細(xì)胞衰老檢測(cè)指標(biāo)及衰老模型研究進(jìn)展

張凌云,劉 纓

(北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國(guó)北京 102488)

細(xì)胞衰老(cellular senescence,CS)是細(xì)胞增殖、分化能力和生理功能逐漸發(fā)生衰退的變化過(guò)程[1～2]。細(xì)胞衰老研究是衰老機(jī)制、抗衰老、抗癌[3]研究的重要內(nèi)容之一,而構(gòu)建細(xì)胞的衰老模型是研究細(xì)胞衰老必不可少的步驟。根據(jù)誘發(fā)因素的不同,細(xì)胞衰老可以劃分成應(yīng)激誘導(dǎo)早衰(stress-induced premature senescence,SIPS)、復(fù)制性衰老(replicative senescence,RS)[4～5]、癌基因誘導(dǎo)衰老(oncogene-induced senescence,OIS)。

衰老指標(biāo)對(duì)于驗(yàn)證所制備模型成功與否十分重要,指標(biāo)的選擇也同樣重要。目前,不同文獻(xiàn)中使用的衰老細(xì)胞模型和檢測(cè)指標(biāo)都不盡相同。不同情況下如何選用合適的模型和檢測(cè)指標(biāo)尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本文討論和分析了現(xiàn)有的一些細(xì)胞衰老模型的建立方法,列舉了常用的細(xì)胞衰老檢測(cè)指標(biāo)并總結(jié)了其選擇方法,以便為相關(guān)的研究提供參考。

1 檢測(cè)指標(biāo)

細(xì)胞衰老的特征包括細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞周期阻滯、氧化應(yīng)激水平和染色質(zhì)的改變。由于沒(méi)有單一的性狀可以獨(dú)自定義細(xì)胞衰老,所以體外衰老表型的確定往往需要多個(gè)特征同時(shí)驗(yàn)證,有文獻(xiàn)建議至少驗(yàn)證3個(gè)不同的特征[6]。具體的檢測(cè)指標(biāo)有基于這些特征的通用指標(biāo),如:衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(senescence-associated beta-galactosidase,SA-β-Gal)活性升高、細(xì)胞形態(tài)改變、衰老相關(guān)蛋白質(zhì)累積、細(xì)胞周期分布改變、DNA損傷灶產(chǎn)生[7]、衰老相關(guān)的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)[1,8]等;也有基于不同誘導(dǎo)劑以及細(xì)胞類(lèi)型的特異指標(biāo),如:造血祖細(xì)胞混合細(xì)胞集落形成單位(colony forming unitmix,CFU-mix)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、ATP的合成及線(xiàn)粒體的膜電位。

1.1 形態(tài)變化相關(guān)指標(biāo)

1.1.1 衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性

SA-β-Gal活性升高被一致認(rèn)為是評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老的生物學(xué)標(biāo)志。目前,絕大部分關(guān)于細(xì)胞衰老模型的文獻(xiàn)都有使用SA-β-Gal染色法對(duì)其活性進(jìn)行檢測(cè),只有少數(shù)例外[9]。這也是唯一可以將不同文獻(xiàn)中所建立的模型進(jìn)行對(duì)比的指標(biāo)。Dimri等[4]首次證明,該生物標(biāo)志物在生物體內(nèi)隨著細(xì)胞的衰老而逐漸積累增多。β-Gal是一種水解酶,其在衰老前細(xì)胞、靜止細(xì)胞和終末分化細(xì)胞中是缺乏的,只有在衰老細(xì)胞中才可以催化β-半乳糖苷水解為單糖[4,6,10]。在pH為6.0的條件下進(jìn)行β-Gal測(cè)定時(shí),只有處于衰老狀態(tài)的細(xì)胞才會(huì)出現(xiàn)由人工顯色底物X-Gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)分解產(chǎn)生的藍(lán)色染色沉淀物。該現(xiàn)象是由于內(nèi)源性溶酶體β-Gal特異性地在衰老細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)和積累,可以很容易并且可靠地在原位和體外被檢測(cè)到[4,11]。用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察并且計(jì)數(shù)時(shí),表達(dá)藍(lán)色的細(xì)胞即為β-Gal陽(yáng)性,細(xì)胞陽(yáng)性染色百分率可以表示群體衰老程度。

1.1.2 細(xì)胞形態(tài)變化

衰老細(xì)胞的形態(tài)特征是體積增大,生長(zhǎng)在固體表面時(shí)明顯扁平,細(xì)胞核增大且形狀不規(guī)則。這些特征觀察起來(lái)很方便,部分文獻(xiàn)選擇細(xì)胞形態(tài)作為細(xì)胞衰老的檢查指標(biāo)[12],但是沒(méi)有一個(gè)量化標(biāo)準(zhǔn)。McKenna等[13]根據(jù)細(xì)胞形態(tài)的特征變化,利用細(xì)胞核染料4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚(4＇,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)標(biāo)記核DNA,以生長(zhǎng)細(xì)胞扁平化時(shí)DNA相關(guān)的部分區(qū)域熒光強(qiáng)度與細(xì)胞核面積比值的下降,作為衰老的一個(gè)形態(tài)計(jì)量指標(biāo)。核纖層蛋白B1(lamin B1)是維持細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵,其減少導(dǎo)致核完整性和穩(wěn)定性下降,繼而導(dǎo)致其他核變化[6,14],這種減少可以通過(guò)成像或免疫印跡檢測(cè),從而指示體外衰老表型[6,15]。

1.1.3 衰老相關(guān)的分泌表型

衰老的發(fā)生經(jīng)常與持續(xù)性的DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response,DDR)有關(guān)[15],同時(shí)伴隨著細(xì)胞分泌功能增加,即衰老相關(guān)分泌表型(SASP)。SASP因子的種類(lèi)復(fù)雜多樣,主要有促炎因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子等[16]。復(fù)制性衰老與誘導(dǎo)型衰老有相類(lèi)似的表型,它們都會(huì)引起相關(guān)炎癥因子的釋放,出現(xiàn)SASP。促炎因子是SASP的重要組成部分之一,是衰老細(xì)胞的關(guān)鍵特征[17]。另外,白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-8在衰老細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),也是細(xì)胞衰老的重要指標(biāo)。IL-8是C-X-C趨化因子家族的一員,在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[17]。

1.2 細(xì)胞周期相關(guān)指標(biāo)

1.2.1 衰老相關(guān)細(xì)胞周期蛋白

周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制物(cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的重要信號(hào)分子,其中最具代表性的是P16、P21和P53[17]。P21、P53、P16的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞衰老發(fā)生[18～19]。細(xì)胞衰老的一個(gè)主要特征是不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯,這主要是由于P16/RB和P53/P21通路的調(diào)節(jié),這兩條通路的調(diào)節(jié)和變化也是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的兩種理論信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[20]。P16INK4a、P21-Cip1是認(rèn)可度較高的衰老相關(guān)標(biāo)志物。P21能夠普遍結(jié)合進(jìn)而阻礙各類(lèi)周期蛋白依賴(lài)性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)復(fù)合物的生成,降低RB的磷酸化水平,抑制E2F的釋放,阻礙DNA的生成,進(jìn)而致使細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入S期,只能停滯在G1期,最終誘發(fā)細(xì)胞衰老[21]。p53基因是一種與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、衰老和DNA修復(fù)相關(guān)的重要基因。有研究指出,降低p53基因的表達(dá)水平可以減少皮膚細(xì)胞凋亡,并且能夠一定程度緩解皮膚衰老[22～23]。p53同時(shí)也是一種抑癌基因,其編碼的蛋白質(zhì)P53參與細(xì)胞對(duì)DNA損傷的應(yīng)答,具有促進(jìn)或抑制衰老的雙重作用[4,24]。

1.2.2 細(xì)胞周期分布

細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次分裂完成時(shí)開(kāi)始到下一次分裂完成時(shí)為止的過(guò)程。細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞衰老,G1/G0期的永久性細(xì)胞周期停滯是細(xì)胞衰老的特征之一,此種停滯由每個(gè)細(xì)胞的DNA數(shù)量決定。相較于年輕細(xì)胞,衰老細(xì)胞中處于S期的細(xì)胞進(jìn)一步減少,G1/G0比值下降,G2/M比值增加[25]。因此,細(xì)胞周期各期的分布情況也可用于監(jiān)測(cè)衰老,其常采用流式細(xì)胞術(shù)或碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色法進(jìn)行分析。

1.3 細(xì)胞抗氧化能力檢測(cè)指標(biāo)

自由基所導(dǎo)致的氧化損傷是細(xì)胞衰老的幾大學(xué)說(shuō)之一。機(jī)體的抗氧化能力與衰老密切相關(guān),當(dāng)機(jī)體受到壓力刺激或抗氧化能力減弱時(shí),過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在體內(nèi)堆積,導(dǎo)致氧化損傷,從而引發(fā)衰老及相關(guān)疾病[26]。衰老往往伴隨著抗氧化能力的下降,因此抗氧化因子的表達(dá)和活力也是常用的衰老指標(biāo)。如:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是清除ROS的關(guān)鍵酶,可以將毒性超氧化物轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和水[20]。SOD是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分,也是機(jī)體抗氧化能力的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。

長(zhǎng)壽基因Sirt1(sirtuin1)表達(dá)的去乙?；缚梢种苝53基因表達(dá),延緩細(xì)胞的凋亡和衰老[27～28]。該因子在線(xiàn)粒體調(diào)控及清除ROS的過(guò)程中也起到關(guān)鍵作用,可通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,進(jìn)而延緩細(xì)胞的衰老進(jìn)程[19]。NF-κB是一種和衰老有密切關(guān)聯(lián)的調(diào)控因子,其過(guò)表達(dá)可以引起所培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)衰老表型[19]。丙二醛(malondialdehyde,MDA)是膜脂過(guò)氧化的重要產(chǎn)物之一,其水平能夠反映出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,從而間接說(shuō)明細(xì)胞受到傷害的程度。由于ROS的產(chǎn)生和線(xiàn)粒體有關(guān),所以線(xiàn)粒體膜電位水平也能夠在一定程度上說(shuō)明機(jī)體的氧化損傷程度[29]。因此,NF-κB、MDA和線(xiàn)粒體膜電位均可作為機(jī)體抗氧化能力降低的間接檢測(cè)指標(biāo)。

1.4 染色質(zhì)改變相關(guān)指標(biāo)

1.4.1 DNA損傷灶

除了顯著的形態(tài)學(xué)改變、SA-β-Gal活性升高,與衰老相關(guān)的異染色質(zhì)灶(senescence-associated heterochromatin foci,SAHF)是衰老細(xì)胞的另一個(gè)典型特征[15],組蛋白H3第9位賴(lài)氨酸三甲基化(H3 lysine 9 trimethylation,H3K9me3)、異染色質(zhì)蛋白 1γ(heterochromatin associated protein 1γ,HP1γ)是其標(biāo)志蛋白質(zhì)[30～31]。DNA是組成染色質(zhì)的主要成分。DNA損傷中最嚴(yán)重的形式為DNA雙鏈斷裂,其應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記物是γ-H2AX(phosphorylated histone H2AX)。

1.4.2 DNA甲基化

部分DNA甲基化數(shù)據(jù)已被開(kāi)發(fā)為衰老的生物標(biāo)志物,即“表觀遺傳時(shí)鐘”,其已被廣泛用于識(shí)別健康和疾病(包括認(rèn)知功能衰退和其他神經(jīng)退行性變性疾病)的實(shí)際年齡與生物年齡之間的差異,是目前最具前景的衰老生物標(biāo)志物之一[32]。DNA甲基化時(shí)鐘包括特定的一組由嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸組成的DNA甲基化位點(diǎn),其甲基化狀態(tài)可用于測(cè)量主觀年齡,即生物衰老程度。這些時(shí)鐘被認(rèn)為是人類(lèi)和其他脊椎動(dòng)物按時(shí)間順序年齡的準(zhǔn)確生物標(biāo)記,可以量化生物衰老的速度[33]。

近期,Liu等[34]首次從多角度對(duì)11個(gè)當(dāng)前的DNA甲基化時(shí)鐘進(jìn)行了比對(duì)分析,并建立了新的組合式DNA甲基化時(shí)鐘“meta-clock”,其在反映衰老特征方面更為高效,而且可以區(qū)別腫瘤與正常組織,可以更好地進(jìn)行全因死亡預(yù)測(cè)。這類(lèi)組合式時(shí)鐘的探索,或許將有利于開(kāi)發(fā)出更有效可靠的衰老生物標(biāo)志物用于臨床及轉(zhuǎn)化研究。

1.5 特異指標(biāo)的選擇

1.5.1 和細(xì)胞的類(lèi)型有關(guān)

衰老指標(biāo)的選擇和細(xì)胞類(lèi)型相關(guān),因?yàn)椴煌?xì)胞有其特異的衰老表現(xiàn)。例如,干細(xì)胞的自我更新能力會(huì)隨著機(jī)體年齡的增加而不斷下降,部分研究者會(huì)利用細(xì)胞增殖能力檢測(cè)方法,如CCK8、Ki67免疫熒光染色[35～36],輔助干細(xì)胞衰老鑒定。當(dāng)然,增殖能力不僅僅是干細(xì)胞才有,一些增殖能力較強(qiáng)的細(xì)胞模型在衰老鑒定的時(shí)候也會(huì)用到增殖檢測(cè),如大鼠髓核細(xì)胞(nucleus pulposus,NP)[35]、乳腺癌細(xì)胞[36]。對(duì)于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)和祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cell,HPC),集落形成單位(colony-forming unit,CFU)是評(píng)價(jià)其自我更新能力以及多向分化潛能的重要指標(biāo)[37～38],有研究選用CFU-mix作為多向HSC的衰老評(píng)價(jià)指標(biāo)[38]。堿性磷酸酶(ALP)高表達(dá)是牙囊細(xì)胞(dental follicle cell,DFC)早期分化的重要指標(biāo)[39],也可作為其衰老檢測(cè)指標(biāo)。纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)是一類(lèi)有效的纖溶抑制劑和血栓形成的介質(zhì),其表達(dá)可以作為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)衰老的標(biāo)志物[40]。另外,相關(guān)研究在對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblast,HDF)進(jìn)行研究時(shí),將Ⅰ型膠原蛋白(collagen typeⅠ,Col-Ⅰ)和基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)納入檢測(cè)指標(biāo)[9]。表1給出了部分衰老指標(biāo)在不同細(xì)胞相關(guān)研究中的選用情況[9,30,35,37,39～41]。

表1 衰老指標(biāo)在不同細(xì)胞中的應(yīng)用Table 1 Hallmarks of senescence applied for different cells

1.5.2 和誘導(dǎo)劑的種類(lèi)有關(guān)

衰老指標(biāo)的選擇還和誘導(dǎo)劑的種類(lèi)有關(guān)。例如:使用H2O2作為誘導(dǎo)劑的時(shí)候,由于H2O2通過(guò)氧化應(yīng)激的方式,最終引起DNA的損傷,激活P53/P21信號(hào)通路,所以研究人員往往會(huì)將DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX或者P21等衰老相關(guān)蛋白質(zhì)加入檢測(cè)指標(biāo)[42～43];選用血管緊張素Ⅱ(angio-tensinⅡ,AngⅡ)作為誘導(dǎo)劑對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞(human vascular smooth muscle cell,hVSMC)進(jìn)行研究時(shí),因AngⅡ可以通過(guò)端粒依賴(lài)性和非依賴(lài)性途徑介導(dǎo)DNA氧化損傷,從而加速血管平滑肌細(xì)胞的衰老,所以研究人員將DNA損傷、端粒DNA長(zhǎng)度納入其檢測(cè)指標(biāo)[44]。AngⅡ還可以刺激NADPH氧化酶1(NADPH oxidase 1,Nox1)激活,并通過(guò)降低過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α)活性、增加線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激等途徑,介導(dǎo)線(xiàn)粒體功能障礙,導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的衰老,因此,Tsai等[29]將ATP的合成及線(xiàn)粒體的膜電位也用于衰老判定。

1.5.3 和研究目的有關(guān)

衰老指標(biāo)的選擇也和研究目的有關(guān)。自噬途徑具有消除受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器進(jìn)而延長(zhǎng)壽命的功能,衰老的細(xì)胞往往伴隨自噬活性的下降。有研究發(fā)現(xiàn),自噬通過(guò)消除損傷細(xì)胞器、減輕氧化應(yīng)激、促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)等途徑,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,避免其死亡[45]。Wang等[46]在研究蟲(chóng)草素對(duì)衰老的抑制作用與自噬途徑的相關(guān)性中,就將細(xì)胞自噬水平相關(guān)蛋白質(zhì)P62、微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)納入檢測(cè)指標(biāo)。

2 細(xì)胞衰老模型

無(wú)論是通用或者非通用檢測(cè)指標(biāo)的選擇,其目的都是對(duì)細(xì)胞衰老進(jìn)行更深入的研究。人為構(gòu)建的細(xì)胞衰老模型根據(jù)誘發(fā)因素的不同,可以劃分成應(yīng)激誘導(dǎo)早衰、復(fù)制性衰老以及癌基因誘導(dǎo)衰老。

2.1 復(fù)制型

復(fù)制性衰老是端粒在每次分裂結(jié)束時(shí)逐漸侵蝕的結(jié)果,直至細(xì)胞達(dá)到端粒功能障礙的狀態(tài)(稱(chēng)為Hayflick的極限)[47]。復(fù)制性衰老模型是基于器官老化內(nèi)在機(jī)制的常用實(shí)驗(yàn)性衰老模型[48]。復(fù)制性衰老模型的構(gòu)建一般不使用藥物,這避免了與后期實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行藥物處理時(shí)發(fā)生沖突,因此模型適用范圍更廣。但是,其造模往往需要多次反復(fù)傳代,耗費(fèi)的時(shí)間和人力較大[49]。

當(dāng)前,多種細(xì)胞被用于復(fù)制性衰老研究。例如:王曉睿[49]對(duì)鼠腎小管原代上皮細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),13 d后衰老比率超過(guò)95%;Han等[50]研究了自噬在復(fù)制衰老過(guò)程中的可能作用,發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)自噬水平降低可能是人類(lèi)包皮成纖維細(xì)胞Hs68復(fù)制性衰老的機(jī)制;Delfarah等[51]基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectroscopy,LC-MS)的代謝組學(xué),研究了衰老的原代人乳腺上皮細(xì)胞(human mammary epithelial cell,HMEC),發(fā)現(xiàn)抑制核苷酸合成促進(jìn)HMEC的復(fù)制衰老;Gao等[52]利用人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(human embryonic lung diploid fibroblasts)2BS和人胚肺成纖維細(xì)胞(human fetal lung fibroblasts)WI-38證明,E2F1介導(dǎo)復(fù)制衰老過(guò)程中POLD1[polymerase(DNA)delta 1]的下調(diào)。

2.2 誘導(dǎo)型

誘導(dǎo)型衰老模型(SIPS)與復(fù)制型不同,其構(gòu)建有H2O2、輻射、高糖、藥物等多種誘導(dǎo)方式,其中H2O2是最常用的誘導(dǎo)劑,通?？梢栽趲滋熘畠?nèi)完成衰老模型的構(gòu)建,并且對(duì)多種細(xì)胞都有效[49]。

2.2.1 H2O2誘導(dǎo)

氧化損傷是現(xiàn)今較為常見(jiàn)的細(xì)胞衰老模型構(gòu)建原理。H2O2通過(guò)氧化應(yīng)激的方式,最終引起DNA的損傷,激活P53/P21信號(hào)通路[53]。H2O2誘導(dǎo)條件基于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮图?xì)胞類(lèi)型的不同而調(diào)整。Marazita等[43]建立了H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞衰老模型,其將細(xì)胞暴露于150 mmol/L H2O290 min,維持培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后,陽(yáng)染率有80%。Lim等[54]用1 mmol/L H2O2處理人骨骼肌成肌細(xì)胞(CHQ5B)30 min,探討富托三烯酚組分(tocotrienol-rich fraction,TRF)對(duì)其衰老的調(diào)控作用。蘇慧麗等[55]選擇人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞系2BS制備衰老模型,200 μmol/L H2O2處理2 h后,培養(yǎng)5 d,陽(yáng)染率接近95%。

三丁基過(guò)氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)也被用作制備細(xì)胞氧化損傷模型的誘導(dǎo)劑。Zhou等[38]報(bào)道,t-BHP可致小鼠造血干細(xì)胞(HSC)衰老,其誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后細(xì)胞的衰老陽(yáng)染率達(dá)到57.92%±4.24%。

2.2.2 輻射誘導(dǎo)

輻射誘導(dǎo)對(duì)環(huán)境的要求較高,并且需要更加精密的分析儀器[49]。衰老的主流觀點(diǎn)認(rèn)為,DNA損傷積累最終導(dǎo)致機(jī)體衰老,而電離輻射可以使DNA的雙鏈斷裂繼而致使DNA損傷。

Dalle Pezze等[56]設(shè)計(jì)了一個(gè)數(shù)學(xué)模型來(lái)模擬20 Gy X射線(xiàn)照射5 min誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的動(dòng)態(tài)過(guò)程。模型整合了細(xì)胞老化的5個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因素:胰島素受體、FoxO3a(forkhead box protein O 3a)、DDR、ROS和線(xiàn)粒體功能。其優(yōu)點(diǎn)是可以隨時(shí)對(duì)模型進(jìn)行調(diào)整,且快速;缺點(diǎn)是對(duì)于未弄清楚機(jī)制的衰老調(diào)節(jié)通路,無(wú)法復(fù)制進(jìn)模型中。Schick等[57]聯(lián)合應(yīng)用放射療法(radiotherapy,RT)與曲美替尼,探索曲美替尼使RAS/RAF突變黑色素瘤細(xì)胞放射增敏的機(jī)制。McRobb等[41]用20 Gy劑量的輻射誘導(dǎo)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain-derived endothelial cells.3,bEnd.3)衰老,發(fā)現(xiàn)第6天時(shí)陽(yáng)染率達(dá)到65%±8%。此外,也有文獻(xiàn)使用311 nm紫外線(xiàn)(UVB)誘導(dǎo)HDF細(xì)胞衰老,結(jié)果顯示細(xì)胞陽(yáng)染率可達(dá)到90%左右[58]。

2.2.3 高糖誘導(dǎo)

在誘導(dǎo)細(xì)胞衰老中,D-半乳糖是被使用得較多的糖類(lèi)誘導(dǎo)劑[9]。D-半乳糖在正常情況下可經(jīng)肝臟代謝成葡萄糖,但在較高濃度時(shí),D-半乳糖在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇[42],后者的積累導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓變化、細(xì)胞腫脹、膜脂損傷等衰老表現(xiàn)。D-半乳糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷可以觸發(fā)ROS的生成[59],導(dǎo)致腦神經(jīng)退化。此外,D-半乳糖可以誘發(fā)蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng),最終形成晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product,AGE)[60],AGE聚集是許多年齡相關(guān)退行性疾病的常見(jiàn)特征[59]。目前,高糖與衰老之間的關(guān)系仍未完全闡明。

除了D-半乳糖,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、葡萄糖等也可用于誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。Hou等[35]用濃度為0.2 mol/L的葡萄糖誘導(dǎo)大鼠髓核(NP)細(xì)胞衰老。劉印康等[9]用脂多糖誘導(dǎo)HDF細(xì)胞衰老。最近,缺乏核型營(yíng)養(yǎng)不良聚糖(β-DG)使小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)獲得衰老特征被證實(shí)[61]。除此之外,人們?cè)谔悄虿C(jī)制研究中也發(fā)現(xiàn),通過(guò)上調(diào)血小板反應(yīng)蛋白CD47依賴(lài)性信號(hào)通路可以妨礙血管生成并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老[62]。有報(bào)道顯示,核糖也可用來(lái)誘導(dǎo)構(gòu)建衰老相關(guān)疾病模型[63～64]。

2.2.4 其他藥物誘導(dǎo)

Herbert等[44]用AngⅡ誘導(dǎo)hVSMC的衰老,驗(yàn)證了AngⅡ通過(guò)ROS介導(dǎo)的DNA損傷致使hVSMC衰老的假說(shuō)。Tsai等[29]則在該模型的基礎(chǔ)上對(duì)衰老的機(jī)制開(kāi)展了進(jìn)一步研究。

由于研究細(xì)胞衰老對(duì)抗腫瘤具有積極的作用,所以部分研究人員致力于抗腫瘤藥物在細(xì)胞衰老中的作用機(jī)制研究。Ota等[40]用抗腫瘤藥物誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞衰老,并發(fā)現(xiàn)西羅莫司和依維莫司誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老是Sirt1依賴(lài)性的,而紫杉醇通過(guò)Sirt1非依賴(lài)性途徑發(fā)揮作用。Demaria等[65]發(fā)現(xiàn),阿霉素(doxorubicin,Doxo)等4種常用的化療藥物可以誘導(dǎo)正常非癌組織中衰老細(xì)胞的持續(xù)存在。Liu等[66]發(fā)現(xiàn),異染色質(zhì)組織在Doxo或H2O2誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的早期階段被激發(fā)。另有研究表明,免疫抑制劑及抗癌藥物雷帕霉素可以預(yù)防細(xì)胞和組織的衰老[37],由此其被視為潛在的抗衰老藥物受到進(jìn)一步關(guān)注。

2.3 癌基因誘導(dǎo)衰老

除了復(fù)制性衰老、應(yīng)激性早衰,癌基因誘導(dǎo)衰老也是細(xì)胞衰老的一大類(lèi)型。癌基因通過(guò)調(diào)節(jié)某些基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[67]。Paget等[36]通過(guò)敲除PKCi基因研究了其對(duì)乳腺癌細(xì)胞衰老的抑制作用。Nojima等[68]通過(guò)敲除SPT6基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。Crochemore等[69]通過(guò)敲除Cockayne綜合征(Cockayne syndrome,CS)相關(guān)基因CSB誘導(dǎo)p21依賴(lài)性早衰,揭示了CSB的缺失是基于p21的復(fù)制性衰老的已知最早的觸發(fā)因素。

3 總結(jié)

復(fù)制性衰老模型不使用藥物,避免了藥物之間的相互作用,更符合真實(shí)衰老狀態(tài)。但是其缺點(diǎn)也很明顯,即模型制作耗時(shí)長(zhǎng),在實(shí)驗(yàn)中會(huì)消耗更多的人力以及物力。誘導(dǎo)型衰老模型則相反,造模時(shí)間稍短,一般在5～8 d即可造模成功。但是其缺點(diǎn)也不容忽視,如誘導(dǎo)劑的使用對(duì)于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)可能會(huì)有未知的影響。另外,就不同誘導(dǎo)劑造模成功率來(lái)看,H2O2能達(dá)到一個(gè)較高的衰老率(平均80%以上),糖類(lèi)較低,其他誘導(dǎo)劑則參差不齊。就輻射誘導(dǎo)而言,其對(duì)所需儀器的要求較高,且誘導(dǎo)方向的不確定性較大。而無(wú)論是藥物誘導(dǎo)還是輻射誘導(dǎo)或者是基因調(diào)控誘導(dǎo),都會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一種損傷性的影響。因?yàn)檫@種損傷造成的快速衰老現(xiàn)象在細(xì)胞的自然衰老過(guò)程中一般不會(huì)出現(xiàn)或者出現(xiàn)較少,所以誘導(dǎo)型的衰老模型和自然衰老模型可能仍然存在一定的差異。如果能夠在制作模型的時(shí)候和自然衰老模型進(jìn)行實(shí)時(shí)比較,或許能校準(zhǔn)這種可能存在的差異。

細(xì)胞衰老模型是否成功建立最終還要依靠檢測(cè)指標(biāo)證實(shí)。檢測(cè)指標(biāo)的選擇不僅限于衰老標(biāo)志物,還和所選用的細(xì)胞類(lèi)型、誘導(dǎo)劑的種類(lèi)以及實(shí)驗(yàn)最終的研究目的有關(guān)。選擇適當(dāng)?shù)哪Ｐ秃蜋z測(cè)指標(biāo),是正確分析和評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提。對(duì)衰老檢測(cè)指標(biāo)和細(xì)胞模型的研究將進(jìn)一步為相關(guān)的科學(xué)研究提供材料和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

致謝:十分感謝實(shí)驗(yàn)室的係夢(mèng)琪師姐給予文字部分的指導(dǎo)并且協(xié)助完成論文修改工作。