淡紫紫孢菌微菌核防治黃瓜根結線蟲病及土壤環(huán)境對其定殖的影響

袁夢蕾，范樂樂，趙 雪，鐘增明，孫漫紅*，李世東*

（1. 中國農業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193；2. 北京啟高生物科技有限公司，北京 100193）

根結線蟲Meloidogynespp.是農業(yè)生產中的重要病害，每年造成的損失高達1000億美元[1]。在我國，根結線蟲在各地蔬菜產區(qū)都普遍發(fā)生，尤其是設施蔬菜生產中，由于高密度單一種植、水肥強度增加，病害日趨嚴重，嚴重制約了產業(yè)健康發(fā)展。目前主要采用化學殺線蟲劑或土壤熏蒸等措施控制根結線蟲病，但大多都存在抗藥性問題，并對生態(tài)環(huán)境具有一定危害。近年來，環(huán)境友好型生物殺線蟲劑的研發(fā)和應用受到越來越多的關注，目前應用較多的主要有淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinum、厚垣普奇尼亞菌Pochonia chlamydosporia等[2,3]。

淡紫紫孢菌P. lilacinum（異名：淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus）是一種重要的食線蟲真菌，分布廣泛，寄主范圍廣，可寄生植物線蟲的卵、雌蟲和胞囊[4,5]，對根結線蟲、胞囊線蟲Heteroderaspp.等多種植物寄生線蟲均具有良好的防治效果[6-8]，其代謝產物還能夠促進植物的生長[9,10]。目前，淡紫紫孢菌制劑已被廣泛用于不同作物線蟲病害的防控[11-13]。據(jù)統(tǒng)計，截至2022年5月我國批準登記的淡紫紫孢菌生物農藥產品有 12個，劑型主要為顆粒劑和粉劑。這些菌劑中活性成分為分生孢子和菌絲，對不良環(huán)境抵抗能力較差，因而在貯存和田間應用過程中很容易導致活性喪失，影響其生防效果和穩(wěn)定性[14]。

淡紫紫孢菌在特定條件下可以形成抗逆繁殖體—微菌核（Microsclerotia，MS），從而大幅提高生防菌的貯存活性[15]。微菌核由大量菌絲纏繞特化而成，是絲狀真菌度過不良環(huán)境的一種休眠結構[16,17]。2008年，Jackson和Jaronski[17]首次報道蟲生真菌金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae可以在液體培養(yǎng)基中產生微菌核，此后，接連觀察到球孢白僵菌Beauveria bassiana、布氏白僵菌B. brongniartii和哈茨木霉Trichoderma harzianum等生防真菌均可在一定條件下產生微菌核[18,19]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，微菌核可以顯著提高生防菌耐干燥、耐高溫能力，延長儲存期。如白僵菌微菌核制劑，4 ℃下儲存6個月仍可全部萌發(fā)，20 ℃儲存6個月萌發(fā)率為68%[20]。萊氏野村菌Nomuraea rileyi微菌核在干燥條件下可儲存半年以上，室溫條件下儲存一年仍具有較高的活性[21-23]。

淡紫紫孢菌YES-2-14菌株是本實驗室分離到的一株生防菌，對根結線蟲病具有較好的防治效果[24,25]。前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌在特定條件下可以形成微菌核，并具有較好的耐熱性和穩(wěn)定性。本研究通過室內生測和溫室盆栽試驗，研究淡紫紫孢菌微菌核對根結線蟲的寄生作用和防病效果，以及不同土壤條件對生防菌定殖的影響，為淡紫紫孢菌微菌核制劑的研發(fā)和田間應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：淡紫紫孢菌 YES-2-14菌株分離自云南煙草根結線蟲，由中國農業(yè)科學院植物保護研究所土傳病害實驗室分離、鑒定、保存。

培養(yǎng)基：蔗糖 40 g，豆粕粉 12 g，KH2PO44 g，MgSO40.6 g，CaCl20.8 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 15 mg，MnSO415 mg，蒸餾水1 L，調節(jié)pH 5.5。121 ℃滅菌25 min。

黃瓜：中農6號，購于北京市海淀區(qū)中蔬種業(yè)公司。

1.2 淡紫紫孢菌微菌核的制備

將淡紫紫孢菌YES-2-14接種于液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)微菌核。將發(fā)酵液依次通過30目（孔徑550 μm）、100目（孔徑150 μm）滅菌的篩網，無菌水沖洗3次去除殘留的培養(yǎng)基。收集100目篩網上的微菌核，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 根結線蟲卵的制備

從河北廊坊試驗基地根結線蟲發(fā)病嚴重的地塊采集黃瓜病株，自來水沖掉土塊，用解剖針挑取卵囊，放入0.5% NaClO溶液中，玻璃棒攪拌3 min。將線蟲懸液依次通過滅菌的200目（孔徑75 μm）和500目（孔徑25 μm）篩網，無菌水反復沖洗，收集500目篩網上的線蟲卵，轉入50 mL離心管。調整卵懸液濃度至1000個/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 淡紫紫孢菌微菌核對根結線蟲卵的寄生作用

1.4.1 接種量對卵寄生作用的影響 制備10、100、300、900 MS/mL的微菌核懸浮液。24孔組織培養(yǎng)板中分別加入1 mL微菌核懸液和200 μL（約200粒）線蟲卵懸液，混合均勻，22 ℃培養(yǎng)7 d。倒置顯微鏡（CK2，Olympus，日本）下測定微菌核對根結線蟲卵的寄生情況，計算寄生率及卵的孵化率。以無菌水為對照，每個處理3個重復。

1.4.2 提前接入微菌核對卵寄生作用的影響 培養(yǎng)板中加入1 mL 300 MS/mL的微菌核懸液，然后分別于0、3和7 d時加入線蟲卵懸液，依照上述方法測定寄生率和卵孵化率。每個處理3個重復。

1.5 淡紫紫孢菌微菌核制劑防治黃瓜根結線蟲病

1.5.1 微菌核制劑的制備 將微菌核發(fā)酵液濃度調至400個/mL，按1:1（m/m）加入硅藻土吸附，混合、陰干，過40目篩，制備微菌核制劑，含量為400 MS/g。

1.5.2 病土的制備 采集廊坊試驗基地健康農田土壤，風干，過2目篩，121 ℃滅菌30 min。滅菌土中加入根結線蟲卵懸液，充分混合，使土壤中卵含量為300個/100 g土，裝入塑料花盆（7 cm×7 cm×7 cm）中，150 g/盆。

1.5.3 微菌核制劑防治黃瓜根結線蟲病的效果 將黃瓜種子用2%的NaClO表面消毒5 min，無菌水沖洗3次，28 ℃催芽至露白，播種至育苗盤（54 cm×28 cm，5×10孔）中。待長出2～3片真葉后，移栽至病土中，每盆1株。同時，穴施微菌核制劑，接種量分別為30、150、300、1500和3000 MS/100 g土。另外，菌劑采用2次接種，其中育苗基質中微菌核用量為300 MS/100 g土，移栽時接種量分別為300和3000 MS/100 g土，測定提前接種微菌核對根結線蟲病的防治效果。移栽30 d后，測量根結數(shù)及株高、根長和地上部鮮重等生長指標，計算防病效果。以不施用微菌核制劑的處理為對照。每個處理15株苗，3個重復，隨機排列。溫室溫度控制在22 ℃～28 ℃，按照常規(guī)方式管理。

1.6 環(huán)境因子對淡紫紫孢菌定殖的影響

1.6.1 土壤溫度的影響 培養(yǎng)皿中稱取20.0 g滅菌土，加入1 mL微菌核懸液（400個/mL）和2 mL無菌水，充分混合，封口膜密封，然后分別置于10 ℃、20 ℃、30 ℃培養(yǎng)箱中，在0、3、6、10、15、20 d時測定土壤中淡紫紫孢菌數(shù)量。測定方法為稱取1.0 g土，放入99 mL帶玻璃珠的無菌水中，梯度稀釋，吸取100 μL涂布于加抗PDA平板上。28 ℃培養(yǎng)3 d，記錄菌落數(shù)量（CFU）。每個處理3個重復。

1.6.2 土壤濕度的影響 培養(yǎng)皿中稱取20.0 g滅菌土，加入微菌核懸液和不同體積的無菌水，使土壤含水量分別為5%、10%、15%、20%和30%，混勻密封。不同時間取樣測定生防菌數(shù)量。每個處理3個重復。

1.6.3 土壤pH值的影響 采用草酸和NaOH調節(jié)土壤pH，測定酸堿度對淡紫紫孢菌定殖的影響。土樣風干、過篩，測定土壤pH值為7.35（中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準 NY/T 1377-2007）。稱取200.0 g土樣，分別加入6.3、12.6、25.2 g草酸和0.4、0.8、1.6 g NaOH顆粒，然后加入40 mL蒸餾水，充分混勻，室溫下靜置平衡7 d，測得土壤的pH值分別為4.51、5.91、6.52、7.95、8.45和9.21。將上述土樣121 ℃滅菌30 min，烘干，加入微菌核懸液，依照上述方法測定淡紫紫孢菌數(shù)量。每個處理3個重復。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用IBM SPSS Statistics 23和Excel 2019對試驗數(shù)據(jù)進行分析，采用單因素ANOVA檢驗，Duncan新復極差法比較差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 淡紫紫孢菌微菌核對根結線蟲卵的寄生作用

微菌核對根結線蟲卵的寄生率隨接種濃度的提高顯著增加（P＜0.05）。當微菌核濃度為 300 MS/mL時，對卵的寄生率達到50.9%，繼續(xù)提高接種濃度，寄生率無顯著變化。同時接種微菌核和根結線蟲，對線蟲卵的孵化率影響不大（表1），可能在微菌核萌發(fā)侵染前，線蟲卵已開始孵化。

表1 淡紫紫孢菌微菌核濃度對根結線蟲卵寄生率和孵化率的影響Table 1 Effects of P. lilacinum MS concentration on parasitism rates and hatching rates of root-knot nematode

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，淡紫紫孢菌微菌核萌發(fā)產生大量菌絲，繼而菌絲識別線蟲并開始侵染。在侵染初期，根結線蟲卵內部出現(xiàn)大量空泡，生防菌利用線蟲體內的營養(yǎng)生長繁殖，最終菌絲穿透卵殼，線蟲卵徹底消解（圖1）。

圖1 淡紫紫孢菌微菌核對根結線蟲卵的寄生作用Fig. 1 Parasitism of P. lilacinum MS on eggs of root-knot nematode

培養(yǎng)板中提前接入微菌核，可提高淡紫紫孢菌對根結線蟲的寄生率，降低卵的孵化率。當微菌核萌發(fā)7 d后再與線蟲卵混合培養(yǎng)，寄生率比同時接種提高了18.3%，卵孵化率降低了16.9%（表2），說明通過微菌核先期萌發(fā)，可有效提高生防菌的作用效果。

表2 淡紫紫孢菌微菌核接入時間對根結線蟲卵寄生率和孵化率的影響Table 2 Effects of inoculation time of P. lilacinum MS on parasitism rates and hatching rates of root-knot nematode eggs

2.2 淡紫紫孢菌微菌核制劑防治黃瓜根結線蟲病效果評價

溫室試驗表明，施用淡紫紫孢菌微菌核制劑可顯著促進黃瓜生長和根系發(fā)育（P＜0.05）。當微菌核用量為150 MS/100 g土時，黃瓜株高比對照增加了46.0%，根長增加42.2%。但用量過高（超過1500 MS/100 g土）時，對黃瓜生長并沒有明顯的促進作用（圖2）。在育苗基質中提前接入微菌核，黃瓜地上部鮮重比僅在移栽時使用菌劑增加34.2%～42.1%（表3，圖3）。

圖2 淡紫紫孢菌微菌核制劑使用濃度對黃瓜生長的影響Fig. 2 Effect of dosages of P. lilacinum MS agent on growth of cucumber

表3 淡紫紫孢菌微菌核制劑對黃瓜生長的影響及對根結線蟲的防病作用Table 3 Effects of P. lilacinum MS agent on plant growth and control efficacy on root-knot nematode in cucumber

圖3 淡紫紫孢菌微菌核制劑對黃瓜根系生長的影響Fig. 3 Effect of P. lilacinum MS agent on growth of cucumber roots

淡紫紫孢菌微菌核制劑對黃瓜根結線蟲具有良好的防治作用，隨著使用濃度的增加，防治效果顯著提高（P＜0.05）。當微菌核添加量為300 MS/100 g土時，防效為44.7%；濃度為3000 MS/100 g土時，防效達到65.6%。育苗和移栽時兩次使用微菌核制劑，可以顯著提高防病效果。微菌核用量為300 MS/100 g土時，根結數(shù)量從104降為74，防效提高到60%以上（表3）。

2.3 土壤環(huán)境對淡紫紫孢菌定殖的影響

2.3.1 土壤溫度對淡紫紫孢菌定殖的影響 淡紫紫孢菌微菌核施入土壤后萌發(fā)生長，并大量增殖。土壤溫度對其定殖能力有顯著影響（P＜0.05），20 ℃～30 ℃時，接種6 d后淡紫紫孢菌開始快速增殖，并維持在較高的水平。30 ℃下更利于淡紫紫孢菌定殖，第10 d時種群數(shù)量比低溫條件（10 ℃）下提高了13.1倍（圖4）。

圖4 土壤溫度對淡紫紫孢菌定殖的影響Fig. 4 Effect of soil temperature on colonization of P. lilacinum

2.3.2 土壤濕度對淡紫紫孢菌定殖的影響 土壤濕度對淡紫紫孢菌定殖具有顯著影響（P＜0.05），水分含量過高（30%）或過低（5%）均不利于其定殖。當土壤含水量為10%～15%時，微菌核施入6 d后開始快速增殖，20 d時種群數(shù)量達到1×107CFU/g土，比低濕、高濕條件下提高6～9倍（圖5）。

圖5 土壤濕度對淡紫紫孢菌定殖的影響Fig. 5 Effect of soil moisture on colonization of P. lilacinum

2.3.3 土壤pH對淡紫紫孢菌定殖的影響 土壤pH值對淡紫紫孢菌定殖具有顯著影響（P＜0.05）。弱酸性和中性土壤比堿性土壤更利于微菌核定殖，當pH值小于5或大于9時，生防菌種群數(shù)量增殖緩慢。微菌核施入土壤6 d后開始快速增殖，10 d后逐漸趨于穩(wěn)定。當土壤pH值為6.52時，淡紫紫孢菌數(shù)量最多，10 d時菌落數(shù)量達到1.4×107CFU/g（圖6）。

圖6 土壤pH對淡紫紫孢菌定殖的影響Fig. 6 Effect of soil pH on colonization of P. lilacinum

3 討論

微菌核是絲狀真菌在特定條件下形成的一種抗逆結構，具有較強的耐熱性、抗干燥能力，可大幅延長生防菌劑的貨架期。同時，微菌核能在土壤中長期存活，菌劑可以在整個作物生長周期發(fā)揮作用，控制病蟲害，并改善土壤微環(huán)境。由于其優(yōu)良的特性，生防真菌微菌核制劑的研發(fā)受到廣泛關注。通過改變發(fā)酵條件，一些生防真菌，如白僵菌、綠僵菌，已成功培養(yǎng)出微菌核，并對寄主害蟲顯示出較強的寄生作用[17,18,26,27]。Koppenh? fer等[27]研究發(fā)現(xiàn)，實驗室條件下，綠僵菌微菌核制劑對草坪象甲的感染率可達到67%～80%，但溫室和田間試驗中對害蟲的感染和控制效果并不理想。本試驗中，我們發(fā)現(xiàn)淡紫紫孢菌微菌核制劑不僅對黃瓜根結線蟲病具有良好的防治效果，同時還具有明顯的促生作用，具有良好的應用前景。

應用淡紫紫孢菌微菌核制劑時，使用劑量和方法對其生防作用有很大影響。微菌核是一種休眠結構，需要通過萌發(fā)，形成大量的菌絲和孢子進而實現(xiàn)對線蟲的侵染。低濃度下，其菌絲只能“捕捉”周圍的線蟲卵，但對于距離較遠的線蟲卵則無法進行侵染。同時，由于微菌核萌發(fā)較慢，導致線蟲卵已完成孵化，難以被淡紫紫孢菌寄生。因此，實際應用中可考慮在育苗基質中提前加入微菌核，使其在植物根際定殖，從而提高對根結線蟲病的防治效果。微菌核防病效果隨著接種濃度的提高而增加，但濃度過高時，并不能促進植株生長，且生產成本較高。盆栽試驗結果表明，當微菌核制劑用量為300 MS/100 g土，兩次施用對黃瓜根結線蟲病防效超過60%，并且促生作用最為明顯。我們認為淡紫紫孢菌微菌核制劑田間使用濃度選用300 MS/100 g土，育苗和移栽時兩次施用為宜。但在蔬菜、瓜果等易感作物生產，尤其是設施栽培中，由于連茬種植，根結線蟲發(fā)病極為嚴重，并且夏秋季節(jié)線蟲世代周期縮短，增殖迅速，因此應根據(jù)實際生產情況，在生長季增加施藥次數(shù)，使土壤中生防菌種群數(shù)量長期維持在一個較高的水平，以對抗線蟲的侵染。由于土壤抑菌作用普遍存在，導致生防菌劑在田間應用時效果不穩(wěn)定[28-29]。有研究顯示，淡紫紫孢菌分生孢子在一些耕作土壤中的萌發(fā)率低于30%[30,31]，因而嚴重影響了生防菌的作用。微菌核對土壤環(huán)境適應性強，易于定殖，作用穩(wěn)定，作為一種新型生防制劑具有更大的應用潛力。本研究表明，淡紫紫孢菌微菌核制劑適用范圍廣，當土壤含水量為5%或30%，pH為4.51或9.21時，微菌核仍可萌發(fā)并大量產孢，種群數(shù)量達到106CFU/g土，從而有效克服土壤抑菌作用的影響，充分發(fā)揮其生防功能。同時發(fā)現(xiàn)，在弱酸性至中性土壤中，土壤濕度為10%～15%、溫度20 ℃～30 ℃時更利于淡紫紫孢菌微菌核萌發(fā)、生長和增殖。生產中應根據(jù)微菌核的特性，優(yōu)化水分管理，合理選用應用技術，從而達到最佳的防病效果。

目前，對生防真菌微菌核制劑的研發(fā)還限于實驗室階段。雖然通過液體培養(yǎng)一些生防菌可以產生微菌核，但總體水平較低，產量在104MS/mL左右[17-19]，而分生孢子發(fā)酵水平可達到108～109CFU/mL。雖然微菌核用量相對較少，但生產成本顯著高于分生孢子制劑，優(yōu)化微菌核培養(yǎng)條件，提高微菌核發(fā)酵水平是其大規(guī)模生產和應用的關鍵。此外，適宜的使用技術也是微菌核制劑成功推廣應用的重要條件。液體發(fā)酵培養(yǎng)出的淡紫紫孢菌微菌核直徑在200～500 μm，如直接采用液劑灌根會導致部分微菌核停留在土壤表面，影響生防效果。可將微菌核制備成微粒劑或顆粒劑，采用拌土、穴施或灌根處理，也可以結合其他生防產品或低毒化學藥劑，從而有效防控土傳病害。