葛根素調(diào)控miR-30e-5p緩解高糖所致的足細胞損傷*

梅蘭，郭陽，張寧，傅盼盼，孫國鈞

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平院區(qū)，遼寧 沈陽 110000； 2.大連市友誼醫(yī)院，遼寧 大連 116000

糖尿病腎病是糖尿病常見并發(fā)癥之一，其發(fā)病率逐年上升，已嚴重影響患者生活質(zhì)量，隨著疾病進展糖尿病腎病最終發(fā)展為終末期腎病。然而，糖尿病腎病的發(fā)病機制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，足細胞損傷可引起糖尿病腎病的發(fā)生，而足細胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等均可誘導(dǎo)足細胞損傷[1]。目前，臨床尚缺乏防治足細胞損傷的方法，既往研究顯示，中醫(yī)藥在抗氧化、抗炎及腎臟保護方面具有獨特的優(yōu)勢[2-3]。葛根素為中藥葛根的主要成分，具有降血糖等作用，還可通過調(diào)控尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(recombinant nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)的表達抑制糖尿病腎病的發(fā)展進程[4]，但關(guān)于葛根素治療糖尿病腎病的分子機制尚未完全闡明。微小RNA(miRNA，miR)在糖尿病腎病發(fā)病機制中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其可通過調(diào)控靶mRNA的表達參與足細胞損傷過程[5]。研究表明，miR-30e-5p在糖尿病腎病患者中表達水平降低，并可能參與糖尿病腎病的發(fā)生過程[6]?；诖?，本研究采用高糖誘導(dǎo)小鼠腎足細胞MPC5建立足細胞損傷模型，探討葛根素能否通過調(diào)控miR-30e-5p的表達抑制高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷，并初步探究其可能的作用機制。

1 材料

1.1 細胞小鼠腎足細胞MPC5購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司(貨號：LHY2125)。

1.2 藥物與試劑葛根素(純度≥98%，美國Sigma公司，批號：20190203)；葡萄糖(北京酷來搏科技有限公司，批號：20190105)；Lipofectamine2000(南京信帆生物技術(shù)有限公司，批號：20190106)；Trizol試劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：20190207)；miRcute 增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、Quant one step RT-qPCR 試劑盒(SYBR Green)(北京天根生化科技有限公司，批號：20190211、20181223)；細胞凋亡檢測試劑盒(北京博邁斯科技發(fā)展有限公司，批號：20181215)；兔抗鼠半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific protease-3，caspase-3)抗體、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體、B淋巴細胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)抗體(美國Santa Cruz公司，批號：20190108、20190122、20190116)；兔抗鼠p62抗體、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ(microtubule-associated protein l light chain 3，LC3-Ⅱ)抗體、LC3-Ⅰ抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(美國CST公司，批號：20190124、20190201、2019021、120190119)；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司，批號：20190203)；miR-30e-5p寡核苷酸模擬物(miR-30e-5pmimics)及陰性對照序列(miR-NC)、miR-30e-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-30e-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)(廣州銳博生物科技有限公司，批號：20190132、20190136、20190096、20190138)；miR-30e-5p引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。

1.3 儀器FACS Calibur型流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；DYY-7C型電泳儀電源、DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYY-12型電泳儀(北京六一儀器廠)；JY02S型紫外分析儀、JY-SPCT型水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；Nano-100型微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)；mμlISKANMK3型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；HI650型離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

2 方法

2.1 分組與干預(yù)MPC5細胞常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)整細胞密度為3×105mL-1，接種于96孔板，每孔 100 μL，分為對照組、模型組、低劑量葛根素組、中劑量葛根素組及高劑量葛根素組。對照組加入含有濃度為5.5 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)液，模型組加入含有濃度為30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)液[7]，低、中、高劑量葛根素組分別加入含有30 mmol·L-1葡萄糖及不同劑量(1 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1)葛根素[8]的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后進行指標檢測。miR-NC、miR-30e-5pmimics轉(zhuǎn)染至MPC5細胞后，加入含有濃度為30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記作miR-NC組、miR-30e-5p組。anti-miR-NC、anti-miR-30e-5p轉(zhuǎn)染至MPC5細胞，分別加入含有10 μmol·L-1葛根素與30 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記作高劑量葛根素+anti-miR-NC組、高劑量葛根素+anti-miR-30e-5p組。

2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率取各組MPC5細胞加入預(yù)冷PBS洗滌，棄上清，加入500 μL緩沖液重懸細胞，參照細胞凋亡檢測試劑盒說明書分別加入Annexin V-FITC與PI，應(yīng)用FACS Calibur流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

2.3 RT-qPCR檢測MPC5細胞中miR-30e-5p的表達水平采用Trizol法提取各組MPC5細胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNA 2 μg，RNase-Free ddH2O補足體系至20 μL；反應(yīng)條件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。RT-qPCR擴增，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μL，應(yīng)用熒光定量PCR儀檢測miR-30e-5p相對表達量。miR-30e-5p正向引物序列：5′-GGGTGTAAACATCCTTGAC-3′，反向引物序列：5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6正向引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2.4 Western Blot檢測caspase-3、Bax、Bcl-2、p62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的蛋白表達量提取各組MPC5細胞總蛋白進行定量，蛋白變性后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(vinylidene fluoride，PVDF)膜，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗孵育(稀釋11 000)24 h，孵育二抗(稀釋比例13 000) 1 h，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值，并計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。

3 結(jié)果

3.1 葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞凋亡的影響與對照組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中劑量葛根素組、高劑量葛根素組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與中劑量葛根素組比較，高劑量葛根素組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞凋亡的影響

注：A：細胞凋亡流式圖；B：凋亡相關(guān)蛋白表達圖圖1 葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞凋亡的影響

3.2 葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞自噬的影響與對照組比較，模型組p62蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中劑量葛根素組、高劑量葛根素組p62蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)；與中劑量葛根素組比較，高劑量葛根素組p62蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞自噬的影響

3.3 葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞中miR-30e-5p表達的影響與對照組比較，模型組miR-30e-5p的表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中劑量葛根素組、高劑量葛根素組miR-30e-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)；與中劑量葛根素組比較，高劑量葛根素組miR-30e-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3。

表2 葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞自噬的影響

表3 葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞中miR-30e-5p表達的影響

3.4 過表達miR-30e-5p對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞凋亡及自噬的影響與miR-NC組比較，miR-30e-5p組細胞凋亡率及caspase-3、Bax、p62蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)。見圖3，表4。

注：A：細胞凋亡流式圖；B：凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達圖圖3 過表達miR-30e-5p對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞凋亡及自噬的影響

表4 過表達miR-30e-5p對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞凋亡及自噬的影響

3.5 干擾miR-30e-5p的表達能逆轉(zhuǎn)葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞凋亡及自噬的影響與高劑量葛根素+anti-miR-NC組比較，高劑量葛根素+anti-miR-30e-5p組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，caspase-3、Bax、p62蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(P<0.05)。見圖4、表5。

注：A：細胞凋亡流式圖；B：凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達圖圖4 干擾miR-30e-5p能逆轉(zhuǎn)葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞凋亡及自噬的影響

表5 干擾miR-30e-5p能逆轉(zhuǎn)葛根素對高糖誘導(dǎo)的MPC5細胞凋亡及自噬的影響

4 討論

糖尿病腎病是引發(fā)終末期腎病的重要原因之一，目前臨床尚缺乏防治糖尿病腎病進展的有效措施[9-11]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥可通過減輕足細胞損傷對糖尿病腎病的防治發(fā)揮作用[12-16]，也可通過調(diào)控多種基因或信號通路表達減緩糖尿病腎病的發(fā)展進程[17-20]。因而，積極探尋新型糖尿病腎病的治療藥物并探究其可能作用機制，成為防治糖尿病腎病的新方向。

葛根素是葛根的主要成分，具有改善心腦血管循環(huán)、抑制心肌細胞凋亡等作用，可通過抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路抑制缺血再灌注所致的心肌細胞凋亡[21]，還可通過抑制線粒體解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)的表達保護2型糖尿病大鼠胰腺β細胞[22]，通過上調(diào)miR-155-3p的表達抑制髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)的表達從而減輕血管內(nèi)皮小細胞損傷[23]。本研究結(jié)果顯示，高糖處理后，足細胞凋亡率明顯提高，與相關(guān)文獻報道結(jié)果一致[24]，提示高糖誘導(dǎo)可成功建立足細胞損傷模型。使用不同劑量的葛根素處理后，高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡率明顯降低，caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，且呈劑量依賴性，提示葛根素可抑制高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡從而減輕細胞損傷。自噬與細胞凋亡密切相關(guān)，自噬的主要過程為細胞將自身胞質(zhì)內(nèi)蛋白或細胞器包被后與溶酶體形成自噬小體進而降解細胞，自噬發(fā)生時LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，p62與LC3偶聯(lián)從而參與自噬過程[25]。本研究結(jié)果顯示，高糖處理足細胞后可明顯提高p62蛋白表達水平，降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，而葛根素可明顯降低p62的表達水平，提高 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，且呈劑量依賴性，提示葛根素可能通過誘導(dǎo)細胞自噬而調(diào)控細胞凋亡。

研究表明，miR-30e-5p可減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡[26]。miR-30e-5p通過調(diào)控去整合素-金屬蛋白酶9(disintegrin-metalloproteinase 9，ADAM9)抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌細胞肥大[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的足細胞中miR-30e-5p的表達水平降低，而葛根素可明顯提高miR-30e-5p的表達水平，提示葛根素可能通過促進miR-30e-5p的表達減輕高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷。本研究進一步分析顯示，miR-30e-5p過表達可明顯降低高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡率，抑制caspase-3、Bax、p62的表達，促進Bcl-2的表達，并可提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，提示miR-30e-5p過表達可抑制高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡從而減輕足細胞損傷。

綜上所述，葛根素可通過上調(diào)miR-30e-5p的表達抑制高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡從而減輕細胞損傷，其作用機制可能與誘導(dǎo)細胞自噬有關(guān)，為進一步揭示葛根素治療糖尿病腎病的分子機制奠定實驗基礎(chǔ)。