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    miR-21靶向調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路對膽管癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

    2022-09-19 13:44:34周麗媛趙國棟孫樹剛
    臨床肝膽病雜志 2022年9期
    關(guān)鍵詞:報(bào)告基因膽管癌空白對照

    施 喆, 周麗媛, 趙國棟, 孫樹剛, 薛 亮

    河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 a.普外科, b.婦科, 河北 邯鄲 056000

    膽管癌源是肝膽系統(tǒng)中高度致命的惡性腫瘤,近年來全球范圍內(nèi)發(fā)病率不斷上升[1-2]。目前膽管癌病因尚不明確,手術(shù)切除是其主要的根治性手段。但由于膽管癌早期癥狀不明顯且診斷困難,大多數(shù)患者初診時(shí)已處于晚期,總體手術(shù)切除率極低[3]。此外,膽管癌具有高侵襲轉(zhuǎn)移性,惡性進(jìn)展迅速,導(dǎo)致總體預(yù)后差、病死率高,嚴(yán)重威脅人類健康[4]。因此探索新的膽管癌治療方式具有重要意義。已知腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是由多基因調(diào)控,其中原癌基因和抑癌基因的激活與失活發(fā)揮重要功能[5]。隨著腫瘤細(xì)胞增殖凋亡研究深入,多數(shù)原癌基因、抑癌基因及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為腫瘤靶向治療的關(guān)鍵點(diǎn)[6]。蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)/磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路在惡性腫瘤細(xì)胞的增殖分化過程中起重要作用[7]。PTEN是目前公認(rèn)的抑癌基因之一,研究[8]表明過表達(dá)PTEN可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路并抑制膽管癌細(xì)胞遷移能力。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)可靶向調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后翻譯或使其降解,研究[9-10]表明miRNA-21(miR-21)參與膽管癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲,并具有抑制結(jié)直腸癌的增殖和調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路的作用。然而miR-21能否通過靶向PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控膽管癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為仍不清楚。鑒于此,本研究選取人膽管癌細(xì)胞株QBC939開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn),揭示miR-21靶向PTEN/PI3K/Akt通路調(diào)控人膽管癌細(xì)胞株QBC939惡性行為的分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑 人膽管癌細(xì)胞株QBC939(由武漢細(xì)胞研究所提供);脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(LipofectamineTM2000)試劑盒(購自北京索萊寶科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):11668-027);人miR-21模擬物(hsa-miR-21 mimics,合成序列:5′-UAGCUUAUCAGCUGAUGUUGA-3′)(pGFP-hsa-miR-21 mimics)過表達(dá)質(zhì)粒、hsa-miR-21抑制劑(hsa-miR-21 inhibitor,合成序列:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)(pGFP-hsa-miR-21 inhibitor)質(zhì)粒、hsa-miR-21 inhibitor陰性對照(negative control inhibitor,NC inhibitor,合成序列:5′-CAGUACUUUUGUGUAGUAGUACAA-3′)(pGFP-NC inhibitor)質(zhì)粒、miR-21 mimics、miR-21 mimics陰性對照(negative control mimics,NC mimics)(合成序列:5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′)[均由和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司合成];四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)溶液(購自上海麥克林生化科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):M864643);凋亡檢測試劑盒(購自杭州諾揚(yáng)生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):FXP023-020-20);基質(zhì)膠(Matrigel)(購自上海慧穎生物科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):356234);侵襲小室(Transwell)(購自北京明陽科華生物科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):BD-353503);miR-21、PTEN、PI3K、Akt、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因所需實(shí)時(shí)-逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)引物、野生型和突變型PTEN-3′UTR引物(均由重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司合成);總RNA提取試劑盒[購自天根生化科技(北京)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):DP419];二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒(購自北京索萊寶科技有限公司,生產(chǎn)批號(hào):PC0020);兔抗人PTEN、PI3K、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、mTOR和β-actin單克隆抗體(一抗)、羊抗兔PTEN、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和β-actin熒光標(biāo)記多克隆抗體(二抗)(均購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司,生產(chǎn)批號(hào):H00005728-K、ab226826、PAB1310、PAB19236、PAB18865、ab179467、ab195056、ab40755、ab372015、ab531250、5048S、ab11003);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒[購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司,生產(chǎn)批號(hào):11401];PureLinkTMPro 96基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒(購自賽默飛世爾科技公司,生產(chǎn)批號(hào):K182104A);不產(chǎn)色鏈霉菌第二型(Streptomyces achromogenes Ⅱ,Sac Ⅱ)和流感嗜血桿菌d第三型(Haemophilus influenzae d Ⅲ,Hind Ⅲ)內(nèi)切酶(均購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司,生產(chǎn)批號(hào):R0157S、R0104V);pmiRGLO載體(購自湖南科愛醫(yī)療器械有限公司,生產(chǎn)批號(hào):VT1439);質(zhì)粒提取試劑盒(購自上海力敏實(shí)業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):12145)。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 MTP-601F型酶標(biāo)儀[購自天美(中國)科學(xué)儀器有限公司];Agilent NovoCyte Quanteon型流式細(xì)胞儀[購自安捷倫科技(中國)有限公司];BD-YG3002型熒光顯微鏡(購自深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司);TS100型倒置顯微鏡(購自武漢醫(yī)捷迅安商貿(mào)有限公司);H12943型劃痕儀(購自北京恒奧德儀器儀表有限公司);MA-6000型PCR儀(購自蘇州雅睿生物技術(shù)股份有限公司);MS型實(shí)時(shí)凝膠電泳系統(tǒng)(購自北京興聯(lián)商貿(mào)有限公司);Image J v1.8.0軟件(購自美國國立衛(wèi)生研究院)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將人膽管癌細(xì)胞株QBC939接種至含10%胎牛血清的無菌1640液體細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-1640)中,37 ℃、5% CO2恒溫箱培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對數(shù)期的癌細(xì)胞接種至6孔板,待細(xì)胞貼壁至70%左右時(shí)更換培養(yǎng)液。以LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作:加入轉(zhuǎn)染試劑后,逐滴加入hsa-miR-21 mimics過表達(dá)報(bào)告基因質(zhì)粒,培養(yǎng)4~6 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,將該組細(xì)胞記為過表達(dá)組;同法獲得轉(zhuǎn)染hsa-miR-21 inhibitor報(bào)告基因質(zhì)粒和NC inhibitor報(bào)告基因質(zhì)粒的QBC939細(xì)胞,分別記為沉默組和空載組;同時(shí)將未經(jīng)處理的QBC939細(xì)胞株記為空白對照組。每組5個(gè)復(fù)孔,并通過熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率。

    1.2.2 MTT比色法檢測各組細(xì)胞增殖抑制率 胰蛋白酶消化,每孔加20 μL 5 mg/mL MTT溶液,4 h后棄培養(yǎng)液,加入150 μL二甲基亞砜,振蕩5 min,在酶標(biāo)儀上用490 nm波長測定OD值,計(jì)算0~72 h每組細(xì)胞增殖活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取OD的平均值。

    1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率 胰蛋白酶消化,離心,預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度1×106個(gè)/mL。加入10 μL磷脂結(jié)合蛋白V避光室溫反應(yīng)10 min,預(yù)冷PBS洗滌,加入4 μL碘化丙啶,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

    1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 向Transwell中加60 μL 1.5 mg/mL的Matrigel,均勻鋪在小室上層濾膜,37 ℃孵育1 h成膜以模擬基底膜結(jié)構(gòu)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL,將細(xì)胞加入Transwell小室上室內(nèi),每孔200 μL,下孔加入RPMI-1640培養(yǎng)基后于37 ℃、5% CO2恒溫箱培養(yǎng)24 h。隨后分別經(jīng)過PBS洗滌、多聚甲醛固定、蒸餾水洗滌結(jié)晶紫染色以及洗滌風(fēng)干等步驟后獲取基底膜。倒置顯微鏡下分4個(gè)區(qū)域,每個(gè)區(qū)域隨機(jī)選取1個(gè)視野,觀察拍照并計(jì)數(shù)。每組3張膜,穿膜細(xì)胞數(shù)取平均值。

    1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞接種到6孔板中,細(xì)胞達(dá)到95%融合,用劃痕儀對準(zhǔn)6孔板下端中央部位輕輕劃痕。RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕漂洗3次后,37 ℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)48 h,倒置顯微鏡拍照,觀察劃痕愈合情況。

    1.2.6 RT-qPCR檢測miR-21、PI3K、Akt、mTOR和PTEN mRNA表達(dá) 提取各組細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,根據(jù)引物序列進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 s變性;55 ℃ 30 s退火;72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。引物序列見表1。本研究選取β-actin作為內(nèi)參基因,采用相對定量法[11]比較各組細(xì)胞待測基因mRNA表達(dá)差異。待測基因ΔΔCt值=[待測基因mRNA平均Ct值(轉(zhuǎn)染組)- β-actin mRNA平均Ct值(轉(zhuǎn)染組)]-[待測基因mRNA平均Ct值(空白對照組)- β-actin mRNA平均Ct值(空白對照組)]。以2-ΔΔCt表示各組待測基因 mRNA表達(dá)的倍比關(guān)系。

    1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting,WB)檢測PTEN、PI3K、Akt和mTOR蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液,提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。BCA法測定蛋白濃度,調(diào)整蛋白終濃度為5 μg/μL。WB凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜,脫脂奶粉封閉,加入一抗,4 ℃孵育過夜,將聚偏二氟乙烯膜置于含有二抗試管中,室溫孵育,顯色反應(yīng),掃描膠片后用Image J軟件分析蛋白印跡灰度值。

    表1 PCR反應(yīng)引物序列Table 1 The primer sequences of PCR reaction

    1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 采用TargetScan數(shù)據(jù)庫[12]預(yù)測miR-21的靶基因。構(gòu)建野生型和突變型PTEN-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒。野生型PTEN-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒:獲取細(xì)胞總DNA后,根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物(引物包含Sac Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)),以細(xì)胞總DNA為模板經(jīng)2次PCR擴(kuò)增出所需片段;對瓊脂糖電泳回收的PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行Sac Ⅱ和Hind Ⅲ雙酶切,同時(shí)將報(bào)告質(zhì)粒pmiRGLO進(jìn)行雙酶切,回收兩者雙酶切電泳條帶;連接兩者雙酶切產(chǎn)物;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中;選取合適單菌落,提取重組質(zhì)粒,經(jīng)鑒定序列信息與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄序列一致。野生型PTEN-3′UTR引物序列:上游引物5′-CCACCAGAGCTCTCTTGTGCTGTGCAGCAG-3′,下游引物5′-CCAACGAAGCCTGTGATGGCATTCACTGAACC-3′。突變型PTEN-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒:通過引物搭橋法對PTEN-3′UTR進(jìn)行定點(diǎn)突變,用設(shè)計(jì)好的上下游引物分別PCR擴(kuò)增出PTEN-3′UTR上游和下游突變產(chǎn)物;搭橋PCR程序進(jìn)行搭橋連接,以搭橋PCR產(chǎn)物為模板,PCR擴(kuò)增并電泳回收,后續(xù)過程同野生型PTEN-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建過程一致,經(jīng)鑒定連接產(chǎn)物的序列一致。突變型PTEN-3′UTR引物序列:上游引物5′-AACCGCGGTAAGAGAAATAAGCACCGTTTTCCAAG-3′,下游引物5′-AAAACGGTGCTTATTTCTCTTACCGCGGTTCAGATGTCTGAAGAT-3′。將野生型和突變型PTEN-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒、miR-21 mimics及NC mimics轉(zhuǎn)染至QBC939細(xì)胞中,48 h后進(jìn)行雙熒光素酶檢測。各組相對熒光強(qiáng)度=各組螢火蟲熒光強(qiáng)度/海腎熒光強(qiáng)度。

    2 結(jié)果

    2.1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 熒光顯微鏡下觀察,轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞表達(dá)綠色熒光,未轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞無熒光??蛰d組、過表達(dá)組和沉默組轉(zhuǎn)染效率分別為(90.27±18.03)%、(91.43±18.26)%和(92.16±18.41)%(圖1)。

    圖1 轉(zhuǎn)染后QBC939細(xì)胞熒光圖(×100)

    2.2 各組細(xì)胞增殖活性和凋亡率 MTT 結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染處理后24~72 h,與空白對照組和空載組比較,過表達(dá)組QBC939細(xì)胞增殖活性明顯提高(P值均<0.05)(圖2),凋亡率顯著下降(P值均<0.01)(圖3,表2);與空白對照組、空載組和過表達(dá)組比較,沉默組細(xì)胞增殖活性顯著降低(P值均<0.01)(圖2),而凋亡率顯著上升(P值均<0.01)(圖3,表2)。

    圖2 各組QBC939細(xì)胞增殖活性

    表2 各組QBC939細(xì)胞凋亡率Table 2 The apoptosis rates of QBC939 cells in each group

    2.3 各組細(xì)胞遷移和侵襲活性 與空白對照組和空載組比較,過表達(dá)組QBC939細(xì)胞遷移率和穿膜數(shù)目均顯著增高(P值均<0.01);與空白對照組、空載組和過表達(dá)組比較,沉默組遷移率和穿膜數(shù)目均顯著下降(P值均<0.01)(表3,圖4、5)。

    表3 各組QBC939細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of in vitro invasion experiments of QBC939 cells in each group

    2.4 各組細(xì)胞miR-21、PI3K、Akt、mTOR和PTEN mRNA表達(dá) 與空白對照組和空載組比較,過表達(dá)組miR-21、PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)均升高,PTEN mRNA表達(dá)下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05);與空白對照組、空載組和過表達(dá)組比較,沉默組miR-21、PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)均下降,PTEN mRNA表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖6)。

    圖3 流式細(xì)胞檢測各組QBC939細(xì)胞凋亡率Figure 3 Flow cytometry examined apoptosis rates of QBC939 cells in each group

    圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    圖5 Transwell小室試驗(yàn)結(jié)果(結(jié)晶紫染色,×100)

    注:與空白對照組比較,#P<0.05;與空載組比較,△P<0.05;與過

    2.5 各組細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白表達(dá) 與空白對照組和空載組比較,過表達(dá)組PI3K、Akt、p-Akt和mTOR蛋白表達(dá)均顯著升高,PTEN蛋白表達(dá)顯著下降(P值均<0.01);與空白對照組、空載組和過表達(dá)組比較,沉默組PI3K、Akt、p-Akt和mTOR蛋白表達(dá)均顯著下降,PTEN蛋白表達(dá)顯著升高(P值均<0.01)(圖7,表4)。

    2.6 miR-21靶向PTEN的驗(yàn)證 TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測PTEN為miR-21潛在靶基因,PTEN基因3′UTR與miR-21有6個(gè)堿基位點(diǎn)互補(bǔ)配對(圖8)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,miR-21 mimics和野生型PTEN-3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度較NC mimics和野生型PTEN-3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯著降低(P<0.05);miR-21 mimics和突變型PTEN-3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中相對熒光強(qiáng)度較NC mimics和突變型PTEN-3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖9)。

    圖7 各組細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白表達(dá)量Figure 7 Expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, mTOR,and PTEN proteins in each group

    圖8 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-21和PTEN的互補(bǔ)序列

    3 討論

    膽管癌作為高度惡性的實(shí)體腫瘤,其傳統(tǒng)手術(shù)切除率低,患者預(yù)后差,嚴(yán)重威脅人類健康。現(xiàn)如今靶向藥物的開發(fā)和應(yīng)用為腫瘤治療提供了新的思路。既往研究[8-10]表明miR-21可調(diào)控抑癌基因PTEN表達(dá),而PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路在膽管癌增殖分化過程中發(fā)揮重要作用。然而miR-21能否靶向PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)膽管癌惡性行為未知。鑒于此,本研究選取膽管癌細(xì)胞株QBC939,研究miR-21基因干擾靶向PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)膽管癌惡性行為的分子機(jī)制。

    表4 各組細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和PTEN蛋白相對表達(dá)量Table 4 Relative expression levels of PI3K, Akt, p-Akt, mTOR, and PTEN proteins in each group

    注:與轉(zhuǎn)染NC mimics細(xì)胞比較,P<0.05。

    本研究結(jié)果顯示,在QBC939細(xì)胞中過表達(dá)miR-21可增加細(xì)胞的增殖活性、減少細(xì)胞的凋亡并提高細(xì)胞的遷移率和穿膜數(shù)目;當(dāng)沉默miR-21后,細(xì)胞的增殖活性降低、細(xì)胞凋亡率增加、遷移率和穿膜能力降低。說明miR-21過表達(dá)可顯著促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,抑制癌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)膽管癌細(xì)胞惡性行為。有研究[13]指出,膽管癌細(xì)胞高增殖率和低凋亡率與膽管癌細(xì)胞活性增強(qiáng)相關(guān),癌細(xì)胞遷移和侵襲與基質(zhì)金屬蛋白酶9和波形蛋白的表達(dá)水平相關(guān),據(jù)此推測本研究中miR-21調(diào)節(jié)膽管癌細(xì)胞的增殖活性、凋亡率、遷移和侵襲行為可能與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的細(xì)胞活性、基質(zhì)金屬蛋白酶9以及波形蛋白表達(dá)水平相關(guān)。

    為進(jìn)一步明確miR-21是否能作用于PTEN/PI3K/Akt通路,進(jìn)而調(diào)控膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤等惡性行為,本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-21 mimics過表達(dá)miR-21時(shí),PI3K、Akt和mTOR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均升高,而PTEN mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均下降,說明活化miR-21可增加PI3K/Akt通路的活性。當(dāng)抑制miR-21表達(dá)時(shí),PI3K、Akt和mTOR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均下降,PTEN mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均升高,表明抑制miR-21可抑制PI3K/Akt 通路的活性。一般Akt的激活都是磷酸化的途徑,總量基本穩(wěn)定,但p-Akt水平改變。但是在本研究中,隨著miR-21的過表達(dá)或沉默,Akt總量也發(fā)生了改變。既往研究[14]表明,泛素化是一種對靶蛋白進(jìn)行特異性修飾的過程,可調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡等多種進(jìn)程,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。據(jù)此推測miR-21可能通過泛素化干擾了Akt蛋白的降解過程,過表達(dá)miR-21導(dǎo)致Akt降解受阻,Akt總量增加,而沉默miR-21促進(jìn)Akt的降解導(dǎo)致總量下降。也可能是miR-21影響了Akt蛋白的表達(dá)。

    本研究中雙熒光素酶結(jié)果顯示,miR-21 mimics可顯著抑制野生型PTEN-3′UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度,但是對突變型PTEN-3′UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞無影響,證明PTEN為miR-21的直接作用靶點(diǎn)。近年來腫瘤靶向治療逐漸重視miRNA的靶向作用[15]。miRNA是一種非編碼單鏈小分子RNA,作為轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)節(jié)因子,可與靶基因mRNA互補(bǔ),結(jié)合到靶基因mRNA的3′UTR,抑制靶標(biāo)基因蛋白翻譯或使其降解,參與原癌和抑癌基因的調(diào)節(jié)作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝過程[16]。miR-21由22個(gè)核苷酸組成,參與癌癥的發(fā)生發(fā)展,在腫瘤中呈過表達(dá)現(xiàn)象[17]。有研究[18-19]報(bào)道m(xù)iR-21可促進(jìn)乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移,參與調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡。PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶,Akt是一種蛋白激酶,mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,三者均參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡;活化的PI3K磷酸化Akt,p-Akt水平升高,使Akt處于活化狀態(tài),在腫瘤中PI3K/Akt信號(hào)通路被異常激活后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移,促進(jìn)腫瘤生長,是腫瘤靶向治療的關(guān)鍵分子,同時(shí)mTOR可活化PI3K/Akt信號(hào)通路[20-21]。PTEN作為抑癌基因,可抑制膽管癌細(xì)胞生長并負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路;而PTEN表達(dá)被抑制時(shí),PTEN/PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失衡進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移并抑制凋亡,最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[22-23]。有研究[24]證明miR-21可調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果一致,據(jù)此推測miR-21可能通過靶向抑制抑癌基因PTEN的表達(dá),從而誘導(dǎo)PI3K/Akt磷酸化,促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,增強(qiáng)膽管癌的惡性行為。

    綜上所述,miR-21基因干擾可有效抑制膽管癌細(xì)胞的惡性行為,具體機(jī)制可能通過靶向調(diào)控PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路信號(hào)傳導(dǎo),抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步研究miR-21對膽囊癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為提供了一定理論依據(jù),針對miR-21的小分子抑制劑有望成為潛在的膽管癌治療方案。

    倫理學(xué)聲明:本研究于2019年9月27日通過河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批號(hào)為2019[K]-042。

    利益沖突聲明:本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)聲明:施喆負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),研究實(shí)施,數(shù)據(jù)分析以及論文撰寫;周麗媛、趙國棟負(fù)責(zé)資料收集,數(shù)據(jù)分析;孫樹剛、薛亮負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),研究指導(dǎo),論文修改。

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