姜黃素對青春前期大鼠睪丸缺血/再灌注Nrf2 蛋白表達(dá)的影響*

張建華 孟繁亮 朱 薇 章學(xué)文 王 俊 陳思思

湖州市第三人民醫(yī)院(浙江 湖州 313000)

睪丸扭轉(zhuǎn)是一種常見的泌尿外科急癥,該病早期誤診率較高,可達(dá)67.6%[1]。 一旦確診需急診手術(shù)復(fù)位,恢復(fù)睪丸血供,挽救睪丸功能。 研究發(fā)現(xiàn):睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位是一種典型的缺血/再灌注損傷(Ischemiareperfusion injury, IRI)[2],目前對IRI 的研究主要集中在心、腦血管等方面,對于睪丸損傷后萎縮、生殖細(xì)胞凋亡的研究較少。 活化的核因子E2 相關(guān)因子-2(NFE2-related factor 2,Nrf2)是內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵分子,其與細(xì)胞核內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element,ARE)結(jié)合,構(gòu)成Nrf2/ARE 信號通路,是機(jī)體重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[3]。 目前關(guān)于Nrf2 蛋白在心臟和腦組織中的病理生理機(jī)制研究報(bào)道較多,但關(guān)于Nrf2 蛋白在大鼠睪丸缺血/再灌注損傷中的表達(dá)、分布規(guī)律及作用機(jī)制的研究,國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究通過建立青春前期大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位動(dòng)物模型,觀察姜黃素(Curcumin,Cur)對青春前期大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后Nrf2 蛋白的表達(dá)狀況的影響,探討姜黃素對睪丸缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制,為臨床治療睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能低下提供理論依據(jù)。

一、材料與方法

(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品及試劑

SPF 級,4 周齡,雄性SD 大鼠,體重(95±5)g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,合格證編號:20170005056712;姜黃素產(chǎn)品,由西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司提供,批號:C1386-5G;Nrf2 多克隆一抗,批號:PB9290,購自武漢博士德生物技術(shù)研究所,HRP 免疫組化試劑盒、DAB 試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒,均購自南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所。

(二)動(dòng)物模型建立與分組

本實(shí)驗(yàn)采用4 周齡雄性健康SD 大鼠32 只,隨機(jī)分為假手術(shù)組、生理鹽水組、姜黃素單次給藥組和姜黃素連續(xù)給藥組,每組均為8 只。 所有動(dòng)物按組分籠飼養(yǎng)。 睪丸扭轉(zhuǎn)模型采用Turner[4]法建立。 舒泰50(50mg/kg)ip麻醉。

假手術(shù)組:將左側(cè)陰囊切開,游離左側(cè)睪丸后縫合陰囊,關(guān)閉切口。

生理鹽水組:將左側(cè)陰囊切開,游離左側(cè)睪丸后,繞精索順時(shí)針扭轉(zhuǎn)睪丸720°后,用1 號絲線固定睪丸,縫合陰囊,關(guān)閉切口。 2h 后,第2 次切開左側(cè)陰囊,將扭轉(zhuǎn)的睪丸復(fù)位固定,可見睪丸組織由暗紅色逐漸恢復(fù)紅潤。 于復(fù)位前30min,灌胃法灌注生理鹽水(劑量生理鹽水200mg/kg)。

姜黃素單次給藥組:方法同生理鹽水組,于復(fù)位前30min,灌胃法灌注姜黃素懸液(采用0.5%羥甲基纖維素鈉溶解成懸濁液,劑量Cur 200mg/kg)。

姜黃素連續(xù)給藥組:方法同生理鹽水組,于復(fù)位前30min,灌胃法灌注姜黃素懸液(劑量Cur 200mg/kg),術(shù)后每天同等藥物灌胃1 次,連續(xù)7d。

(三)睪丸勻漿的制備和SOD 活性、MDA 含量的測定

于術(shù)后6 周處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,取左側(cè)睪丸,剔凈睪丸附著筋膜并用冷生理鹽水洗凈血污,濾紙拭干、稱重。 用電子天平稱取睪丸組織約0.15g,加入9 倍冷生理鹽水并用眼科剪剪碎置于組織勻漿器中,睪丸勻漿以離心力684.21×g 離心15min,取上清液測定各項(xiàng)酶指標(biāo)。 MDA 和SOD 均采用化學(xué)比色法測量。 操作過程嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

(四)Nrf2 蛋白表達(dá)檢測

免疫組織化學(xué)染色切片厚4μm,每個(gè)標(biāo)本取4 片,采用免疫組織化學(xué)HRP 法染色。 主要步驟:切片常規(guī)脫蠟至水→3%H2O2滅活內(nèi)源性酶→高溫高壓修復(fù)抗原→正常山羊血清封閉(不洗)→滴加Nrf2 抗體(1 ∶3200)→生物素化山羊血清→HRP 試劑(在以上各步之間均用PBS 洗滌3min×3 次)→DAB 顯色→蘇木素輕度復(fù)染,然后脫水、透明,中性樹膠封片,光鏡觀察。陰性對照應(yīng)用正常IgG 作為對照,用已知陽性片作陽性對照。 以胞質(zhì)、胞核呈棕褐色為Nrf2 蛋白陽性表達(dá),計(jì)算Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率。

(五)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用SNK法,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,P＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

(一)睪丸組織SOD 活性和MDA 含量的變化(見表1)

表1 各組大鼠睪丸組織SOD 活性和MDA 含量的比較(±s,n=8)

表1 各組大鼠睪丸組織SOD 活性和MDA 含量的比較(±s,n=8)

注:*vs 生理鹽水組P＜0.05;#vs 姜黃素單次給藥組P＜0.05;▲vs 姜黃素連續(xù)給藥組P＜0.05。

組別 SOD(U/mg*prot)MDA(nmol/mg*prot)假手術(shù)組 167.44±4.82*#▲ 11.08±1.01*#生理鹽水組 72.70±4.43 35.08±2.59單次給藥組 120.99±7.30* 16.87±1.73*連續(xù)給藥組 154.58±4.62*# 12.76±1.34*#

與假手術(shù)組相比,生理鹽水組SOD 活性明顯降低,MDA 含量顯著增加(P＜0.05);與生理鹽水組相比,姜黃素單次和連續(xù)給藥組SOD 活性顯著增加,MDA 含量明顯降低(P＜0.05);與姜黃素單次給藥組相比,姜黃素連續(xù)給藥組SOD 活性顯著增加,MDA 含量明顯降低(P＜0.05);與姜黃素連續(xù)給藥組相比,假手術(shù)組SOD活性顯著增加(P＜0.05)。

(二)Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率變化(見表2)

表2 各組大鼠睪丸Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率的比較(±s,n=8)

表2 各組大鼠睪丸Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率的比較(±s,n=8)

注:*vs 生理鹽水組P＜0.05;#vs 姜黃素單次給藥組P＜0.05;▲vs 姜黃素連續(xù)給藥組P＜0.05。

組別 Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率(%)假手術(shù)組 33.85±2.41*#▲生理鹽水組 42.30±5.04單次給藥組 43.71±2.65連續(xù)給藥組 51.97±4.43*#

與假手術(shù)組相比,生理鹽水組Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率顯著升高(P＜0.05);與生理鹽水組相比,姜黃素連續(xù)給藥組 Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率顯著升高(P＜0.05);與姜黃素單次給藥組相比,姜黃素連續(xù)給藥組Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率顯著升高(P＜0. 05);與姜黃素連續(xù)給藥組相比,假手術(shù)組Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率明顯降低(P＜0.05)。

(三)Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率和SOD 活性變化(見圖1)

圖1 Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率和SOD 活性變化

(四)睪丸生精小管Nrf2 蛋白表達(dá)(見圖2)

Nrf2 蛋白主要表達(dá)于睪丸精原細(xì)胞、精母細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。 圖2 所示,Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率在假手術(shù)組最低,缺血再灌注損傷后增強(qiáng),姜黃素連續(xù)給藥處理后,Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率顯著升高,且姜黃素連續(xù)給藥組Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率明顯優(yōu)于單次給藥組。

圖2 不同組別睪丸組織生精小管Nrf2 蛋白的表達(dá)(免疫組化HRP,×200)

三、討論

睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位是一個(gè)典型的缺血/再灌注損傷的過程,雖然扭轉(zhuǎn)的睪丸得到復(fù)位后可使血供恢復(fù),但是睪丸在缺血的初期已經(jīng)發(fā)生損害,且在再灌注階段這種損傷反應(yīng)會加重。 氧自由基損傷,細(xì)胞內(nèi)鈣超載和炎癥遞質(zhì)是缺血/再灌注損傷的病理生理基礎(chǔ)[5]。 睪丸組織在缺血/再灌注的過程中產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),ROS 可通過直接損害或者經(jīng)過一系列過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而造成廣泛細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞,因此清除ROS 對減輕睪丸的氧化損傷至關(guān)重要。SOD 是組織中清除體內(nèi)超氧離子自由基經(jīng)典的抗氧化酶之一[6]。 MDA 是氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物,其含量可以間接反映組織細(xì)胞損傷的程度[7]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,睪丸缺血/再灌注后,睪丸組織SOD 活性明顯降低,MDA 含量顯著增加,提示睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位可引起大量氧自由基的生成,導(dǎo)致抗氧化能力下降。 姜黃素單次和連續(xù)給藥組可以顯著增加SOD 的活性,明顯降低MDA 的含量,提示姜黃素可以降低睪丸缺血/再灌注后氧自由基的生成。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關(guān)因子2(Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)是目前為止發(fā)現(xiàn)的、最為重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路,是機(jī)體重要的自我防御系統(tǒng),激活Nrf2-ARE 信號通路可增加細(xì)胞抗氧化蛋白表達(dá),通過抗凋亡、抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換(Mitochondrial permeability transition,MPT)、減輕炎癥等機(jī)制減輕IRI[8-9]。 正常情況下,Nrf2 與Keap1(Kelch-like ECHassociated protein-1)以相互結(jié)合的方式存在于胞質(zhì)中,其本身活性也受到相應(yīng)的抑制,處于無活性狀態(tài)[10]。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS 直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能,是眾多疾病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。 機(jī)體形成了一套復(fù)雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng),當(dāng)受到氧化應(yīng)激信號刺激時(shí),會使Nrf2 與Keap1 解除偶聯(lián),Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),與ARE 結(jié)合,從而激活Nrf2/ARE 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,啟動(dòng)受ARE 調(diào)控的下游一系列抗氧化因子基因如SOD、HO-1、NQO1 等的轉(zhuǎn)錄及表達(dá),抗氧化基因的表達(dá)上調(diào)使細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng)[11-12]。 姜黃素(Cur)是一類從傳統(tǒng)中藥姜黃根莖中分離出的天然產(chǎn)物,為多酚類化合物,其脂溶性好,性質(zhì)穩(wěn)定[13]。 實(shí)驗(yàn)表明,姜黃素可減輕腦、心臟、肺和腎的缺血再灌注損傷[14-15],其通過抑制黃嘌呤氧化酶、過氧化陰離子、過氧化歧化酶、乳酸脫氫酶等的生成,抑制再灌注損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡,在缺血再灌注過程中提供保護(hù)作用。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,睪丸缺血/再灌注后,睪丸組織Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率顯著升高,提示睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后,氧化應(yīng)激損傷使Nrf2 釋放進(jìn)入細(xì)胞核,激活Nrf2/ARE 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,增強(qiáng)抗氧化損傷能力。 姜黃素連續(xù)給藥組比睪丸缺血/再灌注組Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率顯著升高,連續(xù)給藥組比單次給藥組Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位率顯著升高。

從圖1 表明,睪丸扭轉(zhuǎn)后復(fù)位前應(yīng)用姜黃素及術(shù)后連續(xù)應(yīng)用姜黃素,Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位率和SOD 活性顯著增加。 推測其機(jī)制可能是Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位在缺血/再灌注時(shí)升高,而此期間睪丸組織損傷程度仍加重,提示此期間睪丸組織內(nèi)對于應(yīng)激和氧化損傷雖然有保護(hù)性反應(yīng),通過增加Nrf2 蛋白核轉(zhuǎn)位表達(dá)以對抗損傷,但是此作用不足以對抗此期間睪丸缺血/再灌注所釋放的活性氧簇、炎性因子等的致?lián)p傷作用。 這與程風(fēng)春[16]報(bào)道的結(jié)果一致。 應(yīng)用姜黃素后通過激活Nrf2/ARE信號通路,誘導(dǎo)抗氧化酶SOD 表達(dá),提高睪丸組織清除氧自由基的能力,從而減輕了睪丸組織的氧化損傷。

綜上所述,姜黃素通過激活Nrf2/ARE 蛋白的信號通路,提高SOD 活性,清除氧自由基,降低組織內(nèi)MDA含量,從而對大鼠睪丸缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用,且連續(xù)應(yīng)用明顯優(yōu)于單次應(yīng)用。 提示我們在臨床工作中對睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后患者可考慮及時(shí)多次連續(xù)應(yīng)用此類藥物,以防止出現(xiàn)嚴(yán)重的IRI,從而影響睪丸組織的生理功能和后期發(fā)育。