鐵載體產(chǎn)生菌Paenibacillus illinoisensisYZ29在花生根際定殖能力研究

李玉菲+王梅+杜秉海+汪城墻+姚良同+丁延芹

摘要：利用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記靶微生物是目前研究微生物和宿主相互作用的重要手段。在本研究中，研究者用電擊轉(zhuǎn)化的方法將穿梭載體pGFP4412導(dǎo)入鐵載體產(chǎn)生菌伊利諾伊類芽孢桿菌（P. illinoisensis）YZ29中，并得到成功表達(dá)GFP的YZ29-gfp菌株。利用雙抗平板篩選并結(jié)合熒光顯微鏡觀察的方法檢測(cè)了鐵載體產(chǎn)生菌YZ29在花生根部及土壤中定殖情況。結(jié)果表明：標(biāo)記菌株在激發(fā)光波長為488 nm的藍(lán)光下可觀察到綠色熒光；盆栽情況下YZ29-gfp可以在花生根際土和非根際土中定殖；實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下其在花生根表定殖，在根內(nèi)部沒有定殖。說明，YZ29能在花生根際有效定殖，為其促生和生防作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鐵載體產(chǎn)生菌；伊利諾伊類芽孢桿菌；花生；定殖

中圖分類號(hào)：S565.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）11-0064-05

Colonization Ability of Siderophore-Producing Bacterium

Paenibacillus illinoisensis YZ29 in Peanut Rhizosphere

Li Yufei1 ， Wang Mei2， Du Binghai1， Wang Chengqiang1，Yao Liangtong1， Ding Yanqin1

（1.Department of Microbiology，College of Life Science，Shandong Agricultural University，

Taian 271018，China；2.Taian Agricultural Bureau，Taian 271000，China）

AbstractMarking target microorganisms with green fluorescent protein （GFP） is an important means of studying the interaction between microorganisms and hosts. In this study， the shuttle vector pGFP4412 was introduced into the siderophore-producing bacterium Paenibacillus illinoisensis YZ29 by electroporation， and the YZ29-gfp strain successfully expressing GFP was obtained. The colonization of YZ29 on the peanut root surface and in the soil was studied by double-resistant plate screening combining with fluorescence microscope observation. The results showed that the green fluorescence could be observed under the blue light with excitation wavelength of 488 nm. The YZ29-gfp could colonize in the peanut rhizosphere and non-rhizosphere soils under pot culture. Under the condition of laboratory culture， it could colonize on the peanut root surface and could not colonize in the root. This showed that YZ29 could effectively colonize in the peanut rhizosphere， which layed a foundation for growth-promoting and biocontrol effects of peanut.

KeywordsSiderophore-producing bacterium；Paenibacillus illinoisensis；Peanut；Colonization

鐵載體是生長在低鐵環(huán)境中的微生物合成的一種具有高Fe3+專一性的低分子量鐵螯合劑[1]，其螯合的鐵可以被鐵脅迫條件下的植物作為鐵源直接利用，還能夠通過抑制病原微生物的生長而促進(jìn)植物根系的抗病能力，因此在促進(jìn)植物生長[2]和生物防治中有重要意義[3-5]。

花生黃化病主要是由于花生生長發(fā)育期鐵、硼和鋅等微量元素供應(yīng)不足，抑制了葉綠素合成，影響花生光合作用，從而表現(xiàn)為葉片失綠癥狀[6]。鐵載體產(chǎn)生菌的應(yīng)用，可以有效緩解作物因缺鐵引起的黃化病，從而促進(jìn)植物生長，提高產(chǎn)量，這是一種潛在的安全、有效、經(jīng)濟(jì)的糾正植物缺鐵性黃化病的途徑。國內(nèi)外相關(guān)研究工作者已經(jīng)在這方面做了大量工作，例如Hordt等[7]報(bào)道稱Penicillium chrysogenuma產(chǎn)生的鐵載體混合物在堿性土壤中能提高黃瓜和玉米的葉綠素含量；Masalha等[8]研究表明，微生物鐵載體與鐵離子的螯合物可被處于鐵脅迫下的植物作為鐵源直接利用，從而改善植物的缺鐵黃化癥狀。

在植物根系或根際土壤的有效定殖是根際促生菌發(fā)揮其促生功效的重要先決條件之一，因此研究定殖能力成為目前研究促生菌生防機(jī)理的重要內(nèi)容。綠色熒光蛋白（GFP）是一種良好的標(biāo)記物，可以直接、準(zhǔn)確觀測(cè)促生菌在植物根部的作用情況，被廣泛應(yīng)用于微生物標(biāo)記，例如，劉郵洲等[9]用綠色熒光蛋白標(biāo)記枯草芽孢桿菌PTS-394，研究其在番茄根部土壤中的定殖能力；郝變青等[10]采用綠色熒光蛋白標(biāo)記植物促生菌B96-Ⅱ，研究表明其在黃瓜根際土壤中具有持久的定殖能力且定殖數(shù)量隨土壤深度的增加而增加。伊利諾伊類芽孢桿菌YZ29是本實(shí)驗(yàn)室從花生根際土壤中分離的，已有研究表明，在盆栽條件下，伊利諾伊類芽孢桿菌YZ29能有效改善花生生長期內(nèi)的鐵營養(yǎng)狀況，并能增強(qiáng)花生根系活力，促進(jìn)花生植株體內(nèi)氮、磷、鉀的積累，從而減輕花生缺鐵黃化現(xiàn)象和促進(jìn)花生生長，大田試驗(yàn)中也有很好的促生和增產(chǎn)效果[11]。為進(jìn)一步闡明其促生機(jī)理，本試驗(yàn)用綠色熒光蛋白GFP 對(duì)YZ29菌株進(jìn)行分子標(biāo)記，利用雙抗平板篩選并結(jié)合熒光顯微鏡觀察的方法，對(duì)其在花生根部的定殖情況進(jìn)行初步研究。endprint

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

菌株與質(zhì)粒：伊利諾伊類芽孢桿菌YZ29由本實(shí)驗(yàn)室保存；芽孢桿菌與大腸桿菌穿梭載體pGFP4412由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送。

植物材料：花生品種小白沙（鐵敏感品種）。

抗生素：壯觀霉素（Spe），工作濃度50 μg/mL，YZ29抗性；卡那霉素（Km），工作濃度50 μg/mL，質(zhì)?？剐浴?/p>

主要儀器：BX51熒光顯微鏡，Olympus Optical；Eppendorf centrifuge 5810 離心機(jī)，Eppendorf；BD-370LT 超低溫冰箱，青島海爾股份有限公司；DNP-9162 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GelDoc-It 凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP 公司；UV-2000 型紫外-可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；5810R 型離心機(jī)（冷凍型），德國Eppendorf 公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1感受態(tài)的制備挑取YZ29單菌落于50 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于搖床內(nèi)37℃、180 r/min培養(yǎng)14～16 h。取5 mL菌液加至50 mL新鮮培養(yǎng)基M（LB+0.5 mol/L山梨醇）內(nèi)，放置于搖床內(nèi)37℃、180 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)大約5～6 h，至OD600約為0.9，停止培養(yǎng)。冰上放置10 min，然后4℃、6 000 r/min離心5 min，收集菌體。用Solution A（0.5 mol/L山梨醇+0.5 mol/L海藻糖+0.5 mol/L甘露醇+10%甘油+去離子水）洗滌菌體4次。用1.2 mL Solution A重懸菌體即感受態(tài)，然后分裝到小EP管內(nèi)，每管60 μL菌液，-80℃保存。

1.2.2電轉(zhuǎn)化裝有60 μL感受態(tài)的EP管置于冰上，加入7 μL提取的質(zhì)粒溶液，混勻，冰浴5 min。以上混合物轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.1 cm的電擊杯中，電壓2.2 kV，電擊時(shí)間4.5～5.5 ms，加入800 μL Solution B（0.5 mol/L山梨醇+0.5 mol/L海藻糖+0.38 mol/L甘露醇+LB液體）洗脫出菌體，37℃孵育3 h。涂布于含有50 μg/mL的卡那霉素抗性平板上，37℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落。熒光顯微鏡觀察熒光現(xiàn)象。

1.2.3質(zhì)粒檢測(cè)挑取成功表達(dá)熒光的單菌落和YZ29單菌落搖菌8 h至OD600達(dá)到0.8左右，利用OMEGA EZNA plasmid mini kitⅠ試劑盒提取質(zhì)粒，電壓120 V凝膠電泳40 min，檢測(cè)質(zhì)粒提取結(jié)果，檢測(cè)質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)入熒光表達(dá)菌株。

1.2.4質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)挑取標(biāo)記成功菌YZ29-gfp分別接種于含卡那霉素（50 μg/mL）和不含卡那霉素的10 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)，每12 h轉(zhuǎn)接一次，2%的接種量接種分別轉(zhuǎn)接含卡那霉素（50 μg/mL）和不含卡那霉素的液體培養(yǎng)基，連續(xù)搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)接12次。每隔36 h取菌液平板稀釋后涂布于非抗性LB平板，培養(yǎng)后挑取100個(gè)單菌落到含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，培養(yǎng)后在熒光下統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)算出菌株穩(wěn)定性。質(zhì)粒穩(wěn)定性=可以生長的發(fā)光菌落數(shù)/100。

1.2.5不同培養(yǎng)條件下YZ29-gfp在花生根部定殖規(guī)律

① 盆栽試驗(yàn)：將花生種子用10% H2O2在暗處消毒浸泡30 min后，用水沖洗數(shù)次，種植于采自濟(jì)南平陰縣石灰性土壤中，每盆5粒種子，出苗后定苗，每盆兩株。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理：處理1，每株花生施用5 mL濃度為108 cfu/mL的YZ29-gfp的菌懸液；處理2，每株花生施用 5 mL無菌水。

在施菌后10、20、30、50 d時(shí)檢測(cè)菌在根際土和非根際土的定殖情況。處理1稱取根際土和非根際土各10 g，梯度稀釋，取200 μL涂布于含50 μg/mL壯觀霉素和卡那霉素的雙抗平板，37℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)抗性平板上生長的菌落形態(tài)和熒光顯微鏡下發(fā)出的熒光信號(hào)鑒定并計(jì)算菌的數(shù)量。在施菌后10、20、30、50 d時(shí)用熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記成功的菌在根表的定殖，取花生根部，用無菌水沖洗干凈，徒手切片，熒光顯微鏡觀察發(fā)光情況。

②實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)：花生種子用10% H2O2在暗處消毒浸泡30 min，后用水沖洗數(shù)次，25℃催芽48 h，移入50 mL半固體霍格蘭培養(yǎng)基的錐形瓶中，28℃培養(yǎng)。至花生出芽后分2個(gè)處理：處理1，每株苗接108 cfu/mL的YZ29-gfp菌液1 mL；處理2，接等量的無菌水。在施菌后3、7、10、15 d時(shí)取出幼苗，用無菌水清洗掉根上附著的瓊脂，徒手切片，在熒光顯微鏡下觀察。

2結(jié)果與分析

2.1熒光顯微鏡鏡檢轉(zhuǎn)化子YZ29-gfp

電轉(zhuǎn)后，長出菌落形態(tài)與原始菌相似但顏色略帶黃綠色的菌落，gfp 可能成功導(dǎo)入YZ29中并成功表達(dá)轉(zhuǎn)化子，命名為YZ29-gfp。將YZ29-gfp的平板置于落射式熒光顯微鏡下，可直接看到轉(zhuǎn)化子呈現(xiàn)出熒光（圖1A）。為進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)化子，選取在落射式熒光顯微鏡下觀察發(fā)熒光的菌落經(jīng)劃線純化后，挑取單菌落并將其分散到無菌水中制成玻片，在100倍下用激發(fā)光波長為488 nm 的藍(lán)光可觀察到亮綠色的熒光（圖1B），說明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入YZ29內(nèi)并成功表達(dá)綠色熒光。

2.2質(zhì)粒檢測(cè)

提取成功表達(dá)熒光的YZ29-gfp和YZ29質(zhì)粒后，凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)入YZ29菌內(nèi)。如圖2所示，質(zhì)粒大小10.7 kb左右質(zhì)粒提取質(zhì)量較好，這進(jìn)一步證實(shí)質(zhì)粒成功地轉(zhuǎn)入表達(dá)熒光的YZ29菌株內(nèi)。

2.3質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性

標(biāo)記菌株YZ29-gfp質(zhì)粒穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，在沒有選擇壓力的情況下，隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加，標(biāo)記菌株的穩(wěn)定性有降低趨勢(shì)。培養(yǎng)液中不加卡那霉素時(shí)，菌株YZ29-gfp連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，質(zhì)粒穩(wěn)定性為77%，連續(xù)轉(zhuǎn)接6次，質(zhì)粒穩(wěn)定性為零。培養(yǎng)液中加卡那霉素時(shí)，菌株YZ29-gfp連續(xù)轉(zhuǎn)接12次，質(zhì)粒穩(wěn)定性為82%?？梢詽M足定殖試驗(yàn)的要求。endprint