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    淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液生防活性及代謝組學(xué)分析

    2022-09-16 05:56:52范樂(lè)樂(lè)孫漫紅李世東
    關(guān)鍵詞:生防孢菌菌核

    范樂(lè)樂(lè),郭 妍,趙 雪,孫漫紅,李世東

    (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京 100193)

    淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinum(異名:淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus)是一種重要的生防真菌,可寄生根結(jié)線蟲(chóng)Meloidogynespp.、胞囊線蟲(chóng)Heteroderaspp.和腎狀線蟲(chóng)Rotylenchulusspp.等多種植物線蟲(chóng)[1-3],同時(shí)對(duì)番茄灰霉病、辣椒炭疽病等多種植物病害具有良好的防控效果[4,5]。研究表明,淡紫紫孢菌發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生多種活性物質(zhì),其中幾丁質(zhì)酶、絲氨酸蛋白酶、丁酸和脂肪酸等對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)具有強(qiáng)烈的抑殺作用[6-8]。Seo等[9]對(duì)淡紫紫孢菌發(fā)酵液提純分析發(fā)現(xiàn),殺線蟲(chóng)活性組分主要為乙酸。淡紫紫孢菌還可以產(chǎn)生白灰質(zhì)菌素、Acremonidin E和擬青霉酰胺等具有廣譜抗真菌和細(xì)菌活性的化合物,能夠明顯抑制立枯絲核菌Rhizoctonia solani、水稻惡苗病菌Fusarium moniliforme和辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici等病原菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)孢[10-13]。此外,代謝物中還有一些組分能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng),提高植株苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶的活性[14,15]。

    淡紫紫孢菌培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生大量的菌絲和分生孢子,而在特定條件下也可以誘導(dǎo)形成一種抗逆結(jié)構(gòu)—微菌核(Microsclerotia,MS)[16]。微菌核由大量菌絲纏繞特化而成[17,18],可顯著提高絲狀真菌對(duì)高溫、干旱等不良環(huán)境的耐受力[16,19],同時(shí)也可以從根本上解決生防真菌貨架期短、穩(wěn)定性差等問(wèn)題[20,21]。目前,一些生防真菌已成功培養(yǎng)出微菌核,如金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae、球孢白僵菌Beauveria.bassiana、布氏白僵菌B. brongniartii和哈茨木霉Trichoderma harzianum[22-24],但微菌核培養(yǎng)過(guò)程中濾液的生防活性及其相關(guān)的活性物質(zhì)尚不明確。

    淡紫紫孢菌 YES-2-14是本實(shí)驗(yàn)室分離到的一株生防菌,對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)病具有較好的防治效果[25,26]。前期研究發(fā)現(xiàn),YES-2-14微菌核發(fā)酵的pH曲線顯著低于分生孢子發(fā)酵液,推測(cè)在此過(guò)程中可能激活了不同的代謝途徑,生成不同的代謝產(chǎn)物。本研究通過(guò)室內(nèi)生測(cè)和溫室盆栽試驗(yàn),測(cè)定淡紫紫孢菌微菌核培養(yǎng)過(guò)程中代謝產(chǎn)物的生防活性,同時(shí)基于 LC-MS構(gòu)建代謝組,分析代謝組分的變化,以期為揭示淡紫紫孢菌生防機(jī)制奠定基礎(chǔ),為微菌核制劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    淡紫紫孢菌YES-2-14,分離自云南煙草根結(jié)線蟲(chóng);立枯絲核菌Rhizoctonia solani和核盤菌Sclerotinia sclerotiorum,分離自黑龍江省大豆病株;大麗輪枝菌Verticillium dahlia,分離自新疆棉花黃萎病病株。以上菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所土傳病害生防實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。

    分生孢子培養(yǎng)基:玉米粉8 g、蔗糖20 g、酵母浸粉15 g、K2HPO4·3H2O 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 1 g、無(wú)水CaCl22 g,加蒸餾水至1 L。121 ℃滅菌25 min。

    微菌核培養(yǎng)基:蔗糖40 g,酵母浸粉15 g,KH2PO44 g,MgSO40.6 g,CaCl20.8 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g,ZnSO4·7H2O 15 mg,MnSO415 mg,蒸餾水 1 L,調(diào)節(jié) pH 5.5。121 ℃滅菌 25 min。

    黃瓜:中農(nóng)6號(hào),購(gòu)買于北京市海淀區(qū)中蔬種業(yè)公司。

    1.2 淡紫紫孢菌微菌核與分生孢子發(fā)酵濾液的制備

    將淡紫紫孢菌YES-2-14接種于PDA平板上培養(yǎng)7 d,加入10 mL 0.05%的吐溫80溶液洗脫孢子,制備孢子懸浮液(濃度為3×108孢子/mL)。吸取2 mL分別接種于微菌核培養(yǎng)基和分生孢子培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng),微菌核培養(yǎng)120 h,分生孢子培養(yǎng)72 h。將發(fā)酵液5000 r/min離心15 min,上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜去除菌體,制備微菌核發(fā)酵濾液和分生孢子發(fā)酵濾液。

    1.3 根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的制備

    采集根結(jié)線蟲(chóng)病株,自來(lái)水沖洗去除土塊,用解剖針挑取卵囊,放入0.5% NaClO溶液中,攪拌使線蟲(chóng)卵全部釋放。將線蟲(chóng)懸液依次通過(guò)滅菌的200目和500目篩網(wǎng),無(wú)菌水反復(fù)沖洗,收集500目篩網(wǎng)上的線蟲(chóng)卵,置于支起的無(wú)菌濾紙上,培養(yǎng)皿中加水保濕,25 ℃孵化3 d。收集二齡幼蟲(chóng)(J2),制備200 J2/mL懸浮液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的作用

    12孔組織培養(yǎng)板中加入1 mL線蟲(chóng)幼蟲(chóng)懸液,然后分別加入等體積的淡紫紫孢菌微菌核和分生孢子發(fā)酵濾液及5倍稀釋液,輕輕晃動(dòng)混合,25 ℃培養(yǎng)2 d,倒置顯微鏡(CK2,Olympus,日本)下記錄存活和死亡的線蟲(chóng)數(shù)量,計(jì)算校正死亡率?;钴S、彎曲蠕動(dòng)的幼蟲(chóng)為活線蟲(chóng),蟲(chóng)體僵直且加入NaOH溶液刺激后仍然不動(dòng)的為死線蟲(chóng)。以無(wú)菌水為對(duì)照,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

    1.5 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)植物病原真菌的抑制作用

    將PDA培養(yǎng)基冷卻至50 ℃,分別加入微菌核濾液和孢子濾液(4:1,v/v),充分混勻,倒板。將立枯絲核菌、核盤菌和大麗輪枝菌在PDA平板上培養(yǎng)7 d,用打孔器打取直徑為0.5 cm的菌餅,接種于含有發(fā)酵濾液的平板中央,28 ℃培養(yǎng)。7 d后刮取菌絲,烘干至恒重,測(cè)量生物量。核盤菌培養(yǎng)15 d后,觀察菌核數(shù)量的變化。以添加無(wú)菌水的培養(yǎng)基為對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

    1.6 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

    選取飽滿且大小一致的黃瓜種子,1% NaClO溶液消毒3 min,自來(lái)水沖洗。在培養(yǎng)皿中放置直徑9 cm的滅菌濾紙,分別加入4 mL稀釋10倍的微菌核濾液和孢子濾液,然后均勻擺放15粒黃瓜種子,26 ℃培養(yǎng),并適時(shí)補(bǔ)充無(wú)菌水。種子發(fā)芽后3 d測(cè)定根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)和幼苗鮮重。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

    1.7 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液防治黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)病溫室試驗(yàn)

    從河北廊坊試驗(yàn)基地根結(jié)線蟲(chóng)發(fā)病嚴(yán)重的地塊取土,充分混合均勻,密度梯度離心法測(cè)定線蟲(chóng)含量為56條/100 g土。將病土分裝到直徑為12 cm的花盆中,600 g/盆。

    將黃瓜種子用1%的NaClO消毒3 min,無(wú)菌水沖洗3次,28 ℃催芽至露白,播種于病土中,每盆2株,出苗后保留1株。待長(zhǎng)出2~3片真葉后,分別加入10 mL微菌核濾液和孢子濾液。每個(gè)處理10株苗,隨機(jī)排列。溫室溫度控制在22 ℃~28 ℃,常規(guī)方式管理。45 d后,統(tǒng)計(jì)株高、莖粗、根長(zhǎng)和病情指數(shù),計(jì)算防效。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

    采用5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),調(diào)查黃瓜根部線蟲(chóng)發(fā)病情況。0級(jí):根系健康,無(wú)根結(jié);1級(jí):根結(jié)長(zhǎng)度為根系總長(zhǎng)度的1%~15%;2級(jí):根結(jié)長(zhǎng)度為根系總長(zhǎng)度的16%~25%;3級(jí):根結(jié)長(zhǎng)度為根系總長(zhǎng)度的26%~50%;4級(jí):根結(jié)長(zhǎng)度為根系總長(zhǎng)度的51%~75%;5級(jí):根結(jié)長(zhǎng)度達(dá)到75%以上。

    1.8 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析

    1.8.1 微菌核發(fā)酵濾液的制備 將淡紫紫孢菌YES-2-14接種于PDA平板上培養(yǎng)至產(chǎn)孢,0.05%的吐溫80洗脫孢子,制備孢子懸浮液,接種于產(chǎn)微菌核培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。分別于0、72、120 h取樣,獲得微菌核發(fā)酵液。將上述發(fā)酵液4 ℃、5000 r/min離心15 min,取上清液,過(guò)0.22 μm孔徑濾膜去除菌體,制備MS 0 h、MS 72 h、MS 120 h發(fā)酵濾液,每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

    1.8.2 樣品預(yù)處理 參照Dunn等[27]方法對(duì)發(fā)酵濾液進(jìn)行預(yù)處理。分別取1.5 mL MS 0 h、MS 72 h、MS 120 h發(fā)酵濾液至2 mL離心管中,真空濃縮至無(wú)液體,加入500 μL甲醇(-20 ℃)復(fù)溶,渦旋振蕩1 min,4 ℃、12000 r/min離心10 min,取上清液至2 mL離心管中,真空濃縮至盡干。加入150 μL 80%甲醇配置的2-氯苯丙氨酸溶液(4 mg/L)(-20 ℃保存)復(fù)溶樣品,過(guò)0.22 μm濾膜后加入到檢測(cè)瓶中進(jìn)行LC-MS檢測(cè)。

    1.8.3 LC-MS檢測(cè) 參照Z(yǔ)elena等[28]方法,對(duì)發(fā)酵濾液進(jìn)行LC-MS分析。自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為8 ℃,柱溫為40 ℃,流速為0.25 mL/min。正離子模式流動(dòng)相采用0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸,甲酸乙腈的洗脫梯度為:0~1 min,2%;1~9 min,2%~50%;9~12 min,50%~98%;12~13.5 min,98%;13.5~14 min,98%降至2%;14~20 min,2%。負(fù)離子模式流動(dòng)相為乙腈和5 mM甲酸銨溶液,乙腈的洗脫梯度程序同上述甲酸乙腈溶液。質(zhì)譜檢測(cè)毛細(xì)管溫度325 ℃,離子掃描范圍m/z 81~1000,二級(jí)分辨率為17500[29]。

    1.8.4 數(shù)據(jù)處理 采用R XCMS軟件包進(jìn)行峰檢測(cè)、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊處理[30],采用MassBank等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)發(fā)酵液中檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行鑒定[31]。采用R Ropls軟件包對(duì)鑒定到的物質(zhì)進(jìn)行PCA、OPLS-DA分析[32]。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算P值和VIP值(變量投影重要度)篩選微菌核形成過(guò)程中的差異代謝物,篩選條件為P<0.05,且VIP>1。

    1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    利用IBM SPSS Statistics 23和Excel 2019對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用單因素ANOVA檢驗(yàn)和t檢驗(yàn),Duncan新復(fù)極差法比較差異顯著性(P<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 淡紫紫孢菌微菌核濾液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的觸殺作用

    微菌核發(fā)酵濾液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)具有強(qiáng)烈的抑殺作用(圖1),稀釋2倍時(shí)殺線活性為93.1%;稀釋10倍后,線蟲(chóng)校正死亡率可達(dá)到50%以上,顯著高于分生孢子濾液(P<0.05)。

    圖1 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的致死作用Fig. 1 Effect of P. lilacinum MS fermentation filtrate on the second-stage juveniles of root knot nematode

    2.2 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液的抑菌活性

    淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)多種植物病原真菌均具有明顯的抑制作用(P<0.05),處理后大麗輪枝菌菌絲稀疏,生長(zhǎng)減慢,生物量減少62.6%。微菌核濾液對(duì)立枯絲核菌和核盤菌的抑制率分別為53.5%和70.5%,并可有效抑制菌核的形成。其抑菌活性與孢子濾液存在一定差異,對(duì)核盤菌的抑制率比孢子濾液提高1.3倍,但孢子濾液對(duì)立枯絲核菌的拮抗作用顯著高于微菌核濾液(圖2)。

    圖2 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)3種植物病原真菌的抑制作用Fig. 2 Inhibition of MS fermentation filtrate of P. lilacinum to three plant fungal pathogens

    2.3 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

    微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜幼苗具有明顯的促生作用(P<0.05)。采用10倍稀釋液處理種子,幼苗根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)分別增加了16.8%和21.3%,苗重增加13.0%,作用效果與孢子濾液一致(表1)。

    表1 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of P. lilacinum MS fermentation filtrates on growth of cucumber seedlings

    2.4 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液防治根結(jié)線蟲(chóng)病溫室試驗(yàn)效果

    微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)病具有較好的防治效果(圖3)。當(dāng)用量為10 mL/株時(shí),防效達(dá)到44.9%,并且濾液可以明顯促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)(P<0.05),株高和莖粗比對(duì)照分別增加了21.6%和38.4%。與分生孢子發(fā)酵濾液相比,微菌核濾液處理后黃瓜莖粗提高24.4%(表2)。

    圖3 淡紫紫孢菌發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜生長(zhǎng)及根結(jié)線蟲(chóng)的作用Fig. 3 Effects of P. lilacinum fermentation filtrates on plant growth and control efficacy on root-knot nematode in cucumber

    表2 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜生長(zhǎng)的影響及對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)病的防治效果Table 2 Effect of P. lilacinum MS fermentation filtrate on plant growth and its control efficacy on root-knot nematode in cucumber

    2.5 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析

    2.5.1 主成分分析(PCA) PCA得分圖顯示,淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液在不同階段(0、72、120 h)的平行樣本基本聚集在一起。第一主成分PC1和第二主成分PC2累計(jì)貢獻(xiàn)率75.1%,表明微菌核發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)物具有明顯差異,且所有檢測(cè)分析穩(wěn)定性和試驗(yàn)重現(xiàn)性良好(圖4A),該模型可用于代謝物組分分析。

    圖4 淡紫紫孢菌微菌核濾液PCA和OPLS-DA得分圖及OPLS-DA置換檢驗(yàn)圖Fig 4 PCA and OPLS-DA score plots and OPLS-DA permutation test chart of MS fermentation filtrate of P. lilacinum

    2.5.2 正交-偏最小二乘判別分析(OPLS-DA) 將不同發(fā)酵時(shí)間濾液中的化合物進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,得到OPLS-DA得分圖(圖4B,C)。圖中不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵濾液中代謝產(chǎn)物明顯分離,且全部樣品組都位于置信區(qū)間內(nèi),表明各組間存在顯著差異。計(jì)算得到參數(shù) R2Y=0.999、Q2=0.992,截距 Q2回歸線的截距為-0.11<0,說(shuō)明模型穩(wěn)定,數(shù)據(jù)可靠。

    2.5.3 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵代謝產(chǎn)物種類及含量分析 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液中共鑒定出588種化合物,其中氨基酸、肽和類似物(71種),醇和多元醇(50種),碳水化合物和碳水化合物結(jié)合物(39種),胺類(28種)和脂肪酸類(28種)。發(fā)酵過(guò)程中一些與生命活動(dòng)密切相關(guān)的物質(zhì),如氨基酸、肽、碳水化合物、嘌呤和嘧啶等含量無(wú)明顯變化。隨著微菌核的大量形成(72~120 h),羰基化合物、胺類、醛類等物質(zhì)含量顯著下降;而一些代謝活性物質(zhì),如醇及多元醇、酚類、吡啶羧酸及其衍生物、苯甲酸及其衍生物、二羧酸及其衍生物、咪唑類含量均顯著增加。此外,脂肪酸類物質(zhì)在72 h時(shí)含量顯著高于0和120 h,推測(cè)菌株培養(yǎng)后期隨著培養(yǎng)基中蔗糖、酵母浸粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗,淡紫紫孢菌有可能利用前期代謝產(chǎn)生的脂肪酸類物質(zhì)(表3)。

    表3 淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液中代謝產(chǎn)物種類及含量Table 3 Types and contents of metabolites in MS fermentation filtrate of P. lilacinum

    2.5.4 淡紫紫孢菌微菌核形成過(guò)程中差異代謝物及相對(duì)含量分析 對(duì)不同取樣點(diǎn)(0、72、120 h)代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選(P<0.05,且VIP>1),共得到216種差異代謝物。其中,116種化合物在微菌核形成過(guò)程中含量顯著增加,主要為醇類(16種)、碳水化合物類(9種)、脂肪酸類(8種)等;另有100種含量顯著下降,以氨基酸類(14種)、嘌呤類物質(zhì)(7種)、胺類物質(zhì)(5種)為主;也有一些化合物前期含量明顯增加,隨后呈下降趨勢(shì)(圖5)。對(duì)其中含量增加的組分分析,得到芥酸、高香草酸、胡椒酚和泛酸等具有抑菌活性以及胍基丙酸、丁酸和咪唑乙酸等具有殺線蟲(chóng)活性的化合物(表4)。

    圖5 淡紫紫孢菌微菌核形成過(guò)程中差異代謝物聚類熱圖Fig. 5 Heat diagram of differential metabolites secreted during P. lilacinum microsclerotia production

    表4 淡紫紫孢菌微菌核濾液中差異代謝物質(zhì)及相對(duì)含量Table 4 Relative contents of differential metabolites in conidia and MS fermentation filtrate of P. lilacinum

    3 討論

    培養(yǎng)條件對(duì)生防真菌發(fā)酵產(chǎn)物的積累及其活性具有重要影響。營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境的改變直接影響生防微生物的生長(zhǎng)繁殖與代謝,進(jìn)而影響其生防作用[33-35]。我們發(fā)現(xiàn),通過(guò)環(huán)境脅迫和營(yíng)養(yǎng)的改變,淡紫紫孢菌從菌絲和孢子發(fā)酵轉(zhuǎn)換為微菌核的大量生成,這期間發(fā)酵液pH曲線隨之發(fā)生改變,推測(cè)對(duì)微菌核的誘導(dǎo)可能激活了不同的代謝途徑,從而引起發(fā)酵和代謝產(chǎn)物,以及生防作用發(fā)生變化。本試驗(yàn)中,淡紫紫孢菌微菌核發(fā)酵濾液同孢子濾液都表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺線蟲(chóng)、抑菌和促生活性,但對(duì)不同病原菌的抑制作用存在較大差異,微菌核濾液對(duì)核盤菌菌絲生長(zhǎng)和菌核形成的抑制作用明顯強(qiáng)于孢子濾液,但對(duì)立枯絲核菌的抑制作用則相對(duì)較差(P<0.05)。此外,稀釋10倍的微菌核濾液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的致死率顯著高于孢子濾液,推測(cè)淡紫紫孢菌在形成微菌核過(guò)程中,產(chǎn)生了更多的具有殺線蟲(chóng)活性的代謝物。

    目前已報(bào)導(dǎo)的殺線蟲(chóng)真菌活性代謝物主要有生物堿類、萜類、醌類、大環(huán)內(nèi)酯類、肽類和萘類等[36],淡紫紫孢菌發(fā)酵液中含有乙酸、脂肪酸、酚酸、倍半萜和幾丁質(zhì)酶等活性物質(zhì)[8,37,38]。我們從淡紫紫孢菌微菌核培養(yǎng)代謝組中鑒定到的代謝物以羧酸、苯類和酯類化合物為主,包括氨基酸和糖類等與生長(zhǎng)和能量代謝相關(guān)的物質(zhì),以及生物堿和脂肪酸等具有殺線抑菌作用的組分。在分生孢子形成過(guò)程中,芳香烴、酯類和雜環(huán)類物質(zhì)種類和相對(duì)含量較多[39],與淡紫紫孢菌微菌核形成過(guò)程中的代謝產(chǎn)物存在一定差異。目前,我們僅通過(guò) LC-MS對(duì)微菌核發(fā)酵代謝物的種類及相對(duì)含量進(jìn)行分析,此外還有一些化合物,如吡啶類、唑類,相對(duì)峰面積較大,但是否具有生防作用仍然未知,接下來(lái)可以從中選取含量較高的組分進(jìn)行定量分析,并檢測(cè)其活性。

    迄今,市場(chǎng)上的淡紫紫孢菌產(chǎn)品均為分生孢子和菌絲制劑,貨架期短,受環(huán)境影響較大,嚴(yán)重限制了其大面積應(yīng)用。微菌核制劑作為一種新型生防真菌產(chǎn)品,具有耐熱性強(qiáng)、抗干燥,貨架期長(zhǎng),作用穩(wěn)定等諸多優(yōu)點(diǎn)。蟲(chóng)生真菌中,白僵菌、綠僵菌微菌核制劑已成功用于寄主害蟲(chóng)的防治[40,41]。我們發(fā)現(xiàn),較低劑量的淡紫紫孢菌微菌核對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)病防效可達(dá)到50%以上(未發(fā)表),同時(shí),微菌核發(fā)酵濾液具有良好的殺線、防病和促生效果。生產(chǎn)中采用硅藻土、高嶺土等載體對(duì)微菌核發(fā)酵液直接進(jìn)行吸附,制備微菌核粉劑或顆粒劑,同時(shí)結(jié)合其他有機(jī)添加物,既可保護(hù)微菌核,又能充分利用發(fā)酵液中的活性代謝物,提高菌劑的生防效果。通過(guò)微菌核制劑的研發(fā)可有效解決目前淡紫紫孢菌生產(chǎn)和應(yīng)用中的問(wèn)題,促進(jìn)此類生防微生物的推廣應(yīng)用。

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