玉竹醇提取物B調(diào)控免疫代謝抗結(jié)直腸癌的藥理機(jī)制研究

趙守彰 馬強(qiáng) 權(quán)冬梅

1遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院（沈陽 110101）；2沈陽市第六人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科（沈陽 110006）

有研究提示，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）與各種原因引起的長期炎癥以及自身免疫異常之間關(guān)系密切［1-2］。手術(shù)以及化療依舊是CRC 治療的主流，但傳統(tǒng)西醫(yī)治療存在手術(shù)切除不完全以及骨髓抑制等問題［3］。尋求更為安全有效的治療手段，是CRC 研究的新重點(diǎn)。玉竹是我國中醫(yī)常用中藥，其根莖內(nèi)含有黃酮、生物堿、強(qiáng)心苷等多類物質(zhì)，具有生津止渴、潤燥除煩等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，玉竹醇提取物B 具有抑癌功效，但其中的具體作用機(jī)制尚未明確［4-5］。為研究玉竹醇提取物B 是否能夠通過調(diào)控免疫代謝抑制CRC，發(fā)揮抗癌功效，我院開展如下研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)動物為雄性BALB/CA?nu 裸小鼠，共25 只，SPF 級，5 周周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自四川匯宇海玥醫(yī)藥。許可證號：SYXK（川）2021?234。小鼠所處環(huán)境符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格受控環(huán)境，溫度（23 ± 1）℃，濕度（55 ± 5）%，光照時(shí)間為每日上午8：00～20：00，12 h 循環(huán)，小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料自由飲水，本研究經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號：2019JX0774）。

1.2 試驗(yàn)試劑及器材（1）試驗(yàn)試劑包括：小鼠IL?2 ELISA試劑盒、小鼠IL?12 ELISA試劑盒、TNF?α ELISA 試劑盒。紅細(xì)胞裂解液購自Solarbio 公司。（2）試驗(yàn)儀器包括：全自動血細(xì)胞分析儀（型號HEMAVET950FS，美國）、組織勻漿器（S?18K，普萊特科技儀器）、高速離心機(jī)（型號：MiniSpin，德國Eppendorf）、流式細(xì)胞儀（型號：CytoFLEX，Beck?man Coulter）。（3）抗體：熒光抗體FITC?CD3e Mono?clonal Antibody（145?2C11）、APC?CD28 Monoclonal Antibody（37.51）。均購自Thermo Fisher Scientific。小鼠淋巴瘤細(xì)胞（YAC?1）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。（4）玉竹醇提取物B 由沈陽藥科大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室提取，純度≥95%，采用水醇法提取，取洗凈切碎玉竹根莖，經(jīng)30%乙醇浸提，取浸漬液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)回收乙醇，得黃棕色沉淀烤箱干燥后，定量，用雙蒸水配成不同濃度，高壓滅菌后備用。

1.3 動物模型建立及治療方案（1）根據(jù)文獻(xiàn)［6］中相關(guān)步驟建立CRC 小鼠模型：以脂質(zhì)體2000 介導(dǎo)的chicken β?actin?GFP?neo 和chicken β?actinD?sRed?neo 轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT?116，梯度濃度G418 篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)紅色和綠色熒光蛋白的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，BALB/CA?nu 裸鼠皮下接種1 106 個(gè)發(fā)光細(xì)胞使其成瘤。（2）分組及給藥方法：將25 只實(shí)驗(yàn)小鼠分為空白對照組、CRC 模型組及CRC+不同濃度玉竹醇提取物B 處理組（低劑量組、中劑量組、高劑量組），CRC+不同濃度玉竹醇提取物B 處理組小鼠分別給予1 g/kg、2 g/kg、3 g/kg玉竹醇提取物B 腹腔注射，空白對照組及CRC模型組給予等體積生理鹽水腹腔注射，連續(xù)給藥8 周。

1.4 血液及組織樣本采集末次給藥30 min后，抽取小鼠全血3 mL，使用1.5 mL EP 管采集全血，離心機(jī)4 000 rpm，離心10 min，微量移液器收集血清，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。血液采集完畢后，處死小鼠，取出其脾臟、心臟、腎臟及結(jié)直腸癌部位。計(jì)算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)（mg/g）=臟器重量/小鼠總體質(zhì)量。

1.5 外周血NK 細(xì)胞殺傷活性檢測NK 細(xì)胞殺傷活性測定：末次給藥30 min 后處死小鼠，取小鼠脾臟，配置LDH 基質(zhì)液，復(fù)活YAC?1 靶細(xì)胞，制備脾細(xì)胞懸液，并將其濃度調(diào)整為1 × 107個(gè)/mL，臺盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)試驗(yàn)確保脾細(xì)胞懸液中細(xì)胞存活率＞95%，將100 μL 靶細(xì)胞與100 μL 效應(yīng)細(xì)胞接種于U 型96 孔培養(yǎng)板，自然釋放孔、最大釋放孔及實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)分別加入：100 μL YAC?1+100 μL RPMI?1640，100 μL YAC?1+100 μL 1%NP?40，100 μL YAC?1+100 μL 脾細(xì)胞，孔板上每個(gè)孔都做3 個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2環(huán)境下孵育2 h，將96 孔板離心（1 000 rpm，2 min）吸取96 孔板每孔100 μL 上清液平行放置于一個(gè)新的平底96 孔培養(yǎng)板，后置于飽和水汽培養(yǎng)箱中孵育10 min，向96 孔板中每孔加入100 μL LDH 基底液，將液體充分混勻靜置于室溫中避光15 min。使用多功能酶標(biāo)儀讀取570 nm處OD值，NK 細(xì)胞殺傷活性（%）=（實(shí)驗(yàn)孔OD值-自然釋放孔OD值）/（最大釋放孔OD值?自然釋放孔OD值）×100%。

1.6 小鼠結(jié)直腸癌形成情況觀察小鼠安樂死后，使用解剖剪剪開小鼠腹腔，找到整段腸道，生理鹽水沖洗結(jié)直腸，每組小鼠選擇三條完整的結(jié)直腸，延盲腸末端對其平行，放置在紙板上，拍照，對結(jié)直腸癌形成個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 檢測血清免疫相關(guān)指標(biāo)水平采用ELISA 法檢測血清白細(xì)胞介素?2（interleukin?2，IL?2）、白細(xì)胞介素?12（interleukin?12，IL?12）、腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）水平。嚴(yán)格按照試劑盒相關(guān)步驟進(jìn)行操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較行單方差分析，兩兩比較行LSD?t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外周血NK細(xì)胞殺傷活性比較CRC模型組小鼠血液中NK 細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷活性明顯低于空白對照組，而不同濃度玉竹醇提取物組小鼠NK 細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷活性較模型組升高，其中中劑量組NK 細(xì)胞殺傷活性高于低劑量組，高劑量組NK 細(xì)胞殺傷活性高于中劑量組。見表1、圖1。

表1 各組小鼠外周血NK 細(xì)胞殺傷活性比較Tab.1 Comparison of peripheral blood NK cell killing activity among groups±s

表1 各組小鼠外周血NK 細(xì)胞殺傷活性比較Tab.1 Comparison of peripheral blood NK cell killing activity among groups±s

注：與空白對照組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05，與玉竹醇低劑量組比較，aP<0.05，與玉竹醇中劑量組比較，bP<0.05

組別空白對照組模型組玉竹醇提取物低劑量組玉竹醇提取物中劑量組玉竹醇提取物高劑量組F 值P 值NK 細(xì)胞殺傷活性（%）50.16±13.25 32.17±6.52*35.96±5.41#37.51±7.03#a 42.25±6.65#ab 3.507 0.025

圖1 各組小鼠外周血NK 細(xì)胞殺傷活性比較Fig.1 Comparison of peripheral blood NK cell killing activity among groups

2.2 各組小鼠外周血炎癥因子水平比較與空白對照組相比，模型組小鼠外周血IL?2、IL?12 及TNF?α水平均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），而與模型組小鼠相比，不同濃度玉竹醇提取物組小鼠血清IL?2、IL?12 以及TNF?α 水平均上升，其中中劑量組血清IL?2、IL?12以及TNF?α水平水平高于低劑量組，高劑量組血清IL?2、IL?12 以及TNF?α 水平高于中劑量組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見表2。

表2 各組小鼠外周血炎癥因子水平比較Tab.2 Comparison of peripheral blood inflammation factors among groups±s

表2 各組小鼠外周血炎癥因子水平比較Tab.2 Comparison of peripheral blood inflammation factors among groups±s

注：與空白對照組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05，與玉竹醇低劑量組比較，aP<0.05，與玉竹醇中劑量組比較，bP<0.05

組別空白對照組模型組玉竹醇提取物低劑量組玉竹醇提取物中劑量組玉竹醇提取物高劑量組F值P值IL?2（pg/mL）623.15±61.46 317.59±60.36*413.15±53.69#469.99±67.15#a 546.58±66.87#ab 18.051<0.001 IL?12（pg/mL）1.91±0.21 1.26±0.24*1.45±0.25#1.59±0.34#a 1.85±0.29#ab 5.085<0.001 TNF?α（pg/mL）634.15±73.15 326.46±66.84*376.48±70.55#426.58±63.87#a 541.67±75.74#ab 15.978<0.001

2.3 各組小鼠臟器指數(shù)比較模型組與玉竹醇提取物組心臟及肝臟等指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），但不同濃度玉竹醇提取物組脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均較模型組高，其中中劑量組脾臟及胸腺指數(shù)高于低劑量組，高劑量組脾臟及胸腺指數(shù)高于中劑量組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 各組小鼠結(jié)直腸腫瘤形成情況比較解剖發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠結(jié)直腸中可見腫瘤與其他異常增生，而經(jīng)不同濃度玉竹醇提取物處理后的CRC模型小鼠結(jié)直腸中腫瘤與其他異常增生數(shù)目明顯減少［（8.83±0.71）vs.（4.68±0.46）vs.（3.41±0.78）vs.（2.13±0.53），F(xiàn)=65.642，P<0.001］。見圖2。

表3 各組小鼠臟器指數(shù)比較Tab.3 Comparison of organ index among groups±s

表3 各組小鼠臟器指數(shù)比較Tab.3 Comparison of organ index among groups±s

注：與空白對照組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05，與玉竹醇低劑量組比較，aP<0.05，與玉竹醇中劑量組比較，bP<0.05

組別空白對照組模型組玉竹醇提取物低劑量組玉竹醇提取物中劑量組玉竹醇提取物高劑量組F 值P 值心臟指數(shù)9.39±1.13 9.41±1.02 9.36±1.23 9.37±1.21 9.43±1.18 0.003 1.000肝臟指數(shù)50.13±2.34 48.79±3.33 49.59±2.79 50.02±3.51 48.66±2.83 0.261 0.899脾臟指數(shù)13.69±1.69 5.14±1.33*7.43±1.52 9.41±1.37 11.85±2.03 22.414<0.001肺臟指數(shù)6.76±1.47 6.69±1.53 6.94±1.61 6.84±1.45 6.91±1.55 0.021 0.999腎臟指數(shù)12.68±1.43 13.03±1.39 12.95±1.37 12.87±1.65 12.91±1.74 0.032 0.998胸腺指數(shù)1.65±0.24 0.76±0.21*1.33±0.27#1.47±0.19 1.62±0.17 13.682<0.001

圖2 各組小鼠結(jié)直腸腫瘤形成情況比較Tab.2 Comparison of colorectal tumor formation in mice of each group

3 討論

CRC 是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有發(fā)病率高的特點(diǎn)。手術(shù)治療是CRC 的首選，但對于部分晚期CRC 患者，術(shù)后依舊存在腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，而聯(lián)合化療可能導(dǎo)致骨髓抑制問題。中藥治療安全性高，在輔助多種惡性腫瘤的治療中均具有良好的療效［7-9］。

玉竹醇提取物B 提取自傳統(tǒng)中草藥玉竹，有研究表示［10-11］，玉竹醇提取物B 能抑制腫瘤形成，延長荷瘤小鼠生存時(shí)間。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)與玉竹醇提取物B 干預(yù)后，CRC 小鼠結(jié)直腸處腫瘤數(shù)目及異常增生均較未經(jīng)治療的模型組明顯減少，說明玉竹醇提取物B 在CRC 中也具有抗癌功效，與上述研究結(jié)果一致。但關(guān)于玉竹醇提取物B 在抗癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。

自身免疫異常是CRC 發(fā)病及發(fā)展的重要原因，同時(shí)，免疫功能調(diào)節(jié)也是機(jī)體抗癌的重要組成。免疫功能調(diào)節(jié)能激活機(jī)體免疫細(xì)胞活力，殺傷癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)免疫介導(dǎo)的癌細(xì)胞清除［12-14］。為探討玉竹醇提取物B 是否能夠通過調(diào)控免疫功能，在CRC 中發(fā)揮作用，本研究檢測CRC 玉竹醇提取物B 干預(yù)的CRC 小鼠免疫相關(guān)指標(biāo)。NK 細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要作用細(xì)胞，其能有效識別、殺死惡性細(xì)胞，并維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)［15-17］。本研究結(jié)果提示，玉竹醇提取物組小鼠血液中NK 細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷活性明顯高于模型組，說明玉竹醇提取物B 能有效提高結(jié)直腸癌大鼠免疫功能。

ILs 及TNFs 都具有免疫調(diào)控和抗腫瘤活性，免疫相關(guān)細(xì)胞因子具備抗腫瘤活性作用［18-20］。其中IL?2 不僅能促進(jìn)NK、T 細(xì)胞以及B 細(xì)胞增殖，還能增強(qiáng)T 細(xì)胞及NK 細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的特異性免疫作用。IL?12 可提高NK 細(xì)胞活性，促進(jìn)TNF?α 分泌，進(jìn)而強(qiáng)化腫瘤細(xì)胞殺傷能力［21-22］。我院研究發(fā)現(xiàn)，與CRC 模型小鼠相比，經(jīng)玉竹醇提取物B 干預(yù)的CRC 小鼠血清IL?2、IL?12以及TNF?α水平均明顯上升，脾臟及胸腺是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的重要器官，本研究發(fā)現(xiàn)，與空白健康小鼠相比，CRC 模型小鼠脾臟及胸腺指數(shù)均下降，說明CRC 存在明顯的免疫紊亂狀況［23-25］。而經(jīng)玉竹醇提取物B 干預(yù)后，CRC 小鼠以上兩脾臟指數(shù)均較模型組上升。解剖發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠結(jié)直腸中可見腫瘤與其他異常增生，而經(jīng)不同濃度玉竹醇提取物處理后的CRC 模型小鼠結(jié)直腸中腫瘤與其他異常增生數(shù)目明顯減少提示玉竹醇提取物B 可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功達(dá)到抑制結(jié)直腸癌效果。

綜上所述，玉竹醇提取物B 可能通過調(diào)節(jié)免疫代謝減少CRC 結(jié)直腸腫瘤數(shù)目及異常增生，發(fā)揮抗癌作用。