混合菌發(fā)酵臭鱖魚(yú)工藝優(yōu)化

馬曉飛， 黃 寧， 梁鉆好， 杜 冰

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2. 陽(yáng)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與環(huán)境工程系，廣東 陽(yáng)江 529566）

0 引言

臭鱖魚(yú)，徽州名菜，起源于200 多年前，沿江一帶魚(yú)販入冬時(shí)把新鮮鱖魚(yú)（又名桂魚(yú)、桂花魚(yú)）用木桶裝運(yùn)至徽州出售，路途需七八天，便以鹽抑腐，經(jīng)常上下翻動(dòng)，如此便有一種似臭非臭的特殊氣味，但魚(yú)形態(tài)完整，洗凈后經(jīng)熱油稍煎再細(xì)火烹飪，肉質(zhì)鮮香，醇滑爽嫩。后來(lái)如此膾炙人口的佳肴便延續(xù)至今。臭鱖魚(yú)以“聞臭吃香”為特色，近幾年隨著鱖魚(yú)養(yǎng)殖技術(shù)提升而走紅。但臭鱖魚(yú)的加工還是以沿用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方式的小作坊為主，存在品質(zhì)和風(fēng)味不可控、發(fā)酵周期長(zhǎng)、高鹽、微生物超標(biāo)、食用安全性受質(zhì)疑等現(xiàn)象[1-2]。臭鱖魚(yú)的加工技術(shù)還沒(méi)有一個(gè)根本性的革新。

發(fā)酵過(guò)程是微生物菌群進(jìn)行選擇和富集的過(guò)程，對(duì)臭鱖魚(yú)關(guān)鍵風(fēng)味的形成具有決定性作用[3]。大量研究表明，乳酸菌是自然發(fā)酵臭鱖魚(yú)的優(yōu)勢(shì)菌群，通過(guò)分泌蛋白酶作用于魚(yú)肌肉蛋白，促進(jìn)小分子多肽和游離氨基酸的釋放，這些小分子多肽和游離氨基酸不僅是重要的呈味物質(zhì)，而且也是某些重要特征風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，在發(fā)酵后期會(huì)進(jìn)一步形成風(fēng)味物質(zhì)[4-7]。乳酸菌還能抑制臭鱖魚(yú)儲(chǔ)藏后期揮發(fā)性鹽基氮、硫代巴比妥酸值和生物胺的積累[8]。如清酒乳桿菌可明顯降低魚(yú)肉甲硫醇等惡臭氣味的產(chǎn)生，同時(shí)促進(jìn)芳樟醇、α-松油醇、α-蒎烯和檸檬烯等香氣物質(zhì)的生成，顯著提升臭鱖魚(yú)風(fēng)味，同時(shí)抑制雜菌生長(zhǎng)[9-10]。人工添加優(yōu)勢(shì)菌干預(yù)臭鱖魚(yú)發(fā)酵，一方面可定向改善和提升臭鱖魚(yú)風(fēng)味，另一方面可使整個(gè)加工環(huán)節(jié)和食品安全具有可控性。

產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106（Bacillussp. DU-106）為蠟樣芽孢桿菌屬的一個(gè)新亞種，其特點(diǎn)是兼性厭氧，在有氧環(huán)境下也能表現(xiàn)出極強(qiáng)的繁殖能力，高產(chǎn)L-乳酸，經(jīng)研究具有良好的免疫活性和腸道益生菌特性，應(yīng)用于中草藥和果蔬發(fā)酵飲料中已表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)，關(guān)注度不斷提高[11-18]。本課題擬采用產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106 復(fù)配中國(guó)根霉12 發(fā)酵臭鱖魚(yú)，利用中國(guó)根霉高產(chǎn)脂肪酶催化短鏈脂肪酸合成芳香酯類(lèi)物質(zhì)的特點(diǎn)，豐富和柔和臭鱖魚(yú)的“臭”味，助力乳酸菌和中國(guó)根霉在水產(chǎn)品發(fā)酵中的應(yīng)用[19]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮鱖魚(yú)、生姜，購(gòu)于陽(yáng)江市木賚市場(chǎng)。

產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106 凍干粉（活性為3×1010cfu/g）和中國(guó)根霉12，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源食品與功能性原料研究及評(píng)價(jià)中心提供；葡萄糖粉、可溶性膳食纖維、菊粉、花椒粉、小紅椒粉、茴香粉、白糖和味精，均為食品級(jí)。

中國(guó)根霉12 活化斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，121 °C 滅菌20 min。

中國(guó)根霉12 擴(kuò)大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，121 °C 滅菌20 min。

SW-CJ-2F 型超凈工作臺(tái)（廣州瑞智凈化設(shè)備有限公司）；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）；LAB254e 型電子精密天平（艾德姆衡器（武漢）有限公司）；MAXQ6000型低溫?fù)u床（廣州源起健康科技有限公司）；SPX-250BⅢ型生化培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程及關(guān)鍵控制點(diǎn)

工藝流程：新鮮鱖魚(yú)→清洗凈膛→接種（添加輔料）→發(fā)酵→清洗→臭鱖魚(yú)成品。

關(guān)鍵控制點(diǎn)如下。

（1）清洗凈膛。鮮活鱖魚(yú)，去魚(yú)鰓、魚(yú)鱗和內(nèi)臟，魚(yú)酮體用清水沖洗干凈至無(wú)血絲，瀝干，稱(chēng)量，質(zhì)量約（500 ±100 ）g。

（2）輔料配比。花椒粉10 g、小紅椒粉20 g、茴香粉5 g、剁碎的生姜10 g、白糖10 g、味精5 g，臨用前混合均勻。

（3）根霉菌液。接種1-2 環(huán)中國(guó)根霉12 保藏菌種至PDA 培養(yǎng)基中，32 °C 靜置培養(yǎng)3 d，馬鈴薯液體培養(yǎng)基接種后32 °C 振蕩培養(yǎng)3 d。

（4）乳酸菌粉。6 g 產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106 凍干粉、77 g 葡萄糖粉、7 g 可溶性膳食纖維、10 g 菊粉，混合均勻；使用前先用15 mL 無(wú)菌生理鹽水30 °C 活化30 min。

（5）發(fā)酵。按一定比例接種根霉菌液和乳酸菌粉，添加鹽和輔料，15 °C 恒溫恒濕箱中發(fā)酵一定時(shí)間；期間每天翻一次魚(yú)身，3 d 后倒掉多余的浸出液。

（6）清洗。發(fā)酵結(jié)束后用無(wú)菌水清洗鱖魚(yú)酮體，真空包裝，-18 °C 保存。

1.2.2 臭鱖魚(yú)加工單因素試驗(yàn)

加鹽量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)價(jià)的影響：分別將0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的食鹽與0.5%輔料、6.0%根霉菌液、3.0%乳酸菌粉混合均勻后涂抹在清洗干凈的鱖魚(yú)酮體表面，至于密封容器中，15 °C 發(fā)酵8 d。

根霉菌液接種量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)價(jià)的影響：分別將0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%的根霉菌液與2.0%食鹽、0.5%輔料、3.0%乳酸菌粉混合均勻后涂抹在清洗干凈的鱖魚(yú)酮體表面，至于密封容器中，15°C 發(fā)酵8 d。

乳酸菌粉添加量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)價(jià)的影響：分別將1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的乳酸菌粉與2.0%食鹽、0.5%輔料、6.0%根霉菌液接種量混合均勻后涂抹在清洗干凈的鱖魚(yú)酮體表面，至于密封容器中，15 °C發(fā)酵8 d。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)價(jià)的影響：將2.0%食鹽、0.5%輔料、6.0%根霉菌液和3.0%乳酸菌粉混合均勻后涂抹在清洗干凈的鱖魚(yú)酮體表面，至于密封容器中，15 °C 分別發(fā)酵6、8、10、12、14 d。

1.2.3 臭鱖魚(yú)加工工藝優(yōu)化試驗(yàn)

經(jīng)單因素試驗(yàn)，認(rèn)為根霉菌液接種量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)價(jià)無(wú)顯著影響，故以加鹽量、乳酸菌粉添加量和發(fā)酵時(shí)間為自變量，感官評(píng)分為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面 Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)法對(duì)臭鱖魚(yú)加工工藝進(jìn)行優(yōu)化，分析各因素間的交互作用，確定最佳的加工工藝條件。

1.2.4 感官評(píng)價(jià)

對(duì)臭鱖魚(yú)的氣味、魚(yú)肉組織狀態(tài)和口感進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中氣味是以生魚(yú)作評(píng)價(jià)，魚(yú)肉組織狀態(tài)和口感是以熟魚(yú)（清蒸，武火至水沸后轉(zhuǎn)文火蒸10 min）作評(píng)價(jià)。

10 分制感官評(píng)分細(xì)則如表1 所示。選取12 名腌制水產(chǎn)品評(píng)價(jià)專(zhuān)家進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，得到的結(jié)果去除最高值和最低值后取平均值。

表1 臭鱖魚(yú)感官評(píng)分細(xì)則Tab. 1 Sensory scoring rules of stinky mandarin fish

風(fēng)味剖面檢驗(yàn)分析法：對(duì)風(fēng)味（酸味和臭味）、肉質(zhì)（彈性和蒜瓣?duì)睿?、滋味（咸味和酸味）采? 分定義的標(biāo)度方法（1-不存在的；2-非常輕微的；3-輕微的；4-明確的；5-顯著的；6-非常顯著的）對(duì)臭鱖魚(yú)樣品進(jìn)行強(qiáng)度評(píng)價(jià)，并進(jìn)行風(fēng)味剖面檢驗(yàn)分析[20]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用WPS Office 2019 處理數(shù)據(jù)，并用Origin 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加鹽量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的影響

臭鱖魚(yú)腌制過(guò)程中，食鹽起到的最主要作用是防腐，其次才是調(diào)味和改變?nèi)赓|(zhì)口感。如圖1 所示，隨著食鹽的增加，臭鱖魚(yú)的氣味略有減弱，蒜瓣?duì)钤鰪?qiáng)，咸味加重，腐味減弱，總體感官評(píng)分先增后減，并在1.0%～2.0%的添加量達(dá)到最佳感官評(píng)分。腌制期間，食鹽滲透到魚(yú)體，魚(yú)肌肉細(xì)胞脫水，促進(jìn)形成骨肉分離的蒜瓣肉。食鹽添加量過(guò)少，不利于蒜瓣肉的形成；添加量過(guò)多，魚(yú)肌肉嚴(yán)重脫水，魚(yú)肉變柴失去彈性，味道太咸，掩蓋了其他滋味，嚴(yán)重影響口感，而且鹽分過(guò)高也會(huì)一定程度上抑制優(yōu)勢(shì)菌的繁殖。

圖1 加鹽量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的影響Fig. 1 Effect of salt dosage on sensory score of stinky mandarin fish

2.2 根霉菌液接種量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的影響

根霉菌液接種量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的影響如圖2 所示。相比不添加根霉（接種量為0），少量接種根霉后，臭鱖魚(yú)感官評(píng)分顯著提高。根霉接種量為2.0%～8.0%時(shí)，臭鱖魚(yú)感官評(píng)分徘徊在6.0～7.5 分，屬于中等級(jí)別。當(dāng)接種量增加至10.0%時(shí)，臭鱖魚(yú)開(kāi)始出現(xiàn)明顯的惡心腐臭味，感官評(píng)分驟然下降至（4.3±0.2）分的不合格等級(jí)。即根霉菌液接種量較少（2.0%～6.0%）時(shí)，接種量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)分無(wú)顯著影響，考慮經(jīng)濟(jì)因素，根霉菌液以2%接種量為宜。

圖2 根霉菌液接種量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的影響Fig. 2 Effect of Rhizopus inoculation amount on sensory score of stinky mandarin fish

單純?nèi)樗峋l(fā)酵，發(fā)酵速度較慢，發(fā)酵8 d 后“臭”味仍不明顯，但添加根霉后，臭鱖魚(yú)的“臭”味變得顯著，即根霉有助于加速發(fā)酵，一定程度上提升產(chǎn)品風(fēng)味。但乳酸菌和根霉之間有一個(gè)協(xié)同發(fā)酵的比例，超出范疇，二者可能會(huì)產(chǎn)生拮抗和抑制作用[21]。因此，根霉添加量太大，繁殖速度過(guò)快，臭鱖魚(yú)的臭味就會(huì)變得過(guò)重，魚(yú)肉出現(xiàn)腐爛。

2.3 乳酸菌粉添加量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的影響

乳酸菌粉添加量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)分有顯著影響。如圖3 所示，添加量從1.0%增加至5.0%，臭鱖魚(yú)感官評(píng)分呈階梯式下降。添加量為1.0%和2.0%時(shí)，臭鱖魚(yú)具有發(fā)酵后的特殊酸臭味，肉質(zhì)嫩滑，骨肉分離，蒜瓣?duì)蠲黠@，口感略帶酸味，感官評(píng)分接近優(yōu)良；添加量增加至3.0%和4.0%時(shí)，臭鱖魚(yú)酸臭味加重，肉質(zhì)的嫩滑度下降，有蒜瓣?duì)畹幻黠@，酸味口感突出，感官評(píng)分下降；當(dāng)添加量5.0%時(shí)，臭鱖魚(yú)的酸味、酒精味沖鼻，肉質(zhì)變柴，酸腐味明顯。乳酸菌粉最佳添加量為1.0%～2.0%。

圖3 乳酸菌粉添加量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的影響Fig. 3 Effect of addition amount of lactic acid bacteria powder on sensory score of stinky mandarin fish

產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106 兼性厭氧，在有氧的環(huán)境下也能高質(zhì)量繁殖：一方面產(chǎn)生以乙偶姻為代表的具有發(fā)酵奶酪味的揮發(fā)性成分，使臭鱖魚(yú)的“臭”味更具層次感；另一方面高產(chǎn)的L-乳酸可賦予臭鱖魚(yú)柔和的酸味口感，同時(shí)形成抑制雜菌的酸性環(huán)境。然而乳酸菌的過(guò)度繁殖及乳酸蓄積過(guò)多，魚(yú)肉pH 值下降明顯，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集、變性，表現(xiàn)為肌肉持水性下降，保水性變差，魚(yú)肉嫩度下降，肉質(zhì)變柴。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的影響

發(fā)酵是臭鱖魚(yú)特征風(fēng)味逐漸成熟的過(guò)程，因此發(fā)酵時(shí)間是影響臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的一個(gè)重要指標(biāo)。發(fā)酵時(shí)間不夠，魚(yú)肉蛋白質(zhì)未能充分水解呈多肽和氨基酸，風(fēng)味前提物質(zhì)積累不足；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微生物繁殖過(guò)盛，魚(yú)肉又會(huì)腐爛變質(zhì)。如圖4 所示，發(fā)酵時(shí)間8～10 d 為宜。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on sensory score of stinky mandarin fish

2.5 臭鱖魚(yú)加工工藝優(yōu)化

根霉菌液接種量對(duì)臭鱖魚(yú)感官評(píng)價(jià)影響不顯著，直接固定根霉菌液接種量為2%，選取加鹽量、乳酸菌粉添加量、發(fā)酵時(shí)間3 個(gè)因素為自變量，感官評(píng)分為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3 因素3 水平、15 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素水平編碼如表2 所示，試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。

表2 因素和水平編碼值Tab. 2 Orthogonal test factors and levels

利用Design-Expert Version 10.0.7 中的響應(yīng)面設(shè)計(jì)法（RSM）對(duì)表3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，去除不顯著變量，得到自變量與臭鱖魚(yú)感官評(píng)分（Y）二次多項(xiàng)回歸模型為

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Tab. 3 Response surface design and experimental results

回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)（表4）表明，該回歸模型P<0.01，回歸方程模型達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.070>0.05，不顯著；該回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.817 0，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.928 3，說(shuō)明該模型的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差較小，因此該回歸方程模型能較好地對(duì)臭鱖魚(yú)加工工藝進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。影響臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的主次因素順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間>乳酸菌粉添加量>加鹽量。其中發(fā)酵時(shí)間（X3）達(dá)到極顯著水平（P<0.01），乳酸菌粉添加量（X2）達(dá)到顯著水平（P<0.05），加鹽量（X1）影響不顯著（P>0.05）。

表4 回歸方程模型方差分析Tab. 4 Variance analysis of regression equation model

臭鱖魚(yú)的最優(yōu)加工條件為加鹽量1.4%、輔料添加量0.5%、根霉菌液接種量2%、乳酸菌粉添加量1.4%、15 °C 發(fā)酵8 d。在該條件下，臭鱖魚(yú)感官評(píng)分的理論值可高達(dá)9.49 分。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的臭鱖魚(yú)氣味帶酸帶臭，氣味濃郁但不刺鼻，肉質(zhì)嫩滑，呈骨肉分離的蒜瓣?duì)睿诟邢涛哆m中，微酸，肉質(zhì)鮮美無(wú)明顯腐味?？傮w感官評(píng)分為（9.40± 0.42）分，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為0.95%。

2.6 臭鱖魚(yú)風(fēng)味剖面分析

采用風(fēng)味剖面檢驗(yàn)分析法對(duì)接種發(fā)酵臭鱖魚(yú)和對(duì)照組自然發(fā)酵臭鱖魚(yú)（加鹽量1.4%、輔料添加量0.5%、15 °C 發(fā)酵8 d）的風(fēng)味、滋味、口感進(jìn)行6 點(diǎn)評(píng)分，結(jié)果如圖5 所示。兩種方式得到的臭鱖魚(yú)風(fēng)味差異較大，對(duì)照組腐、臭、腥味顯著，而且尖銳刺鼻；接種發(fā)酵組臭味雖濃郁，但相對(duì)柔和，帶有酸味、臭味、香味，細(xì)聞具有明顯的層次感。滋味方面也有明顯區(qū)別，接種發(fā)酵組比對(duì)照組增加了酸味，產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106 繁殖產(chǎn)乳酸，以及微生物代謝酶對(duì)魚(yú)肉蛋白的水解作用，促進(jìn)了呈味氨基酸的釋放，酸味、甜味、鮮味、苦味的增加會(huì)削弱咸味和腥味，因此二者的咸味表現(xiàn)感與加鹽量并不完全一致[22]。接種發(fā)酵組的蒜瓣?duì)钚纬尚Ч裁黠@優(yōu)于對(duì)照組，這表明接種中國(guó)根霉12 和產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106 能有效促進(jìn)魚(yú)肉形成蒜瓣?duì)钊赓|(zhì)。

圖5 臭鱖魚(yú)風(fēng)味剖面檢驗(yàn)分析結(jié)果Fig. 5 Results of flavor profile inspection and analysis of stinky mandarin fish

3 結(jié)論

接種中國(guó)根霉12 和產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106 混合發(fā)酵制備臭鱖魚(yú)，可定向改善臭鱖魚(yú)風(fēng)味。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得出最優(yōu)加工工藝條件為加鹽量1.4%、根霉菌液接種量2%、乳酸菌粉添加量1.4%、15 °C 發(fā)酵8 d。此條件下得到的臭鱖魚(yú)感官評(píng)分為9.4，屬于優(yōu)良級(jí)別。相比臭味刺鼻的自然發(fā)酵臭鱖魚(yú)，接種發(fā)酵的臭鱖魚(yú)風(fēng)味和滋味上增加了酸味，更有利于蒜瓣?duì)钊赓|(zhì)的形成，酸臭味豐富濃郁而柔和、富有層次感。中國(guó)根霉12 和產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106可應(yīng)用于臭鱖魚(yú)發(fā)酵。