全外顯子組測序篩選1個人類白細胞抗原-B27陰性強直性脊柱炎家系的強直性脊柱炎易感基因

任偉凡，辛大偉，胡勁濤，吳風晴，周化騰，杜偉斌，全仁夫

（1．杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院，浙江 杭州 311201；2．浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種自身免疫性疾病，患病率為 0．1% ～1．4%。AS主要累及中軸骨，臨床表現早期主要為后背疼痛和僵硬，晚期主要為脊柱關節(jié)強直。AS的發(fā)生是遺傳、環(huán)境和免疫等因素相互作用的結果，而遺傳因素起著重要作用。研究表明，人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）-B27基因與 AS易感性強相關。臨床上 AS患者中約90%為 HLA-B27陽性，但HLA-B27基因僅占AS遺傳度的23%。因此，可以推測還存在其他基因影響AS的發(fā)生。為了篩選其他AS易感基因，我們對一個HLA-B27陰性AS家系中的3名成員的基因組進行了全外顯子組測序，并對測序數據進行了分析，現總結報告如下。

1 臨床資料

納入1個AS家系的15名核心成員，均為HLAB27陰性，其中AS患者2例，其余均正常。先證者，女，58歲，符合美國風濕病學會1984年修訂的紐約標準；先證者女兒，35歲，符合1991年歐洲脊柱關節(jié)病研究組提出的脊柱關節(jié)病的診斷標準。試驗方案經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查通過。

2 方 法

2．1 全外顯子組測序及測序數據分析

采集AS家系15名核心成員的外周血，提取外周血基因組。將先證者、先證者女兒、先證者兒子的外周血基因組進行全外顯子組測序（廣州基迪奧生物科技有限公司）。將原始測序數據通過過濾和質量控制后獲得有效數據，統(tǒng)計捕獲目標區(qū)域長度、有效測序片段數量、有效數據大小、目標區(qū)域有效數據大??；采用BWA工具將外顯子序列比對到人類參考基因組，獲得比對結果，計算比對率（測序片段比對到的參考基因組在參考基因組中所占的比例）及捕獲效率（比對到目標區(qū)域的序列在比對到參考基因組的序列中所占的比例）。采用SAMtool軟件將比對結果輸出為BAM格式文件，采用Picard軟件標記重復測序片段，統(tǒng)計測序深度及測序片段覆蓋度。

2．2 AS易感基因篩選

采用GATK軟件挖掘單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）突變信息，采用ANNOVAR軟件注釋分析SNP突變，參照以下步驟篩選AS易感基因：①剔除外顯子和剪接區(qū)以外的突變；②剔除外顯子和剪接區(qū)內的同義突變；③剔除千人基因組數據庫中突變頻率≥0．01的突變；④剔除外顯子組整合數據庫中突變頻率≥0．01的突變；⑤采用 SIFT、Polyphen、MutationTaster、MutationAssessor、M-CAP、FATHMM、CADD等軟件進行蛋白損傷預測，選擇至少有4個軟件的預測結果顯示為有害的突變；⑥保留患者共有而正常人不具有的變異；⑦確定AS易感基因名稱、位置及突變類型。

2．3 AS易感基因驗證

根據篩選出的易感基因設計引物，分別以15名AS家系核心成員的基因組為模板，擴增目的基因。采用瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因，并對目的基因進行Sanger測序（華大基因科技有限公司），確定存在該移碼突變的成員。

3 結 果

3．1 全外顯子組測序數據分析結果

全外顯子組測序獲得了較高質量的測序數據，具體數據分析結果見表1。

表1 全外顯子組測序數據分析結果

3．2 AS易感基因篩選結果

RELA基因10號外顯子上存在一個雜合移碼突變c．1039delG（圖1），突變的RELA基因可能為AS易感基因。

圖1 移碼突變c．1039delG測序峰圖

3．3 AS易感基因驗證結果

根據RELA基因設計引物：正向引物，5’-AACTAAGTCCTGAGAGGCAAT-3’；反向引物，5’-TGAGAACTGACCTAGCCCTT-3’。Sanger測序結果顯示，先證者、先證者女兒及先證者孫子的基因組上存在RELA基因移碼突變，其他家系成員不存在該突變。

4 討 論

AS具有一定的家族遺傳性，以15～35歲為發(fā)病高峰。目前，AS的發(fā)病機制尚未完全明確。多項研究顯示，HLA-B27基因與 AS的發(fā)生強相關。Qian等的研究結果表明，在 AS患者中，HLAB27陽性患者的發(fā)病時間早、臨床癥狀重。然而，HLA-B27基因僅占AS遺傳度的23%。因此，應該還存在其他AS易感基因。本研究的家系成員均為HLA-B27陰性，其中有2例AS患者；這2例患者的發(fā)病時間均在30歲以后，且腰部疼痛不劇烈、晨僵癥狀時而好轉。通過外顯子組測序及數據分析，結果顯示該家系中可能存在其他的AS易感基因。

核因子（nuclear factor-κB，NF-κB）是細胞中重要的轉錄因子，與炎癥反應、細胞分化、細胞生長、細胞凋亡等過程密切相關。NF-κB蛋白以與NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）結合的狀態(tài)存在于細胞質中，外界刺激促使IκB磷酸化、泛素化，進而被蛋白酶體降解，隨后NF-κB蛋白進入細胞核并與靶基因結合，調控基因轉錄。NF-κB家族包括RelA（p65）、RelB、NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）和c-Rel 5位成員。除了RelB，其他成員均能形成同源或異源二聚體，其中p50／p65異源二聚體最為常見，幾乎存在于所有有核細胞中。NF-κB家族成員均含有Rel同源結構域，該結構域含有300個氨基酸，具有特異性DNA序列結合、二聚化和抑制蛋白結合3個功能。p65包含Rel同源結構域、連接區(qū)及拓撲結構域，其中拓撲結構域主要負責p65的轉錄活性調節(jié)。

AS的主要病理表現為炎癥介導的骨破壞和病理性骨形成。NF-κB信號通路是典型的炎癥信號轉導通路。炎癥性腸病、類風濕關節(jié)炎、牛皮癬、哮喘、全身炎癥反應綜合征等多種疾病與NF-κB信號通路密切相關。在多種炎癥性疾病中，NF-κB能夠被激活并持續(xù)表達，而NF-κB的表達可進一步誘導促炎性細胞因子、趨化因子、黏附因子、基質金屬蛋白酶等多種蛋白的表達。Mulero等研究發(fā)現，多種炎癥性疾病患者體內NF-κB活性增加，同時炎癥細胞募集增加，白細胞介素（interleukin，IL）-8、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等促炎性細胞因子表達量增加。韓飛等采用實時定量PCR檢測類風濕關節(jié)炎患者、骨關節(jié)炎患者和健康成人的滑膜組織中NF-κB的mRNA表達，結果顯示類風濕關節(jié)炎患者的NF-κB mRNA表達量顯著高于骨關節(jié)炎患者和健康成人；采用原位免疫組織化學染色法檢測p65在細胞核中的表達，結果顯示類風濕關節(jié)炎患者p65的活性系數（細胞核p65陽性百分比／細胞質p65陽性百分比）顯著高于骨關節(jié)炎患者和健康成人。方利等采用酶聯免疫吸附分析法檢測了30例AS患者（試驗組）和30位健康志愿者（對照組）外周血血清中NF-κB信號通路相關蛋白的表達量，結果顯示試驗組患者外周血血清中TNF-α、IL-1β、IL-17、NF-κB激活劑 1、p65、p50、IκBα、IκB激酶 β、顆粒膜蛋白140、血小板活化因子、血栓素A2的含量均顯著高于對照組，提示AS患者體內NF-κB信號通路處于激活狀態(tài)。除了參與炎癥反應，NF-κB對成骨細胞和破骨細胞代謝具有一定的調節(jié)作用。在關節(jié)炎和骨質疏松癥的相關研究中，激活的NF-κB能夠抑制成骨細胞骨形成，促進破骨細胞骨吸收，并能夠影響軟骨細胞的增殖與分化，抑制NF-κB表達能夠發(fā)揮抗炎和抗骨質溶解的作用。

既往研究AS易感基因多以全基因組關聯分析為主，目前已發(fā)現50多種基因與AS相關。但是針對1個家系的研究，由于患病人數和突變基因攜帶者較少，不宜采用連鎖分析或關聯分析的方式。而采用Sanger測序法逐個驗證候選基因，成本較高、周期較長。隨著高通量測序技術的發(fā)展，將全基因組測序和全外顯子組測序用于單個家系和散發(fā)病例的致病基因研究，具有一定的優(yōu)勢。Liu等采用全外顯子組測序聯合基因篩查在1個家族性房間隔缺損家系中發(fā)現新的致病突變TBX20。外顯子僅占整個基因組的1%，但約85%的致病突變都位于外顯子上。相較于全基因組測序，外顯子組測序的費用低、耗時少、效率高。此外，全外顯子組測序能夠較為準確的確定候選基因，便于后續(xù)的基因篩選和功能鑒定。

移碼突變是指基因編碼區(qū)內缺失或增加的核苷酸數目不是3的倍數從而造成閱讀框移動的突變。由于閱讀框移動，導致突變位點后的氨基酸組成種類和順序都發(fā)生了改變，進而影響蛋白的結構和功能。本研究結果顯示，RELA基因10號外顯子上存在一個雜合移碼突變c．1039delG。RELA基因位于11號染色體，有10個外顯子，編碼p65蛋白。RELA基因發(fā)生該移碼突變會導致p65蛋白拓撲結構域發(fā)生變化，從而影響p65的轉錄活性，影響NF-κB信號通路的信號轉導。AS易感基因的驗證結果顯示，先證者、先證者女兒及先證者孫子的基因組上均存在該突變。RELA基因突變可能是導致該家系AS發(fā)生的重要遺傳因素。先證者孫子尚未出現AS臨床癥狀，可能與其未到發(fā)病年齡有關。但需提醒其注意自身身體狀況，如出現AS臨床癥狀，應盡早干預以避免病情惡化。本研究結果表明，突變的RELA基因可能是該AS家系的AS易感基因。