但未發(fā)現(xiàn)腺病毒包涵體和腺病毒感染的免疫組化證據(jù)，且電子顯微鏡下也未觀察到腺病毒顆粒[5]。

2022年5月6日，英國衛(wèi)生安全局（UK Health Security Agency，UKHSA）對全國163例兒童不明原因肝炎病例進行了報道，并對英格蘭地區(qū)的118例不明原因肝炎兒童病例的臨床特征和組織病理學(xué)、病原學(xué)檢測結(jié)果進行了詳細(xì)的分析：118例患兒年齡大多為3～5歲，臨床表現(xiàn)包括黃疸、嘔吐、大便灰白、腹瀉、腹痛、嗜睡、發(fā)熱及呼吸道癥狀；14例患兒的組織活檢結(jié)果顯示為輕度到重度的肝壞死，9例患兒肝臟切片顯示肝細(xì)胞尚未出現(xiàn)相關(guān)的免疫反應(yīng)，且沒有發(fā)現(xiàn)與腺病毒感染相關(guān)的包涵體，1例患兒行肝組織腺病毒檢測，結(jié)果為陰性；有126例患兒行全血腺病毒檢測，其中91例患兒腺病毒陽性，18例患兒全基因組測序結(jié)果顯示腺病毒為41型；英格蘭地區(qū)118例患兒中，有97例患兒入院時進行了新型冠狀病毒核酸檢測，結(jié)果顯示，11例患兒為陽性，有3例患兒在入院前8周內(nèi)新型冠狀病毒核酸檢測為陽性[6]。

3 近期兒童不明原因肝炎的病因分析

根據(jù)不同國家和地區(qū)針對本國兒童不明原因肝炎病例的報道，已有眾多病因假說被提出，一些機構(gòu)和專家認(rèn)為此次兒童不明原因肝炎的發(fā)生可能與41型人腺病毒感染有關(guān)。

3.1 人腺病毒的生物學(xué)特征和致病特點

人腺病毒屬于腺病毒科哺乳動物腺病毒屬，1953年，該病毒首次在切除的自發(fā)性退行性病變患兒腺體細(xì)胞培養(yǎng)物中被發(fā)現(xiàn)。腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，基因全長34 000～36 000 bp，病毒顆粒是直徑為70～100 nm的二十面體對稱結(jié)構(gòu)，由3種主要衣殼蛋白（六鄰體結(jié)構(gòu)蛋白、五鄰體結(jié)構(gòu)蛋白和纖維蛋白）和4種次要衣殼蛋白組成。根據(jù)基因序列差異和生物化學(xué)特性等的不同，人腺病毒分為A～G 7個亞種和104種型別，其中1～51型為血清型；52～104型均為基因型，主要根據(jù)衣殼蛋白基因序列的差異或重組情況進行分型[7]。

人腺病毒感染機體可引發(fā)一系列臨床癥狀，相關(guān)的疾病類型與腺病毒的型別、宿主的免疫狀態(tài)和感染部位有著極大的關(guān)系。不同型別的腺病毒具有不同的組織趨向性，導(dǎo)致機體發(fā)生不同的疾病。腺病毒最常見的感染部位是呼吸道、眼結(jié)膜和腸道。A、F和G亞種腺病毒與胃腸道感染關(guān)系密切，F(xiàn)亞種僅感染胃腸道，故又被稱為腸道腺病毒，包括40和41型2種型別。除此以外，在少數(shù)情況下，腺病毒還可引發(fā)腦膜炎、心肌炎、膀胱炎、肝炎等[6]。腺病毒在正常人群中引發(fā)的感染通常為輕度的、具有一系列臨床表現(xiàn)的自限性疾病，嬰幼兒感染率較高；但在免疫缺陷患者中，腺病毒感染則會引發(fā)比較嚴(yán)重的疾病和并發(fā)癥，尤其在接受造血干細(xì)胞和實體器官移植、先天性免疫缺陷及人類免疫缺陷病毒感染的患者中，可能會引發(fā)結(jié)腸炎、肝炎等，且腺病毒感染會增加上述人群的死亡風(fēng)險。此外，腺病毒感染也可能由已經(jīng)存在于個人或移植器官中潛在病毒的重新激活引起。

雖然正常人群首次感染腺病毒時臨床癥狀比較輕，但腺病毒可像皰疹類病毒一樣在機體中呈持續(xù)感染狀態(tài)或潛伏狀態(tài)，這種情況在C亞種腺病毒中尤其明顯[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，C亞種腺病毒中的1、2和5型通過低級別復(fù)制在扁桃體中可持續(xù)存活數(shù)年，扁桃體和腺樣結(jié)構(gòu)中的淋巴細(xì)胞是腺病毒的常見潛伏部位[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒和兒童經(jīng)歷過上呼吸道感染（有癥狀或無癥狀）后，腺病毒可在腸道內(nèi)持續(xù)存在，有15%的感染者通過糞便排出腺病毒的時間可為3個月～1年，部分感染者的排毒時間甚至更長；腸道黏膜淋巴細(xì)胞也是腺病毒潛伏感染的部位之一；此外，不同型別的腺病毒在患者的腸道組織中均有檢出，包括B、C和E亞種，部分患者的腸道組織中可同時檢測到多種型別的腺病毒[9]。

3.2 腺病毒肝炎

目前，我國尚無對腺病毒肝炎病例的報道。國外1篇對腺病毒肝炎的Meta分析結(jié)果顯示，確診為腺病毒肝炎的89例患者中，有57例年齡＜18歲，中位年齡為1歲；89例患者中，有43例患者確診前接受了肝臟移植，19例接受了骨髓移植，11例接受過化療，5例合并免疫缺陷，4例感染了人類免疫缺陷病毒，2例接受了心臟移植，還有2例接受了腎臟移植；對其中臨床信息完整的74例患者進行分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)熱是最常見的體征，其次為嗜睡和腹瀉，黃疸或肝臟腫大少見；采用免疫組化染色、電子顯微鏡鏡檢、聚合酶鏈反應(yīng)及熒光原位雜交技術(shù)對其中64例患者的肝臟組織進行了組織病理檢測，以確定腺病毒肝炎的診斷，結(jié)果顯示，有60例患者出現(xiàn)了肝壞死，46例患者的肝細(xì)胞中檢測到腺病毒包涵體，13例患者肝組織中發(fā)現(xiàn)涂抹細(xì)胞；此外，采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在54例患者的不同組織中分離出腺病毒；對患者感染的腺病毒進行分型發(fā)現(xiàn)，C亞種的2和5型是最常見的型別，未檢測到F亞種中的41型；對其中12例患者的血漿進行腺病毒核酸檢測，有11例患者的血漿中檢測到了腺病毒；89例腺病毒肝炎患者中，最終有65例死亡[10]。

另外1篇對12例腺病毒肝炎病例（兒童8例、成人4例）的回顧性分析結(jié)果顯示，8例患兒中有7例曾接受過肝移植，1例為白血病患兒；4例成人患者中有1例患有慢性淋巴細(xì)胞白血病，2例正在進行造血干細(xì)胞移植，1例患有淋巴細(xì)胞漿細(xì)胞瘤；對所有患者的肝組織進行組織病理檢測，發(fā)現(xiàn)均有不同程度的肝壞死，且在10例患者的肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了腺病毒包涵體，所有患者的肝臟組織中均檢測到腺病毒；采用細(xì)胞培養(yǎng)、血清學(xué)檢測或聚合酶鏈反應(yīng)在患者的血液、尿液或糞便中均檢測到腺病毒，其中5例患兒在腺病毒肝炎發(fā)病后的4～21 d死亡[11]。

3.3 近期兒童不明原因肝炎可能的病原仍不明確

在以往報道的腺病毒肝炎病例中，能夠引發(fā)肝炎的腺病毒有B亞組的3、7型和C亞組的1、2、5型，目前尚未發(fā)現(xiàn)F亞組的41型腺病毒可致兒童發(fā)生肝炎[7]，在腺病毒肝炎患者的肝臟組織樣本中均檢測到腺病毒或病毒包涵體、涂抹細(xì)胞[10]。而近期兒童不明原因肝炎病例僅在部分患兒的全血、咽拭子、糞便樣本中檢測到41型腺病毒，在肝臟組織和血漿樣本中均未檢測到腺病毒，此前的研究已經(jīng)證實了腺病毒可潛伏在嬰幼兒的腸道黏膜、扁桃體和腺體結(jié)構(gòu)的淋巴細(xì)胞中，且在扁桃體和腺體結(jié)構(gòu)淋巴細(xì)胞中的潛伏感染可長達1年，甚至更長，因此僅在患兒全血、咽拭子和糞便樣本中檢測到腺病毒尚不足以證明近期兒童不明原因肝炎是由41型腺病毒導(dǎo)致的。另外，相關(guān)病例肝臟組織病理學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)腺病毒及腺病毒感染后肝細(xì)胞中應(yīng)出現(xiàn)的病毒包涵體或涂抹細(xì)胞。在以往腺病毒肝炎病例中，發(fā)熱是最常見的體征，而近期不明原因肝炎患兒以黃疸和腸道癥狀為主要臨床體征。因此，41型腺病毒是否是近期兒童不明原因肝炎直接的致病原因，還需要研究者對患兒的血液樣本、肝臟組織等進行更為詳盡的腺病毒檢測，才能進行正確的病因診斷。

有研究發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒可在嬰幼兒的胃腸道中持續(xù)排出，這種持續(xù)排毒狀態(tài)可能導(dǎo)致腸道黏膜屏障受損，不斷溢出腸道的新型冠狀病毒抗原又可引發(fā)廣泛且非特異的T細(xì)胞激活，導(dǎo)致機體持續(xù)處于免疫激活狀態(tài)[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒感染后引發(fā)的兒童多系統(tǒng)綜合征（multisystem inflammatory syndrome in children，MIS-C）與從腸道溢出的新型冠狀病毒抗原引發(fā)的高炎癥反應(yīng)狀態(tài)有關(guān)[13]。雖然近期兒童不明原因肝炎病例的報道并未就患兒新型冠狀病毒感染情況進行詳盡的說明，但并不意味著這些患兒從未感染過新型冠狀病毒，該方面的信息還需要完善。以色列和美國的2項研究發(fā)現(xiàn)，所有不明原因肝炎患兒均感染過新型冠狀病毒，且并未檢測到41型腺病毒[4，14]，因此近期兒童不明原因肝炎是否是與嬰幼兒感染新型冠狀病毒后引發(fā)的高炎癥反應(yīng)狀態(tài)有關(guān)，還需對這些患兒糞便樣本中新型冠狀病毒的排毒持續(xù)時間、T細(xì)胞的激活狀態(tài)等開展更為全面的研究。

有研究發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒刺突蛋白S1、S2切割位點的氨基酸序列和構(gòu)象與超級抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B非常相似，該基序被認(rèn)為是新型冠狀病毒的超級抗原[15]。超級抗原可以不需要抗原提呈及人類主要組織相容性復(fù)合體的限制持續(xù)激活T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，感染了腺病毒的小鼠在感染金黃色葡萄球菌腸毒素B后，可增強金黃色葡萄球菌腸毒素B介導(dǎo)的T細(xì)胞激活效應(yīng)，導(dǎo)致γ干擾素過量產(chǎn)生，加重機體中毒性休克的臨床表現(xiàn)，并最終導(dǎo)致小鼠肝衰竭和死亡[16]。由于在部分近期不明原因肝炎患兒的全血樣本、糞便樣本和鼻咽拭子樣本中檢測到了41型腺病毒，此類患兒的發(fā)病是否是41型腺病毒和新型冠狀病毒中超級抗原共同作用的結(jié)果，值得開展更深入的研究。

3.4 明確病原尚需開展的相關(guān)工作

近期兒童不明原因肝炎病毒種類的確定，需要結(jié)合多種方法，并對多種樣本進行病原學(xué)檢測。對已知的致病病毒可采用細(xì)胞培養(yǎng)、電子顯微鏡鏡檢和組織病理學(xué)檢測和原位分子雜交技術(shù)、免疫熒光試驗、聚合酶鏈反應(yīng)等檢測尿液、糞便、血液、鼻咽分泌物、肺泡灌洗液和其他相關(guān)組織樣本，在排除了已知病毒后，建議針對多種臨床樣本行宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）。

（1）細(xì)胞培養(yǎng)。許多病毒均可以通過細(xì)胞培養(yǎng)的方式分離到病原體，有些可導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生特征性的變化。如腺病毒，可采用人肺腺癌細(xì)胞系（A549細(xì)胞系）、人喉癌上皮細(xì)胞系（Hep-2細(xì)胞系）、人宮頸癌細(xì)胞系（Hela細(xì)胞系）進行分離，大部分的腺病毒亞型感染細(xì)胞后數(shù)日會出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)——葡萄串珠樣改變，在細(xì)胞中出現(xiàn)病毒包涵體或特有的涂抹細(xì)胞。

（2）電子顯微鏡鏡檢。電子顯微鏡技術(shù)在幾十年前是檢測臨床樣本中病毒的重要方法，該方法雖然靈敏度較低，但特異性高，必要時仍可以使用。

（3）組織病理學(xué)檢查。組織病理學(xué)檢查是病毒浸潤性感染的金標(biāo)準(zhǔn)，如通過蘇木精-伊紅染色可以觀察到組織不同程度的增生和炎癥情況，通過原位和免疫過氧化物酶雜交技術(shù)，結(jié)合腺病毒感染時在組織細(xì)胞中出現(xiàn)的涂抹細(xì)胞和病毒包涵體，即可初步診斷腺病毒感染。

（4）免疫熒光試驗。免疫熒光試驗是常用的檢測方法，可以對鼻咽部脫落細(xì)胞和肝組織中的腺病毒進行抗原檢測。

（5）病毒核酸檢測。核酸檢測技術(shù)以其高靈敏度、高特異性和快速的特點已被廣泛應(yīng)用在病原檢測中。目前，核酸檢測技術(shù)已較成熟，其中又以實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的應(yīng)用最為廣泛，可以對包括肝組織在內(nèi)的多種類型樣本進行病毒核酸的檢測。

（6）病毒基因分型。確定基因型別對于病原的診斷和病原體變異的監(jiān)測有著重要的指導(dǎo)意義。一般先對普通聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物進行一代測序，再通過序列比對得知病毒的型別。

（7）mNGS。mNGS的優(yōu)勢不僅在于能夠發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法無法檢測到的未知病原，更重要的是能夠在短時間內(nèi)（平均48 h）直接對臨床樣本中的所有病原體核酸進行高通量測序，無需特異性擴增，更不需要微生物培養(yǎng)，通過生物信息學(xué)判讀分析核酸序列獲得病原體的種類和豐度，以及病原體的重組等信息，可為臨床診斷提供更為全面的病原體譜。

4 總結(jié)與展望

雖然我國目前尚無近期發(fā)生于其他國家和地區(qū)兒童不明原因肝炎病例的報道，但仍需密切監(jiān)測和關(guān)注國外的相關(guān)報道。最近，我國多地新型冠狀病毒肺炎疫情形勢復(fù)雜，鑒于以色列12例不明原因肝炎患兒在確診約15周前均感染過新型冠狀病毒，需警惕現(xiàn)在或未來我國兒童不明原因肝炎發(fā)生的可能。同時，針對其病原學(xué)的診斷，相關(guān)實驗室應(yīng)盡快健全實驗室檢測能力，制定和完善兒童不明原因肝炎病原學(xué)的診斷流程，以便在出現(xiàn)相關(guān)病例時能夠及時和準(zhǔn)確地幫助臨床進行診斷與鑒別診斷。