人源化實驗動物模型在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用及質(zhì)量控制

張妙紅，曾貴榮，姜德建，3*（1.湖南省實驗動物中心，長沙 410331；2.新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室，長沙 410331；3.腫瘤模型與個體化診治湖南省重點實驗室，長沙 410011）

人源化實驗動物模型是將來自于人的基因、細(xì)胞或組織針對性導(dǎo)入到實驗動物體內(nèi)，使其獲得與人類更為接近的生理病理特征[1]。人源化實驗動物模型可用于人感染性疾病的發(fā)病機制、病理過程的研究等，可作為非人靈長類動物的替代動物模型，在腫瘤精準(zhǔn)治療、藥物研發(fā)、抗體開發(fā)等生物醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價值。但目前人源化實驗動物模型缺乏規(guī)范的制備程序和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致其臨床表型和對藥物反應(yīng)不盡相同，極大地限制了其在生物醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，對人源化實驗動物模型質(zhì)量進行系統(tǒng)研究，加強其標(biāo)準(zhǔn)化和一致性，將有助于推動其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 人源化實驗動物模型的分類

人源化實驗動物模型根據(jù)構(gòu)建方式不同可分為兩大類：基因型動物模型和移植型動物模型。

1.1 基因型人源化實驗動物模型

基因人源化實驗動物模型是將人基因插入或替代至模型動物基因中，進而產(chǎn)生人基因嵌合動物模型。基因人源化動物模型體內(nèi)表達部分人類蛋白，能模擬體內(nèi)蛋白反應(yīng)或者細(xì)胞信號傳導(dǎo)[2]。

1.2 移植型人源化實驗動物模型

移植型人源化實驗動物模型是將人（腫瘤）細(xì)胞或人（腫瘤）組織異種移植至實驗動物體內(nèi)，繼而在動物體內(nèi)生長。與傳統(tǒng)的人惡性腫瘤細(xì)胞系來源的異種移植（cell line-derived xenograft，CDX）比較，患者腫瘤組織來源的異種移植（patient-derived xenograft，PDX）能較好地保留患者腫瘤的基因和表型特性，克服了腫瘤細(xì)胞系因長期體外培養(yǎng)缺乏正常的細(xì)胞基質(zhì)和腫瘤微環(huán)境進而導(dǎo)致同質(zhì)化改變的缺點，具有更廣泛的應(yīng)用價值[3-5]。

由于異種移植免疫排斥反應(yīng)難以避免，移植型人源化實驗動物模型須提前進行免疫抑制或者采用免疫缺陷動物。將人造血干細(xì)胞（hematopoieticstem cells，HSCs）移植至采用低劑量X線全身照射等方法清理骨髓的重度免疫缺陷小鼠，然后再將患者的腫瘤組織移植于該動物建立人源化腫瘤模型（humanized patient-derived xenograft，Hu-PDX）[6]。因人HSCs在小鼠體內(nèi)可以產(chǎn)生各種免疫細(xì)胞，使腫瘤生長微環(huán)境與人體更相似，可更好地保留原發(fā)腫瘤的異質(zhì)性。

2 人源化實驗動物模型在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 基因修飾型人源化動物模型的應(yīng)用

2.1.1 在人源化抗體制備中的應(yīng)用 利用轉(zhuǎn)基因小鼠可實現(xiàn)在小鼠體內(nèi)制備人源化抗體，達到生產(chǎn)治療性抗體。與體外生產(chǎn)人源化抗體技術(shù)比較，通過小鼠體內(nèi)直接生產(chǎn)的人源化抗體因經(jīng)過體內(nèi)自然篩選過程，無論在親和力、抗體形成的后加工修飾等方面都具有明顯的應(yīng)用優(yōu)勢[7]。如美國Regeneron制藥公司研發(fā)獲得的Veloclmmune小鼠，基于該技術(shù)平臺已獲得包括抗IL-4受體抗體、抑制IL-4和IL-13信號通路以及抗IL-6受體抗體4個人源抗體藥物。2017年獲批的抗IL-6受體抗體，通過抑制IL-6信號通路，降低肝細(xì)胞釋放炎癥相關(guān)因子，實現(xiàn)治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病作用。

2.1.2 在抗體藥物評價中的應(yīng)用 對于腫瘤免疫（CAR-T/Checkpoint），其作用方式是調(diào)動自體免疫進行殺傷，故需要有一種模型在臨床前階段模擬人體內(nèi)的免疫環(huán)境。通過基因修飾將小鼠細(xì)胞跨膜蛋白膜外部分進行人源化改造，從而結(jié)合基于人蛋白結(jié)構(gòu)開發(fā)的抗體藥物，可以保留細(xì)胞內(nèi)鼠源的信號通路，激活相關(guān)的免疫反應(yīng)。在抗體藥物的體內(nèi)藥效學(xué)研究與非臨床安全性評價具有廣泛的應(yīng)用價值[8-9]。如采用小鼠T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤細(xì)胞系EL4，在轉(zhuǎn)基因的PD-1人源化小鼠中建立腫瘤細(xì)胞系移植模型，用于人源化PD-1單抗聯(lián)合組蛋白去乙?；敢种苿┝_米地辛治療T細(xì)胞淋巴瘤的臨床前研究[10]。通過對免疫檢查點相關(guān)的小鼠基因（如CTLA4和PD1等）進行人源化修飾，構(gòu)建能與抗CTLA4和PD1人源化抗體相互作用的人源化小鼠，可為這類抗體藥物的臨床前篩選與評估提供有效的工具。

2.1.3 在人感染性疾病模型建立中的應(yīng)用 乙肝病毒、人類免疫缺陷病毒等在宿主選擇上具有嚴(yán)苛的人細(xì)胞嗜性，因缺乏合適的感染動物模型，嚴(yán)重限制了對其致病機制的研究和抗病毒藥物及疫苗的篩選進展。人肝嵌合小鼠和重建人免疫系統(tǒng)小鼠則分別突破了這兩種病毒的感染限制[9]，為模擬這些病原體自然感染人的過程和產(chǎn)生的病理生理改變、新型疫苗的開發(fā)和治療方法的發(fā)展提供了重要研究手段。

2.1.4 在Hu-PDX模型中的應(yīng)用 在NOG/NSG等免疫缺陷小鼠的基礎(chǔ)上，導(dǎo)入與髓系類細(xì)胞發(fā)育成熟相關(guān)的人細(xì)胞因子，如IL-3、GM-CSF，具有明顯增加移植HSCs在小鼠體內(nèi)的成熟，提高Hu-PDX模型的成瘤效率[11]。

2.1.5 在藥物代謝特征研究中的應(yīng)用 在基因修飾型人源化模型的研制領(lǐng)域中，已經(jīng)成功建立了包括針對外源生物質(zhì)受體[如芳香烴受體（AHR）、組成雄烷受體（CAR）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARa）和孕烷X受體（PXR）等]，針對細(xì)胞色素P450（CYP）家族成員的[如CYP2A6、CYP2C9、CYP2C18/2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A7]以及針對UDP 葡糖醛酸基轉(zhuǎn)運酶（UGT）、2B7和NAT轉(zhuǎn)運酶2等。與野生型小鼠相比，CYP450基因修飾型人源化模型在藥物體內(nèi)代謝與安全評價方面，更能準(zhǔn)確反映人代謝產(chǎn)物的實際狀況[12]。

2.2 PDX模型在腫瘤研究中的應(yīng)用

2.2.1 腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究 PDX模型經(jīng)驗證能夠保留原發(fā)腫瘤的特性，精準(zhǔn)模擬腫瘤生長、腫瘤多樣性、腫瘤進展及轉(zhuǎn)移潛能等特性[13]。有研究顯示，具有不同預(yù)后和亞型的腫瘤建立PDX模型仍然會保持原有分型，利用PDX模型進行敏感型和抗藥型模型之間的蛋白組學(xué)或遺傳學(xué)比較，可以識別出預(yù)后生物標(biāo)志物，從而進一步進行臨床精準(zhǔn)治療[14]。此外，PDX模型還可用于解決許多臨床相關(guān)問題，包括預(yù)測臨床預(yù)后、臨床前藥物評估、生物學(xué)研究、腫瘤異質(zhì)性對治療反應(yīng)的影響、腫瘤進展過程中和在治療壓力下腫瘤動態(tài)進化模式以及對治療耐受的機制研究。

2.2.2 抗腫瘤藥物研發(fā) 通過建立特定基因型或蛋白表型的PDX小鼠模型，可針對性地篩選和開發(fā)相應(yīng)靶點的先導(dǎo)化合物，大大促進新型抗腫瘤藥物的研發(fā)。有研究者在使用重建人免疫系統(tǒng)（HIS）動物建立PDX，構(gòu)建了重建 HIS＋PDX動物模型，是目前最接近臨床腫瘤患者情況的模型，可用于抗腫瘤藥物臨床前的藥效和毒理實驗，為免疫毒性的評價提供更多信息，推動抗腫瘤藥物的研發(fā)。

3 人源化實驗動物模型的質(zhì)量控制

3.1 影響動物模型質(zhì)量的因素

3.1.1 缺乏統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范 人源化實驗動物的使用目前大多仍停留在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，尚未在臨床個體化診療與新藥臨床前研究等生物醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域廣泛使用，主要原因與其質(zhì)量保障體系缺乏系統(tǒng)研究，供應(yīng)鏈上生產(chǎn)、飼養(yǎng)和應(yīng)用等多環(huán)節(jié)相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范不完善有關(guān)。因此，建立人源化動物關(guān)鍵共性技術(shù)規(guī)范，動物質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)以及在藥物研究中如何選擇合適動物的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，將有助于推動人源化動物在生物藥非臨床藥效與安全性評價中的廣泛應(yīng)用。

3.1.2 模型制備問題 人源化實驗動物模型在腫瘤研究領(lǐng)域取得了重要進展，但仍存在一定局限性，主要表現(xiàn)在：

① 制備周期長，植入率低，成本高；

② 移植到免疫缺陷小鼠中的人類腫瘤基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)有可能被小鼠組織所替代；

③ 潛在的淋巴瘤轉(zhuǎn)移：如果供體患者有EB病毒感染史，PDX的植入可在宿主小鼠中引起淋巴瘤，但不會引起預(yù)期的腫瘤；

④ 腫瘤組織異質(zhì)性問題：一開始有效的藥物，易產(chǎn)生耐藥性。

3.1.3 飼養(yǎng)環(huán)境問題 人源化動物是免疫缺陷動物基礎(chǔ)上再復(fù)合了疾病，對飼養(yǎng)環(huán)境要求高。國內(nèi)外尚無對飼養(yǎng)環(huán)境參數(shù)以及對人源化動物質(zhì)量影響的研究。

3.2 亟待解決的質(zhì)量控制問題

3.2.1 基因修飾型人源化實驗動物模型 基因修飾型人源化小鼠模型在生物學(xué)特性上的差異導(dǎo)致其在藥物開發(fā)中的應(yīng)用受到限制，需要從以下幾個方面解決一致性和穩(wěn)定性問題：

① 導(dǎo)入人源基因的技術(shù)方法：目前導(dǎo)入人源基因的主要方法有原核注射、利用小鼠ES細(xì)胞系進行傳統(tǒng)基因打靶、采用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，以及在此基礎(chǔ)上的技術(shù)改進。通過不同技術(shù)制備的相同基因型人源化小鼠模型可能存在表型和生物學(xué)特性以及對藥物的反應(yīng)不盡相同。

② 小鼠免疫缺陷程度：目前常用的人源化免疫缺陷小鼠有SCID、NOD/SCID以及在此基礎(chǔ)上敲除IL2rg基因開發(fā)的極重度免疫小鼠（NOD/SCID IL2Rg－/－），這些小鼠在T和B細(xì)胞功能恢復(fù)、NK細(xì)胞活性上均不一致。

③ 基因敲除策略：IL-2Rγ鏈的缺失會導(dǎo)致T細(xì)胞、B細(xì)胞發(fā)育和功能嚴(yán)重受損，并完全阻止了NK細(xì)胞的發(fā)育。因此，在NOD/scid背景下通過引入IL2rg突變后就可以形成T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞三種細(xì)胞同時功能缺失的小鼠。日本東京大學(xué)和美國Jackson實驗室先后培育了NOG、NSG和NRG等極重度免疫缺陷小鼠[15]。NOG是在NOD/Shi-scid小鼠導(dǎo)入了一個截短的IL2rg基因（缺乏胞內(nèi)段，可以結(jié)合細(xì)胞因子，但不能傳遞信號），NSG是在NOD/Lt-scid小鼠導(dǎo)入一個完全刪除的IL2rg基因。國內(nèi)李鵬教授研究團隊也成功構(gòu)建了基于IL2rg不同突變體敲除的NSI品系[16]。這些極重度免疫缺陷小鼠盡管在免疫學(xué)狀態(tài)上高度相近，但是在體質(zhì)量、臍帶血移植能力等生物學(xué)特性上有差異。此外，人源化動物自身的殘余肝細(xì)胞對藥物代謝的背景影響，易引起腫瘤的發(fā)生，穩(wěn)定性差，從而導(dǎo)致其在新藥篩選和安全性評價中的應(yīng)用受到限制。

3.2.2 移植型人源化實驗動物模型 目前PDX在臨床腫瘤個體化診療中尚未廣泛使用，除了模型制備周期長、植入率低、成本高等因素以外，由于腫瘤組織存在異質(zhì)性和模型制備尚無統(tǒng)一的技術(shù)規(guī)范密切相關(guān)。PDX模型需要在以下幾個方面考慮一致性和穩(wěn)定性問題：

① 人源一致性：臨床患者腫瘤組織與人源化動物模型之間病理學(xué)、分子生物學(xué)、基因特征的一致性；② 同批次一致性：同一批次人源化動物個體之間病理學(xué)、分子生物學(xué)、基因特征的一致性；③ 傳代一致性：不同傳代數(shù)模型之間及不同代數(shù)模型之間病理學(xué)、分子生物學(xué)、基因特征的一致性；④ 多重穩(wěn)定性：臨床患者腫瘤組織不同傳代數(shù)模型之間及不同代數(shù)模型之間病理學(xué)、分子生物學(xué)、基因特征的一致性。

因此，完善PDX實驗動物模型構(gòu)建的技術(shù)規(guī)范和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是促進PDX模型在臨床前研究中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵手段。

4 結(jié)語

人源化實驗動物模型具有與人更為接近的生理病理特征，在腫瘤精準(zhǔn)治療、藥物研發(fā)、抗體開發(fā)等生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用具有一定的優(yōu)勢。進一步加強對人源化實驗動物模型質(zhì)量的研究將有助于推動其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。