過氧化碳酰胺合成工藝的優(yōu)化

林新文，唐閃光，朱光冕，陳娜（.湖南省藥品審核查驗(yàn)中心，長沙 4000；.湖南一格制藥有限公司，湖南湘潭 400；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 400）

注射用過氧化碳酰胺是臨床上一種常用的靜脈給氧藥物[1]，由過氧化氫與尿素以氫鍵結(jié)合形成[2]。經(jīng)靜脈注射后，過氧化碳酰胺在體內(nèi)會(huì)先緩慢分解形成過氧化氫，在過氧化氫酶的作用下緩慢釋放出氧分子，從而改善機(jī)體缺氧情況[3]，可用于因缺氧所導(dǎo)致的多種急重癥的搶救與治療[4-6]。該產(chǎn)品自上市銷售以來，其安全性和有效性均獲得了廣大醫(yī)師和患者的認(rèn)同。隨著生產(chǎn)批次的積累，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品在貯存時(shí)穩(wěn)定性不佳，常出現(xiàn)炸瓶等不穩(wěn)定現(xiàn)象，而這都是由于過氧化碳酰胺原料本身不穩(wěn)定造成的，所以急需對過氧化碳酰胺原料工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提高其穩(wěn)定性，進(jìn)而提高其制劑的穩(wěn)定性。

研究發(fā)現(xiàn)金屬離子、光照、溫度等因素[7-8]，都會(huì)使過氧化碳酰胺分解，導(dǎo)致其pH和含量發(fā)生變化。螯合劑作為一種常用的藥用輔料[9]，可通過與金屬離子以配位鍵連接形成含金屬離子的雜環(huán)結(jié)構(gòu)，來減少金屬離子對于藥品的影響[10-12]。因此，可通過在制備過程中添加金屬離子螯合劑[13]和pH調(diào)節(jié)劑[14]來增加過氧化酰胺的穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏性能?；诖?，本研究以過氧化碳酰胺pH、含量和收率為指標(biāo)，pH調(diào)節(jié)劑種類和添加量、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）添加量為因素，對其處方進(jìn)行優(yōu)化；以溶解水浴溫度、析晶溫度、干燥溫度為因素，對其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化；采用長期穩(wěn)定性試驗(yàn)和加速穩(wěn)定性試驗(yàn)考察過氧化碳酰胺的穩(wěn)定性，可為過氧化碳酰胺原料生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DMH-2型對開門干燥滅菌烘箱（南京長興制藥機(jī)械有限公司）；876A型數(shù)顯真空干燥箱（上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠）；MA105DU型電子天平（精度：0.1 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司）；SSW-600-2S型恒溫水浴鍋（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；PHS-3C雷磁pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；Labonce-250GS藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（北京蘭貝石恒溫技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

尿素（批號(hào)：190305，湖南芙蓉制藥有限公司）；過氧化氫溶液（批號(hào)：191008、191009，成都明日制藥有限公司）；枸櫞酸（批號(hào)：100820170407）、乙二胺四乙酸二鈉（批號(hào)：102320190701）（湖南爾康制藥股份有限公司）；磷酸二氫鈉（批號(hào)：20210506，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 過氧化碳酰胺制備原有工藝

稱取126 g濃過氧化氫溶液（折合H2O2為34.01 g）以及60.06 g尿素于燒杯中（使過氧化氫與尿素的摩爾比為1∶1），35℃水浴加熱攪拌溶解后保溫5 min，使其充分反應(yīng)。將反應(yīng)后的溶液經(jīng)0.45 μm的聚丙烯濾膜過濾后進(jìn)行冷卻析晶，冷卻至0～4℃時(shí)開始計(jì)時(shí)，低溫靜置析晶12～24 h，傾去母液得結(jié)晶1，母液按照上述條件進(jìn)行第二次結(jié)晶，棄第二次結(jié)晶后母液得結(jié)晶2，將結(jié)晶1和結(jié)晶2混合置于真空干燥箱中，30℃左右真空干燥24～36 h，即得過氧化碳酰胺（合成工藝見圖1）。

圖1 原有合成工藝路線Fig 1 Original synthetic process route

2.2 過氧化碳酰胺優(yōu)化工藝

稱取126 g濃過氧化氫溶液（折合H2O2為34.01 g）于燒杯中，依次加入乙二胺四乙酸二鈉0.12 g和枸櫞酸0.82 g，攪拌均勻，向攪拌后的溶液中加入60.06 g的尿素（使過氧化氫與尿素的摩爾比為1∶1），30～40℃水浴加熱攪拌溶解后保溫5 min，使其充分反應(yīng)。將反應(yīng)后的溶液經(jīng)0.45 μm的聚丙烯濾膜過濾后進(jìn)行冷卻析晶，冷卻至－4℃開始計(jì)時(shí)，維持析晶料液－7～0℃低溫?cái)嚢栉鼍?0～12 h，析晶完成后，將母液收集按照上述條件進(jìn)行二次析晶，晶體轉(zhuǎn)入過濾器中，經(jīng)200～400目尼龍篩布過濾，得過氧化碳酰胺濕品。將過氧化碳酰胺濕品鋪盤置于真空干燥箱中，30～40℃下真空干燥24～36 h，即得過氧化碳酰胺（合成工藝見圖2）。

圖2 優(yōu)化的合成工藝路線Fig 2 Optimized synthetic process route

2.3 過氧化碳酰胺質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.3.1 過氧化碳酰胺pH測定 取樣品4.0 g精密稱定，加新沸過并放冷的超純水15 mL充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，制備成待測溶液，于25℃測pH值，測定3次，計(jì)算平均值。pH應(yīng)在3.2～3.7，確保產(chǎn)品符合質(zhì)控要求。

2.3.2 過氧化碳酰胺的含量測定 由于過氧化碳酰胺為過氧化氫和尿素的晶體加合物[15]，故本試驗(yàn)中過氧化碳酰胺的含量均以其中過氧化氫的含量來計(jì)算。取樣品0.1 g精密稱定，置于碘瓶中，加水25 mL與冰醋酸5 mL溶解后，加碘化鉀2 g，鉬酸銨試液1滴，遮光放置10 min，用0.1 mol·mL－1的硫代硫酸鈉滴定，至近終點(diǎn)時(shí)加淀粉指示液3 mL，繼續(xù)滴至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 mL硫代硫酸鈉滴定液（0.1 mol·mL－1）相當(dāng)于1.701 mg的過氧化氫。

2.3.3 過氧化碳酰胺收率的計(jì)算 過氧化碳酰胺合成基本反應(yīng)方程式如下：

H2O2＋CH4N2O → CH4N2O·H2O2

收率（%）＝60.06×m/94.07×M×100%

式中m為實(shí)際產(chǎn)量（g），M為尿素質(zhì)量（g）。

2.4 過氧化碳酰胺處方的優(yōu)化過程

2.4.1 pH調(diào)節(jié)劑的種類 稱取126 g濃過氧化氫溶液，0.18 g乙二胺四乙酸二鈉，60.06 g尿素，pH調(diào)節(jié)劑1.0 g，水浴溶解35℃保溫，－4℃低溫?cái)嚢栉鼍?，真空干燥溫?5℃，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，“2.3”項(xiàng)下方法測定評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同種類pH調(diào)節(jié)劑對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響。結(jié)果顯示，pH調(diào)節(jié)劑種類對過氧化碳酰胺pH有很大影響，當(dāng)選用磷酸二氫鈉＋磷酸或單獨(dú)的磷酸作為pH調(diào)節(jié)劑時(shí)，樣品pH較高，第一次結(jié)晶收率較低。當(dāng)選用枸櫞酸為pH調(diào)節(jié)劑時(shí)，樣品pH較低，第一次結(jié)晶收率較高。故選擇枸櫞酸作為pH調(diào)節(jié)劑。結(jié)果見表1。

表1 pH調(diào)節(jié)劑對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響Tab 1 Effect of pH regulator on pH、content and yield of urea peroxide

2.4.2 枸櫞酸的用量 稱取126 g濃過氧化氫溶液，0.18 g乙二胺四乙酸二鈉，60.06 g尿素，水浴保溫溫度35℃，冷卻攪拌析晶溫度－4℃，真空干燥溫度35℃，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.3”項(xiàng)下方法測定評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察枸櫞酸添加量（0.64、0.82、1.00、1.18、1.36 g）對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)枸櫞酸添加量為0.82 g和1.00 g時(shí)，過氧化碳酰胺含量和第一次結(jié)晶收率均較其他組高，而從添加外來物質(zhì)越少越好的角度考慮，本文選擇枸櫞酸添加量為0.82 g。結(jié)果見表2。

表2 枸櫞酸添加量對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響Tab 2 Effect of citric acid additive amount on pH、content and yield of urea peroxide

2.4.3 螯合劑的用量 稱取126 g濃過氧化氫溶液，0.82 g枸櫞酸，60.06 g尿素，水浴保溫溫度35℃，冷卻析晶溫度－4℃，真空干燥溫度35℃，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.3”項(xiàng)下方法測定評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同乙二胺四乙酸二鈉添加量（0.12、0.15、0.18、0.21、0.24 g）對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響。結(jié)果顯示，隨著乙二胺四乙酸二鈉添加量的增加，過氧化碳酰胺第一次結(jié)晶后，含量呈下降趨勢，且添加量為0.12 g時(shí)結(jié)晶收率最高，綜合試驗(yàn)結(jié)果和成本考量，后續(xù)工藝選擇最小添加量0.12 g。

2.5 過氧化碳酰胺制備工藝的優(yōu)化過程

2.5.1 水浴溫度 稱取126 g濃過氧化氫溶液，按“2.4”項(xiàng)下最優(yōu)處方，固定冷卻析晶溫度－4℃，真空干燥溫度35℃，按“2.2”項(xiàng)下方法制備（由于二次結(jié)晶收率較低，且結(jié)晶時(shí)間較長，故后續(xù)工藝均不再進(jìn)行二次結(jié)晶），考察不同水浴溫度（25、30、35、40、45℃）時(shí)尿素的溶解時(shí)間和溶解情況，結(jié)果見表4。結(jié)合溶解時(shí)間和溶解情況，后續(xù)工藝選擇30～40℃作為最佳水浴溫度。

表4 水浴溫度對過氧化碳酰胺溶解反應(yīng)的影響Tab 4 Effect of water bath temperature on dissolution reaction of urea peroxide

表3 螯合劑添加量對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響Tab 3 Effect of chelating agentadditive amount on pH，content and yield of urea peroxide

2.5.2 析晶溫度 稱取126 g濃過氧化氫溶液，按“2.4”項(xiàng)下最優(yōu)處方，固定水浴保溫溫度35℃，真空干燥溫度35℃，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.3”項(xiàng)下方法測定，考察不同析晶溫度（0～4℃、－4～0℃、－8～－4℃、－12～－8℃）對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)析晶溫度在4～－8℃時(shí)，可以析出細(xì)膩的結(jié)晶顆粒；隨著溫度降低，過氧化碳酰胺含量基本不變，收率呈逐步升高的趨勢；當(dāng)析晶溫度為－12～－8℃時(shí)，液面出現(xiàn)結(jié)冰情況，不能進(jìn)行攪拌；故后續(xù)工藝選擇0～－7℃為最佳析晶溫度。結(jié)果見表5。

表5 析晶溫度對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響Tab 5 Effect of crystallization temperature on pH，content and yield of urea peroxide

2.5.3 真空干燥溫度 稱取126 g濃過氧化氫溶液，按“2.4”“2.5”項(xiàng)下優(yōu)化結(jié)果，固定水浴溫度35℃，析晶溫度0～－7℃，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.3”項(xiàng)下方法測定，考察不同真空干燥溫度（30、35、40、45℃）對過氧化碳酰胺pH和含量的影響。結(jié)果顯示，隨著干燥溫度升高，干燥24 h的干燥失重和干燥36 h的干燥失重都呈逐步降低的趨勢，但在30～40℃溫度區(qū)間內(nèi)，干燥溫度對過氧化碳酰胺pH變化無影響，且在35℃時(shí)過氧化碳酰胺含量最大。故后續(xù)工藝選擇30～40℃為最佳真空干燥溫度。

表6 真空干燥溫度對過氧化碳酰胺pH和含量的影響Tab 6 Effect of vacuum drying temperature on pH and content of urea peroxide

2.5.4 結(jié)晶次數(shù)確認(rèn) 原工藝采用了母液兩次結(jié)晶合并后再真空干燥的工藝。此工藝可以小幅提高產(chǎn)品的收率，但是一次結(jié)晶收得的濕品，需等與母液再次過夜重結(jié)晶的濕品合并才能進(jìn)入真空干燥工序，一次結(jié)晶濕品的暫存時(shí)間偏長，不利于生產(chǎn)效率的提高。同時(shí)根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，第二次的結(jié)晶收率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于第一次的結(jié)晶收率，且第二次收得量很小，經(jīng)權(quán)衡利弊，可將原兩次結(jié)晶的工藝改為一次結(jié)晶的工藝，一次結(jié)晶后的濕品直接進(jìn)入真空干燥工序，結(jié)晶母液棄去不用。

2.6 最佳處方及制備工藝的驗(yàn)證

稱取126 g濃過氧化氫溶液，按“2.4”“2.5”項(xiàng)下最優(yōu)處方及制備工藝制備過氧化碳酰胺。按“2.3”項(xiàng)下方法測定評(píng)價(jià)指標(biāo)。每份樣品平行操作3次，取平均值。結(jié)果顯示，優(yōu)化的處方和工藝制備的過氧化酰胺其pH、含量和收率均優(yōu)于原工藝處方，這表明新處方及制備工藝下生產(chǎn)的過氧化碳酰胺較原工藝穩(wěn)定，能獲得更高的收率，符合產(chǎn)業(yè)化要求。結(jié)果見表7。

表7 優(yōu)化的及原處方和工藝的驗(yàn)證結(jié)果Tab 7 Verification of optimal and original formulation and preparation technology

2.7 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7.1 長期穩(wěn)定性試驗(yàn)方法 按“2.4”“2.5”項(xiàng)下最優(yōu)處方及制備工藝制得過氧化碳酰胺原料。按照2020年版《中國藥典》四部中“原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”[16]，對于溫度特別敏感的藥物，長期試驗(yàn)可在溫度（5±3）℃條件下進(jìn)行。取適量樣品，以市售包裝，（5±3）℃條件下放置6個(gè)月，分別在第0、3、6、9、12個(gè)月時(shí)取樣，按照2020年版《中國藥典》四部“原料藥物及制劑穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目”，考察其性狀、pH、溶液的澄清度、干燥失重和含量。結(jié)果顯示，過氧化碳酰胺性狀均為白色結(jié)晶狀，溶液呈澄清無色，其pH、干燥失重和含量與第0月相比均變化不大，表明其穩(wěn)定，符合產(chǎn)品生產(chǎn)需求。結(jié)果見表8。

表8 長期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 8 Long-term stability test results

2.7.2 加速穩(wěn)定性試驗(yàn)方法 按“2.4”“2.5”項(xiàng)下最優(yōu)處方及制備工藝制得過氧化碳酰胺。按照2020年版《中國藥典》四部中“原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”[16]，對溫度特別敏感的藥物，預(yù)計(jì)只能在冰箱（5±3）℃內(nèi)保存使用，此類藥物的加速試驗(yàn)，可在溫度為（25±2）℃，相對濕度為（60±5）%的條件下進(jìn)行。取適量樣品，以市售包裝，于溫度為（25±2）℃，相對濕度為（60±5）%的條件下放置6個(gè)月，分別在第0、1、2、3、6個(gè)月時(shí)取樣，按照2020年版《中國藥典》四部“原料藥物及制劑穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目”，考察其性狀、pH、溶液的澄清度、干燥失重和含量。結(jié)果顯示，過氧化碳酰胺性狀均為白色結(jié)晶狀，溶液呈澄清無色，其pH、干燥失重和含量與第0月相比均變化不大，表明其穩(wěn)定，符合產(chǎn)品生產(chǎn)需求。結(jié)果見表9。

表9 加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 9 Accelerated stability test results

3 討論

3.1 pH調(diào)節(jié)劑的選擇

過氧化氫作為一種極弱酸（Ka＝2.4×10－12），在自然狀態(tài)下極不穩(wěn)定，存在典型的自加速分解過程[17]。孫峰等[18]研究發(fā)現(xiàn)，隨著過氧化氫的pH值增加，反應(yīng)起始放熱溫度降低，熱失控危險(xiǎn)性明顯增加，當(dāng)pH值增至7以上時(shí)，儲(chǔ)存的過氧化氫極不穩(wěn)定，極易發(fā)生熱失控。故過氧化碳酰胺儲(chǔ)存過程中pH值的穩(wěn)定，對過氧化碳酰胺的儲(chǔ)存性能有較大的影響。本研究通過單因素試驗(yàn)探究了不同pH調(diào)節(jié)劑及其最佳添加量。結(jié)果表明枸櫞酸對產(chǎn)品pH具有較好的調(diào)節(jié)性，作為一種天然小分子有機(jī)酸，具有無毒無害，水中溶解性能好的優(yōu)點(diǎn)[19]，且可與二、三價(jià)金屬離子進(jìn)行螯合[20]，提高過氧化碳酰胺的穩(wěn)定性，因此本研究以枸櫞酸作為pH調(diào)節(jié)劑。

3.2 螯合劑的選擇

乙二胺四乙酸二鈉作為藥物中常用的金屬離子螯合劑，具有廣泛的配位性能[21]，對照品中的靶金屬具有很高的螯合效率[22]，幾乎與所有過渡金屬都能生成水溶性好且穩(wěn)定的螯合物，能有效防止藥物被金屬離子催化氧化[23]，增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性，且在高溫條件下依然穩(wěn)定[24]。故本研究選擇乙二胺四乙酸二鈉作為金屬離子螯合劑。

3.3 水浴溫度的選擇

基于過氧化碳酰胺制備處方的改變，本研究探討了在新處方下，過氧化碳酰胺制備的最佳工藝。結(jié)果表明在25～40℃，隨著溫度升高，尿素的溶解時(shí)間不斷減少，當(dāng)溫度達(dá)到30℃時(shí)，尿素已完全溶解；當(dāng)溫度達(dá)到45℃時(shí)，樣品表面產(chǎn)生汽泡。這是由于溫度升高有利于尿素溶解和合成反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而提高過氧化碳酰胺的收率，但溫度過高會(huì)導(dǎo)致過氧化氫和過氧化碳酰胺分解[25]，因此選擇30～40℃作為最佳反應(yīng)溫度。

3.4 真空干燥溫度的選擇

此外，本研究還探討了真空干燥溫度對產(chǎn)品干燥失重、pH和含量的影響。結(jié)果表明，在30～40℃，隨著溫度的升高產(chǎn)品真空干燥的失重減少，當(dāng)溫度達(dá)到40℃、干燥時(shí)間36 h時(shí)，產(chǎn)品失重只有0.2%，說明此時(shí)已基本去除產(chǎn)品中的水分和揮發(fā)性物質(zhì)；且pH為3.6符合產(chǎn)品質(zhì)控要求。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，產(chǎn)品干燥36 h的失重未再減少，但產(chǎn)品的pH升高，含量降低，說明此溫度下，過氧化碳酰胺已分解，不適宜進(jìn)行真空干燥。綜合試驗(yàn)結(jié)果與能耗考量，選擇30～40℃作為真空干燥溫度。

本研究通過單因素試驗(yàn)探討了過氧化碳酰胺制備的最佳處方及其工藝條件，穩(wěn)定性試驗(yàn)表明新處方及工藝下所生產(chǎn)的產(chǎn)品均符合質(zhì)控要求，穩(wěn)定性好，可為過氧化碳酰胺原料生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。