獨活寄生顆粒治療大鼠肩周炎的效果和作用機制研究

何文全，蘇進益，陸紅日，張洪彬，賴偉偉

（臺州市中醫(yī)院，浙江 臺州 318001）

肩周炎是臨床常見的關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)生于50歲以上中老年人，患者多有長期勞作史或肩部外傷史。肩周炎的主要臨床表現(xiàn)為肩關(guān)節(jié)持續(xù)疼痛和功能受限，嚴重影響患者的生活和工作。臨床上治療肩周炎的常用方法有藥物口服、藥物局部注射及關(guān)節(jié)鏡下松解術(shù)，這些方法在一定程度上能夠緩解臨床癥狀，但分別存在不良反應(yīng)較多、療效持續(xù)時間短及具有創(chuàng)傷性等不足。肩周炎屬于中醫(yī)學“痹證”范疇，主要病機為氣滯血瘀。中醫(yī)臨床采用祛風散寒、溫經(jīng)通絡(luò)的治法治療肩周炎，取得了良好的臨床療效。獨活具有祛風除濕、散寒止痛之功，獨活寄生顆粒以獨活為主要成分，具有養(yǎng)血舒筋、祛風除濕的功效，常用于風寒濕痹所致腰膝冷痛、屈伸不利。為了探討?yīng)毣罴纳w粒治療肩周炎的效果和作用機制，我們建立了大鼠肩周炎模型，并進行了相關(guān)動物實驗，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與儀器

1．1 實驗動物

無特定病原Sprague-Dawley大鼠50只，雄性，8月齡，體質(zhì)量（400±20）g，購自上海靈暢生物科技有限公司[生產(chǎn)許可SCXK（滬）2018-0003]。

1．2 實驗試劑

獨活寄生顆粒（海南海力制藥有限公司，國藥準字Z20050053），放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司），脂多糖（上海源葉生物科技有限公司），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme linked immunoserbent assay，ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），兔抗大鼠 Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4、TLR2、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、甘油醛 -3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗及山羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G二抗（美國Abcam公司）。

1．3 實驗儀器

Varioskan LUX多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），DSX 100光學顯微鏡（日本Olympus株式會社），DYCZ-26C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方 法

2．1 模型建立方法

從50只大鼠中隨機選取10只作為正常對照組，其余建立肩周炎模型：將大鼠仰臥位固定于臺面上，右肩用眼科剪剪去毛發(fā)（面積3 cm×3 cm）。將右前肢遠端以繃帶固定于電動震蕩器，以50次·min頻率、1．5 cm振幅搖動，每天搖動5 h，持續(xù)搖動3 d。搖動過程中觀察并及時調(diào)整震蕩器角度，避免大鼠受傷。搖動結(jié)束后第1天，大鼠再次固定于臺面上，將內(nèi)裝冰塊的塑料袋外敷于大鼠右肩，每天冰敷5 h，持續(xù)冰敷3 d。冰敷過程中注意及時補充冰塊。冰敷結(jié)束后，大鼠右側(cè)肩關(guān)節(jié)活動受限，關(guān)節(jié)周圍軟組織可見輕度紅腫、充血、部分瘀斑，表明肩周炎模型建立成功。

2．2 分組干預(yù)方法

將建模成功的大鼠隨機分為肩周炎模型組、獨活寄生顆粒干預(yù)組、獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組，獨活寄生顆粒干預(yù)組每天按照3 g·kg獨活寄生顆粒進行灌胃，獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組每天按照3 g·kg獨活寄生顆粒、3 mg·kg脂多糖進行灌胃，均以生理鹽水制成5 mL溶液；正常對照組和肩周炎模型組以5 mL生理鹽水灌胃；每天灌胃1次，持續(xù)5周。

2．3 大鼠運動能力評價方法

干預(yù)結(jié)束后第1天，進行曠場實驗：將大鼠置于上方安裝全方位攝像頭、體積80 cm×120 cm×100 cm的黑箱中央，記錄大鼠3 min內(nèi)的活動影像，計算并記錄大鼠中央停留時間及活動總路程。注意將大鼠提前帶入實驗房間以適應(yīng)環(huán)境，實驗期間保持房間安靜；每只大鼠實驗結(jié)束后擦拭、消毒黑箱底面與內(nèi)壁，避免氣味殘留對后續(xù)實驗造成影響。

2．4 病理學檢查方法

曠場實驗結(jié)束后大鼠禁食禁水，12 h后于大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉深度麻醉，采用頸椎脫位法處死大鼠，于肩關(guān)節(jié)切取面積3 cm×3 cm的組織樣本，并將其分成4份，1份用于組織病理學觀察，3份于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｈ?份肩關(guān)節(jié)組織標本以4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋，切為厚度5μm的切片。用二甲苯脫蠟，無水乙醇沖洗后自來水沖洗30 s；蘇木精染色液染色5 min，自來水沖洗；加入鹽酸酒精分化液分化，自來水沖洗后反藍；伊紅染色液染色2 min，梯度乙醇脫水、透明；滴入中性樹膠封片，采用光學顯微鏡觀察組織病理變化。

2．5 炎癥相關(guān)指標檢測方法

取保存于液氮中的肩關(guān)節(jié)組織，充分剪碎后加入PBS，放入勻漿器中裂解組織和細胞。將勻漿倒入離心管中，于4℃下以10 000 r·min的轉(zhuǎn)速（離心半徑8 cm）離心15min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書，采用ELISA法檢測肩關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、PGE2含量，酶標儀測定波長570 nm。采用標準曲線法計算樣品中TNF-α、IL-1β、PGE2濃度。

2．6 疼痛相關(guān)指標檢測方法

參照2．5中方法制備肩關(guān)節(jié)組織樣品，按照ELISA試劑盒說明書，采用ELISA法檢測肩關(guān)節(jié)組織中5-HT含量，酶標儀測定波長570 nm。采用標準曲線法計算樣品中5-HT濃度。

2．7 炎癥信號通路相關(guān)蛋白檢測方法

取保存于液氮中的肩關(guān)節(jié)組織，充分剪碎后加入PBS，制成勻漿后加入RIPA裂解液，轉(zhuǎn)移至離心管，以8000 r·min的轉(zhuǎn)速（離心半徑10 cm）離心20 min，取上清。采用BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整樣品蛋白濃度使蛋白上樣量一致，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗大鼠 TLR4、TLR2、MyD88一抗（1∶500），于 4℃搖床孵育 2 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶2000），常溫孵育2 h，TBST洗膜，加入發(fā)光液顯色，采用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照和分析。目標蛋白相對表達量＝目標蛋白灰度值／GAPDH灰度值。

2．8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用SPSS22．0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。4組大鼠中央停留時間、活動總路程及肩關(guān)節(jié)組織中TNF-α含量、IL-1β含量、PGE2含量、5-HT含量、TLR4蛋白表達量、TLR2蛋白表達量、MyD88蛋白表達量的組間總體比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗；檢驗水準 α＝0．05。

3 結(jié) 果

3．1 模型建立及分組結(jié)果

建立肩周炎模型成功32只，肩周炎模型組10只、獨活寄生顆粒干預(yù)組11只、獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組11只。

3．2 大鼠運動能力評價結(jié)果

4組大鼠中央停留時間、活動總路程比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義。肩周炎模型組、獨活寄生顆粒干預(yù)組、獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠的中央停留時間均長于正常對照組（LSD-t＝26．670，P＝0．000；LSD-t＝23．143，P＝0．000；LSD-t＝24．930，P＝0．000），活動總路程均短于正常對照組（LSD-t＝9．581，P＝0．000；LSD-t＝4．113，P＝0．001；LSD-t＝7．017，P＝0．000）；獨活寄生顆粒干預(yù)組、獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠的中央停留時間均短于肩周炎模型組（LSD-t＝10．385，P＝0．000；LSD-t＝4．300，P＝0．000），活動總路程均長于肩周炎模型組（LSD-t＝5．878，P＝0．000；LSD-t＝2．984，P＝0．008）；獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠中央停留時間長于獨活寄生顆粒干預(yù)組（LSD-t＝6．337，P＝0．000），活動總路程短于獨活寄生顆粒干預(yù)組（LSD-t＝3．024，P＝0．000）。見表1。

表1 4組大鼠運動能力評價結(jié)果

3．3 病理學檢查結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠肩關(guān)節(jié)肌細胞、肌纖維排列整齊，肌組織結(jié)構(gòu)完整，未見增生的毛細血管及炎性細胞；肩周炎模型組大鼠肩關(guān)節(jié)肌細胞、肌纖維排列混亂，肌組織結(jié)構(gòu)不完整，可見大量增生的毛細血管及炎性細胞；獨活寄生顆粒干預(yù)組、獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)肌細胞、肌纖維排列及肌組織結(jié)構(gòu)較肩周炎模型組有所改善，增生的毛細血管及炎性細胞較肩周炎模型組少，且獨活寄生顆粒干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)肌細胞、肌纖維排列及肌組織結(jié)構(gòu)改善程度大于獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組，增生的毛細血管及炎性細胞少于獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組。見圖1。

圖1 4組大鼠肩關(guān)節(jié)組織病理學檢查結(jié)果（HE染色，×100）

3．4 炎癥相關(guān)指標檢測結(jié)果

4組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、PGE2含量比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義。肩周炎模型組、獨活寄生顆粒干預(yù)組、獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、PGE2含量均高于正常對照組（TNF-α：LSD-t＝12．958，P＝0．000；LSD-t＝8．145，P＝0．000；LSD-t＝10．245，P＝0．000；IL-1β：LSD-t＝8．389，P＝0．000；LSD-t＝5．126，P＝0．000；LSD-t＝9．652，P＝0．000；PGE2：LSD-t＝14．044，P＝0．000；LSD-t＝12．365，P＝0．000；LSD-t＝8．335，P＝0．000）；獨活寄生顆粒干預(yù)組、獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、PGE2含量均低于肩周炎模型組（TNF-α：LSD-t＝6．901，P＝0．000；LSD-t＝5．746，P＝0．000；IL-1β：LSD-t＝5．528，P＝0．000；LSD-t＝16．352，P＝0．000；PGE2：LSD-t＝6．932，P＝0．000；LSD-t＝12．687，P＝0．000）；獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、PGE2含量均高于獨活寄生顆粒干預(yù)組（LSD-t＝2．944，P＝0．008；LSD-t＝2．954，P＝0．008；LSD-t＝2．666，P＝0．015）。見表2。

表2 4組大鼠肩關(guān)節(jié)組織炎癥相關(guān)指標檢測結(jié)果

3．5 疼痛相關(guān)指標檢測結(jié)果

4組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中5-HT含量比較，差異有統(tǒng)計學意義[（152．14±24．73）ng·mL，（219．58±29．20）ng·mL，（180．33±21．37）ng·mL，（201．44±25．49）ng·mL，F(xiàn)＝13．301，P＝0．000]。肩周炎模型組、獨活寄生顆粒干預(yù)組、獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中5-HT含量均高于正常對照組（LSD-t＝6．813，P＝0．000；LSD-t＝2．802，P＝0．011；LSD-t＝4．489，P＝0．000）；獨活寄生顆粒干預(yù)組、獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中5-HT含量均低于肩周炎模型組（LSD-t＝4．892，P＝0．000；LSD-t＝2．777，P＝0．012）；獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中5-HT含量高于獨活寄生顆粒干預(yù)組（LSD-t＝2．105，P＝0．048）。

3．6 炎癥信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果

4組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中TLR4、TLR2、MyD88蛋白表達量比較，組間差異均有統(tǒng)計學意義。肩周炎模型組、獨活寄生顆粒干預(yù)組、獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中TLR4、TLR2、MyD88蛋白表達量均高于正常對照組（TLR4：LSD-t＝30．840，P＝0．000；LSD-t＝23．541，P＝0．000；LSD-t＝21．147，P＝0．000；TLR2：LSD-t＝23．667，P＝0．000；LSD-t＝26．985，P＝0．000；LSD-t＝29．654，P＝0．000；MyD88：LSD-t＝26．787，P＝0．000；LSD-t＝30．142，P＝0．000；LSD-t＝25．333，P＝0．000）；獨活寄生顆粒干預(yù)組、獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中TLR4、TLR2、MyD88蛋白表達量低于肩周炎模型組（TLR4：LSD-t＝26．409，P＝0．000；LSD-t＝20．145，P＝0．000；TLR2：LSD-t＝21．264，P＝0．000；LSD-t＝19．874，P＝0．000；MyD88：LSD-t＝20．393，P＝0．000；LSD-t＝22．987，P＝0．000）；獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中TLR4、TLR2、MyD88蛋白表達量均高于獨活寄生顆粒干預(yù)組（LSD-t＝12．603，P＝0．000；LSD-t＝18．770，P＝0．000；LSD-t＝17．428，P＝0．000）。見表3、圖2。

表3 4組大鼠肩關(guān)節(jié)組織炎癥信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果

圖2 4組大鼠肩關(guān)節(jié)組織炎癥信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果

4 討 論

肩周炎是一種肩關(guān)節(jié)周圍軟組織無菌性炎癥，主要臨床表現(xiàn)為肩關(guān)節(jié)的持續(xù)疼痛和活動障礙。激素、外傷、長期勞作等均是肩周炎發(fā)生的危險因素。組織病理學檢查顯示，肩周炎的病變部位累及肩關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊、滑膜、韌帶及肌腱，關(guān)節(jié)囊呈現(xiàn)明顯攣縮、滑膜呈現(xiàn)纖維化。肩周炎屬于中醫(yī)學“痹證”范疇，其主要病因病機為急慢性勞損而致氣滯血瘀，故治療應(yīng)以祛風散寒、溫經(jīng)通絡(luò)為主。獨活味苦、辛，性微溫，具有祛風寒濕邪、解表止痛等功效，是中醫(yī)常用的祛風通絡(luò)藥物。獨活中含有的異歐前胡素、蛇床子素、β-谷甾醇等有效成分均具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。Xu等研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素能通過抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)和細胞應(yīng)激，發(fā)揮治療關(guān)節(jié)炎的作用。獨活寄生顆粒以獨活為主要有效成分，主要用于風寒濕痹所致腰膝冷痛，屈伸不利。乙軍等分別采用獨活寄生顆粒聯(lián)合塞來昔布（試驗組）和塞來昔布（對照組）治療膝骨性關(guān)節(jié)炎，結(jié)果顯示治療后30 d試驗組患者臨床癥狀顯著改善，且超敏C反應(yīng)蛋白、IL-1、IL-6、TNF-α血清含量均低于對照組，提示獨活寄生顆粒具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。本研究采用獨活寄生顆粒治療大鼠肩周炎，以大鼠運動能力評價獨活寄生顆粒改善肩周炎癥狀的效果。曠場實驗是基于大鼠因?qū)δ吧h(huán)境畏懼而沿墻壁活動的天性設(shè)計的經(jīng)典動物實驗，該實驗通過大鼠的中央停留時間和活動總路程反映大鼠的運動能力：中央停留時間越短、活動總路程越長表明大鼠運動能力越強。本研究結(jié)果顯示，獨活寄生顆粒干預(yù)組大鼠的中央停留時間短于肩周炎模型組、活動總路程長于肩周炎模型組，提示獨活寄生顆粒能夠改善肩周炎大鼠的疼痛等癥狀，從而提高其運動能力。肩關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、PGE2含量能夠反映組織炎癥水平；5-HT屬于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，病變組織釋放5-HT，通過激活不同的5-HT受體參與機體疼痛感覺的傳遞。華浩昌等采用激痛點推拿配合關(guān)節(jié)松動手法治療肩周炎氣滯血瘀證患者，結(jié)果顯示患者疼痛顯著緩解，且治療后5-HT血清含量顯著降低。本研究結(jié)果顯示，獨活寄生顆粒干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)組織中 TNF-α、IL-1β、PGE2及5-HT含量均低于肩周炎模型組，提示獨活寄生顆粒能夠發(fā)揮降低炎癥反應(yīng)、改善疼痛的作用。

TLR／MyD88信號通路是機體重要的炎癥反應(yīng)信號通路之一。Lopez-Bergami等研究發(fā)現(xiàn)，在骨髓單核細胞中激活TLR／MyD88信號通路，能夠抑制抗炎細胞因子IL-10的合成，引發(fā)炎癥反應(yīng)。TLR主要在巨噬細胞、樹突狀細胞的表面表達，是一種抗原識別受體，能夠識別內(nèi)源性和外源性配體。TLR在受到抗原刺激后能夠激活下游MyD88，再通過細胞內(nèi)信號傳導激活核因子-κB，誘導巨噬細胞釋放IL-6、TNF-α、IL-1β等炎癥因子。本研究結(jié)果顯示，肩周炎模型大鼠肩關(guān)節(jié)組織中 TLR4、TLR2、MyD88蛋白表達量較正常組顯著提高，而采用獨活寄生顆粒干預(yù)后大鼠肩關(guān)節(jié)組織中TLR4、TLR2、MyD88蛋白表達量顯著降低。脂多糖是TLR／MyD88信號通路的激活劑，獨活寄生顆粒聯(lián)合脂多糖干預(yù)組大鼠肩關(guān)節(jié)組織TLR4、TLR2、MyD88蛋白表達量均高于獨活寄生顆粒干預(yù)組，表明脂多糖在一定程度上能夠抑制獨活寄生顆粒的治療作用，也提示獨活寄生顆粒治療大鼠肩周炎的作用機制與抑制TLR／MyD88信號通路相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，采用獨活寄生顆粒治療大鼠肩周炎，能夠緩解疼痛、抑制炎癥反應(yīng)，其作用機制可能與抑制TLR／MyD88信號通路相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。