麻黃-大黃藥對抑制肺泡巨噬細(xì)胞M1極化防治急性肺損傷的作用機制

王 卓，閆曙光，惠 毅，史 捷，李京濤

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 1.附屬醫(yī)院呼吸科，陜西 咸陽 712000；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046；3. 附屬醫(yī)院感染科，陜西 咸陽 712000)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由多種因素誘發(fā)肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤和活化、釋放過量炎癥因子，形成炎癥因子風(fēng)暴，進而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞，造成肺組織通/換氣功能障礙的危重癥[1]。在ALI的發(fā)病過程中，肺泡巨噬細(xì)胞的浸潤和活化貫穿始終，其中以M1經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classical activated macrophage，M1)為主要活化表型[2]。巨噬細(xì)胞根據(jù)環(huán)境刺激反應(yīng)的不同，可被激活為經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophages，M1)和替代激活的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages，M2)這被稱為巨噬細(xì)胞的M1/M2型極化。在ALI的發(fā)病進程中，隨著巨噬細(xì)胞的M1極化，細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、p38分裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK)等促炎信號通路被激活，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放過量促炎因子，隨之誘發(fā)炎癥“瀑布”樣級聯(lián)反應(yīng)，在消滅入侵者的同時使肺組織遭受炎性損害[3]。因此，抑制肺泡巨噬細(xì)胞的M1極化是防治ALI的重要策略。

肺腸合治是中醫(yī)藥治療ALI的臨床常用治法，麻黃-大黃(Mahung-Dahuang,MD)是體現(xiàn)肺腸合治的主要藥對，多個以MD為核心藥物的方藥被臨床和實驗證實對ALI療效確切，同時MD也是治療新冠肺炎的化濕敗毒方、連花清瘟膠囊等方藥中的核心藥物[4-6]。肺泡巨噬細(xì)胞的激活和M1極化是導(dǎo)致ALI的重要原因，那么MD藥對是否能干預(yù)肺泡巨噬細(xì)胞的激活和M1極化，其作用機制是什么，尚不清楚。故本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)腹腔注射制備大鼠ALI動物模型，觀察MD藥對肺泡巨噬細(xì)胞激活和M1極化的影響，并探討其對肺泡巨噬細(xì)胞M1極化中的經(jīng)典炎癥通路NF-κB、p38MAPK的影響，揭示其抑制炎癥反應(yīng)，防治ALI的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司。合格證號：SCXK(川)2020-030。

1.2 藥物與試劑地塞米松注射液(重慶市先鋒動物藥業(yè)有限公司，批號20200902)；LPS(批號065M8209V)購自Sigma-Aldrich 公司；NF-κBp65(批號AF8129)，p-NF-κBp65(批號AF2006)，β-肌動蛋白(β-actin，批號AF1627)，F(xiàn)4/80抗體(批號AF3481)購自Affinity Biosciences公司；CD80抗體(sc-376012)購自Santa Cruz公司；白細(xì)胞介素-6(Interleukin- 6，IL-6)(批號#12912)、phospho-p38MAPK(批號#4511T)、p38MAPK(批號#9212)抗體購自Cell Signaling Teachnology 公司；趨化因子受體-2(C-C motif chemokine receptor 2，CCR2)(批號DF2711)，趨化因子配體-2(C-C motif chemokine ligand 2，CCL2)(批號BF0556)抗體購自affinity公司；熒光FITC標(biāo)記IgG(批號BA1101)、熒光Cy3標(biāo)記IgG(批號BA1032)購自武漢博士德生物工程有限公司；APC抗小鼠F4/80抗體(批號123116)、FITC抗小鼠CD80抗體(批號104705)購自Biolegend公司。

1.3 儀器全自動高壓滅菌器(日本三洋公司)；RM 2016病理切片機(德國Leica公司)；JK-6組織攤烤片機(武漢俊杰公司)；JT-12J脫水機(武漢俊杰公司)；HI650離心機(湖南湘儀實驗室儀器有限公司)；C2500-R-230V微型高速離心機(美國Labnet公司)；DYCZ-40電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)；ECLIPSE Ts2倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；cytoFLEX流式細(xì)胞儀(Beckman coulter)；EDC-810實時熒光定量PCR系統(tǒng)(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)。

1.4 藥物的制備大黃(批號20120030)、麻黃(批號20020037)免煎顆粒購于四川新綠色科技發(fā)展有限公司，按照(麻黃9 g，大黃12 g)為成人每次給藥劑量，動物給藥劑量按成人-大鼠體重?fù)Q算，成人按60 kg體質(zhì)量計算，確定大鼠的等效劑量為2.2 g·kg-1·次，MD藥對的低、中、高劑量組對應(yīng)的劑量分別為2.2、4.4和8.8 g·kg-1，藥物制成混懸液后應(yīng)用。

1.5 大鼠急性肺損傷模型的制備與分組、給藥60只Waster大鼠分為正常對照組(NC)、模型組(MC)、MD高(MD-H)、中(MD-M)、低劑量組(MD-L)、地塞米松組(DXMS)，除正常對照組外，其余各組大鼠采用LPS 10 mg·kg-1腹腔注射制備大鼠急性肺損傷(ALI)模型[7]，造模后立即給予MD不同劑量灌胃治療，每8 h 1次，連續(xù)3次，正常對照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，陽性藥對照組給予DXMS 5 mg·kg-1。

1.6 指標(biāo)的檢測

1.6.1病理組織學(xué) 取肺組織固定于4%多聚甲醛，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，石蠟切片(3～4 μm)，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水；按照試劑盒說明書步驟進行蘇木精-伊紅染液染色，光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.6.2免疫組織化學(xué) 取肺組織石蠟切片，脫蠟，乙醇梯度復(fù)水；枸櫞酸緩沖液加熱抗原修復(fù)；3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清室溫封閉，加入F4/80(1 ∶100)一抗，4 ℃濕盒中孵育過夜，加HRP標(biāo)記的二抗，DAB顯色，顯微鏡下觀察，陽性信號為棕黃色或棕褐色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，脫水、封片，顯微鏡下采集圖片。

1.6.3免疫熒光雙標(biāo) 取肺組織石蠟切片，脫蠟，乙醇梯度復(fù)水。枸櫞酸緩沖液加熱抗原修復(fù)。一抗F4/80(1 ∶100)，CD80(1 ∶50)于4 ℃濕盒中避光孵育15 h，熒光二抗染色(紅色)。血清封閉后，一抗CD80(1 ∶100)，IL-6(1 ∶50)于4 ℃濕盒中避光孵育15 h，熒光二抗染色(綠色)，復(fù)染核，封片，于顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6.4流式細(xì)胞術(shù) 取肺組織剪碎，加入0.5%的膠原酶和0.25%的胰酶溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育2～3 h，將肺組織懸液過濾，離心，清洗、重懸得到細(xì)胞，收集細(xì)胞，計數(shù)，分別加入F4/80和CD80，4 ℃避光孵育30 min，1 500 r·min-1離心5 min，避光孵育50 min；加入工作液，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.6.5qRT-PCR 取肺組織約100 mg，加入組織裂解液制成勻漿，TRIzol 法提取總RNA，并測定純度和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA。進行Real-time PCR反應(yīng)，設(shè)定反應(yīng)體系為20 μL，PCR擴增程序：90 ℃循環(huán)預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火延伸34 s，共設(shè)定40個循環(huán)。相對定量法計算各指標(biāo)mRNA的2-△△Ct值。引物序列由北京擎科生物有限公司合成，見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences

1.6.6Western blot 肺組織樣品加入裂解液勻漿，RIPA緩沖液中溶解30 min。測蛋白濃度，蛋白上樣40 μg，依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入p38MAPK(1 ∶1 000)、p-p38MAPK(1 ∶1 000)、p65(1 ∶1 000)、p-p65(1 ∶1 000)、CCR2(1 ∶1 000)、CCL2(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶500)特異性抗體在4 ℃下孵育過夜。PBST洗滌后，HRP標(biāo)記二抗(1 ∶5 000)，37 ℃搖床孵育2 h，顯影并掃描膠片。用ImageJ凝膠分析軟件定量條帶強度，以β-actin為內(nèi)參計算蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)檢測如Fig 1所示，正常對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，肺泡周圍間隙無炎細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡塌陷，肺間質(zhì)增厚，間質(zhì)內(nèi)可見大量炎細(xì)胞浸潤，氣道狹窄并伴有出血；MD高、中劑量和DXMS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯改善，肺間質(zhì)增厚與水腫減輕，氣道出血與炎細(xì)胞浸潤減少，肺泡結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)，MD低劑量組大鼠肺組織仍可見炎細(xì)胞浸潤與氣道出血。

Fig 1 Lung tissues of rats in each group observed by HE staining(400×)

2.2 肺組織巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80表達(dá)免疫組化結(jié)果如Fig 2所示，正常對照組大鼠肺組織可見個別F4/80陽性(棕色)肺泡巨噬細(xì)胞，模型組大鼠肺組織F4/80陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多，說明由于LPS的刺激，肺泡巨噬細(xì)胞聚集并活化，進而釋放炎癥介質(zhì)，加重了肺組織的炎癥損傷；MD高、中劑量和DXMS組大鼠肺組織F4/80陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少，MD低劑量組仍可見明顯的肺泡巨噬細(xì)胞陽性表達(dá)。說明MD高、中劑量藥物能抑制肺泡巨噬細(xì)胞的聚集和活化，從而減輕炎癥反應(yīng)。

Fig 2 Changes in expression of macrophage surface marker F4/80 in lung tissues of rats in each group (400×)

2.3 肺組織巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物F4/80和M1巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD80的表達(dá)免疫熒光雙標(biāo)測結(jié)果如Fig 3所示，正常對照組大鼠肺組織可見個別F4/80陽性(紅色)和CD80陽性(綠色)肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)，且部分CD80與F4/80共定位，模型組大鼠肺組織F4/80陽性和CD80陽性肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)目增多，熒光表達(dá)增強，與F4/80共定位的CD80陽性肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯增多，表明在急性肺損傷發(fā)生時，LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞量活化，同時肺泡巨噬細(xì)胞向M1型極化，呈現(xiàn)促炎表型；MD高、中劑量和DXMS組大鼠肺組織F4/80與CD80陽性肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)目同步減少，熒光表達(dá)減弱，MD低劑量組仍可見明顯的F4/80與CD80陽性肺泡巨噬細(xì)胞的共表達(dá)，說明MD高、中劑量藥物能抑制肺泡巨噬細(xì)胞的活化同時抑制其向促炎表型轉(zhuǎn)化。

Fig 3 Expression changes of macrophage surface marker F4/80 (red) and M1 macrophage surface marker CD80 (green) in lung tissues of rats in each group (400×)

2.4 肺組織M1巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物CD80和炎癥因子IL-6的表達(dá)免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果如Fig 4所示，正常對照組大鼠肺組織可見CD80陽性肺泡巨噬細(xì)胞(紅色)和IL-6(綠色)少量表達(dá)，模型組大鼠肺組織CD80陽性肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)目增多，熒光表達(dá)增強，同時IL-6熒光表達(dá)也明顯增強，且部分IL-6和CD80呈共表達(dá)，表明在急性肺損傷發(fā)生時，肺泡巨噬細(xì)胞活化后激活并釋放促炎因子IL-6，加重炎癥反應(yīng)，造成組織損傷；MD高、中劑量組和DXMS組大鼠肺組織與CD80陽性肺泡巨噬細(xì)胞和IL-6的表達(dá)同步減少，MD低劑量組仍可見明顯的CD80陽性肺泡巨噬細(xì)胞和IL-6的共表達(dá)，說明MD高、中劑量藥物能抑制M1肺泡巨噬細(xì)胞激活并釋放炎癥因子IL-6，從而減輕炎癥反應(yīng)，緩解肺損傷。

Fig 4 Expression changes of M1 macrophage surface marker CD80 (red) and inflammatory factor IL-6 (green) in lung tissues of rats in each group (400×)

2.5 肺組織F4/80標(biāo)記的肺泡巨噬細(xì)胞和CD80標(biāo)記的M1肺泡巨噬細(xì)胞百分比流式細(xì)胞檢測結(jié)果如Fig 5所示，與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織F4/80標(biāo)記的肺泡巨噬細(xì)胞百分比和CD80標(biāo)記的M1肺泡巨噬細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，不同劑量的MD藥對能明顯降低ALI大鼠肺組織F4/80標(biāo)記的肺泡巨噬細(xì)胞百分比和CD80標(biāo)記的M1肺泡巨噬細(xì)胞百分比(P<0.01)，該結(jié)果進一步證實，MD藥對能抑制肺泡巨噬細(xì)胞活化，其作用與抑制肺泡巨噬細(xì)胞M1極化相關(guān)。

2.6 肺組織炎癥因子IL-6、一氧化氮合酶(INOS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA相對表達(dá)qRT-PCR結(jié)果如Fig 6所示，與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織炎癥因子IL-6、INOS、TNF-α mRNA相對表達(dá)水平升高(P<0.01)；與模型組比較，MD藥對各組藥物能明顯降低ALI大鼠肺組織IL-6、INOS、TNF-α mRNA相對表達(dá)水平(P<0.01)，且與給藥劑量呈正相關(guān)。

Fig 6 mRNA expression of IL-6， INOS， TNF-α in lung tissues of rats in each group n=6 )

2.7 肺組織中CCR2、CCL2、p-NF-κBp65、NF-κBp65、p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果如Fig 7所示，與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織CCR2、CCL2蛋白相對表達(dá)水平升高，p-NF-κBp65/NF-κBp65，p-p38MAPK/p38MAPK比值升高(P<0.01)；與模型組比較，MD藥對各組藥物能明顯降低ALI大鼠肺組織CCR2、CCL2蛋白表達(dá)水平，降低p-NF-κBp65/NF-κBp65，p-p38MAPK/p38MAPK比值(P<0.01)，且與給藥劑量呈正相關(guān)。這一結(jié)果說明MD減少肺泡巨噬細(xì)胞活化，抑制肺泡巨噬細(xì)胞M1極化的機制與降低趨化因子CCR2、CCL2的表達(dá)，抑制NF-κB和p38MAPK信號通路的激活相關(guān)。

Fig 7 Changes of protein expression of CCR2， CCL2， p-NF-κBp65， NF-κBp65， p-p38MAPK， p38MAPK in lung tissues of rats in each group n=6)

3 討論

急性肺損傷的發(fā)病多由病毒、內(nèi)毒素等刺激免疫細(xì)胞在肺組織中募集并活化，產(chǎn)生炎性因子、細(xì)胞趨化因子、蛋白酶等，造成肺組織損傷，進而影響肺的呼吸功能[8]。LPS是革蘭陰性細(xì)菌外膜的主要成分，當(dāng)細(xì)菌入侵人體后，LPS與外膜分離，與免疫細(xì)胞的表面的模式識別受體結(jié)合，膜內(nèi)基團發(fā)生構(gòu)象變化，將信號轉(zhuǎn)到免疫細(xì)胞內(nèi)部。在細(xì)胞內(nèi)部，經(jīng)過一系列分子、蛋白的信號傳導(dǎo)，產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子可引起炎癥，導(dǎo)致多臟器損傷。因此，LPS是目前誘導(dǎo)ALI動物模型的常用誘導(dǎo)劑[9]。地塞米松屬于糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、抗內(nèi)毒素、抑制免疫、抗休克及增強應(yīng)激反應(yīng)等藥理作用，是目前ALI治療中的常用藥物之一，故為本次研究的陽性對照藥[10]。

課題組前期研究肺腸合治法治療ALI的作用機制時，發(fā)現(xiàn)體現(xiàn)肺腸合治的麻黃湯和大承氣湯聯(lián)合應(yīng)用具有顯著的抑制炎癥反應(yīng)，改善肺水腫的作用[11-12]。麻黃、大黃分別是麻黃湯和大承氣湯中的君藥，故本次研究選用MD藥對依照前期藥物劑量比3 ∶4來探索其對ALI大鼠的治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MD藥對及DXMS均可明顯改善ALI大鼠的肺組織損傷，抑制炎癥細(xì)胞浸潤，減少肺泡巨噬細(xì)胞活化，改善間質(zhì)水腫和肺組織結(jié)構(gòu)紊亂等病理狀態(tài)。

在人體防御和清除病原微生物的過程中，炎性趨化因子誘導(dǎo)免疫細(xì)胞向受損區(qū)域遷移，促進免疫細(xì)胞發(fā)揮其生物效應(yīng)。CCL2及其受體CCR2是吸引單核/巨噬細(xì)胞從血液、周圍組織到炎癥部位的關(guān)鍵趨化因子，研究表明，ALI肺組織中CCL2和CCR2表達(dá)增強，從而促進肺泡巨噬細(xì)胞向受損部位遷移[13]。巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)應(yīng)對外界刺激的第一道防線，在病原微生物的吞噬、抗原提呈等方面發(fā)揮著重要的作用，然而，過度活化的巨噬細(xì)胞在消滅入侵者的同時使肺組織遭受炎性損害。在ALI的發(fā)病過程中，肺泡巨噬細(xì)胞的浸潤和活化貫穿始終，其中以M1為主要活化表型[2]。與巨噬細(xì)胞M1極化相關(guān)的遺傳標(biāo)記包括IL-6、TOLL樣受體2、TOLL樣受體4、CD80和CD86等，CD80是常用的組織巨噬細(xì)胞M1極化標(biāo)記物，本次研究選用CD80為肺泡巨噬細(xì)胞M1極化標(biāo)記物[14]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MD和DXMS組大鼠肺組織CCL2、CCR2蛋白表達(dá)降低，肺組織肺泡巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80 和M1肺泡巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD80的表達(dá)和含量明顯降低。該結(jié)果提示MD藥對能夠抑制肺泡巨噬細(xì)胞向受損部位遷移，減少肺泡巨噬細(xì)胞活化和M1極化，從而降低肺組織炎細(xì)胞的浸潤。

NF-κB、p38MAPK信號通路是介導(dǎo)免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路，當(dāng)免疫細(xì)胞表面的模式識別受體識別到危險信號后，將信號傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部，最終活化NF-κB和p38MAPK，而磷酸化的NF-κB、p38MAPK可以穿過核膜，結(jié)合在染色體上的特定區(qū)域，使炎癥因子相關(guān)隱性基因得以表達(dá)，細(xì)胞核將過量TNF-α、INOS、IL-6等細(xì)胞因子釋放進入組織，導(dǎo)致組織損傷。ALI肺組織中，NF-κBp65、p38MAPK的表達(dá)均明顯上調(diào)，并激活其磷酸化，使p-NF-κBp65、p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯增強，磷酸化的NF-κBp65、p38MAPK進入細(xì)胞核，最終促使炎性因子TNF-α、INOS、IL-6釋放進入肺組織，導(dǎo)致組織損傷[15-16]。本文研究結(jié)果顯示，MD藥對能抑制炎癥因子TNF-α、INOS、IL-6的激活和釋放，且呈劑量依賴性，進一步的研究結(jié)果證實MD可降低NF-κBp65、p38MAPK蛋白的磷酸化，抑制NF-κBp65、p38MAPK信號通的路活化。

綜上，本文研究結(jié)果顯示，MD藥對可顯著改善ALI大鼠肺組織炎癥損傷，減少肺泡巨噬細(xì)胞的活化和M1極化，其機制與降低趨化因子CCL2和CCR2的表達(dá)，調(diào)控NF-κB、p38MAPK信號通路，抑制炎癥因子TNF-α、INOS、IL-6的釋放有關(guān)，這為深入探究MD藥對抑制炎癥反應(yīng)，治療ALI提供了實驗依據(jù)。